＊祁桂玲 王學(xué)偉 王佳穎

（1.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北 050000 2.河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 051530 3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 河北 071001）

多殺菌素是土壤放線菌刺糖多孢菌經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，屬大環(huán)內(nèi)酯類化合物。多殺菌素對靶標(biāo)昆蟲具有獨(dú)特的快速觸殺和攝食毒性，可以有效防治小菜蛾、甜菜夜蛾等多種鱗翅目害蟲，而對哺乳類、鳥類等幾乎沒有毒性，相比于其它殺蟲農(nóng)藥，多殺菌素兼具化學(xué)農(nóng)藥的快效性和生物農(nóng)藥的安全性，具有低殘留、快速降解等優(yōu)點(diǎn)，先后在1999年、2008年、2010年三次獲得“總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”[1-3]。

實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的研究至少有3個(gè)階段，小試、中試及驗(yàn)證并完善發(fā)酵工藝，從而獲得適合大生產(chǎn)的工藝。但是往往從一個(gè)階段到另一個(gè)階段，由于發(fā)酵過程的復(fù)雜性，試驗(yàn)的結(jié)果很難重復(fù)，產(chǎn)生了“放大效應(yīng)”，要想對放大試驗(yàn)有一個(gè)比較完善的結(jié)果，就必須對這種放大效應(yīng)進(jìn)行研究，降低放大效應(yīng)，確保放大試驗(yàn)的結(jié)果，產(chǎn)生良好的試驗(yàn)結(jié)果。

搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐發(fā)酵存在著很大的差異，（1）是體積氧傳遞系數(shù)（Kla）和溶氧的差異；（2）是CO2濃度的差異；（3）是菌絲受機(jī)械損傷的差異。本文研究在搖瓶試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，著重研究了從搖瓶放大到種子罐種子液培養(yǎng)基的優(yōu)化和篩選，從搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)放大到50L發(fā)酵罐培養(yǎng)的優(yōu)化和改進(jìn)，包括攪拌轉(zhuǎn)速對菌絲體代謝的影響，發(fā)酵使用碳源的優(yōu)化以及消泡劑對發(fā)酵的影響。

1.材料與方法

(1)設(shè)備

20L、50L全自動(dòng)發(fā)酵培養(yǎng)罐（鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司）。

(2)菌種

刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa），由河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

(3)培養(yǎng)基

斜面與平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉18g/L、葡萄糖3g/L、酵母膏3g/L、玉米漿10g/L、瓊酯18g/L，消前pH7.0，消后pH6.4-6.5，121℃滅菌30min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖15g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母膏3g/L、酪蛋白30g/L、硫酸鎂2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L，消前pH7.0，消后pH6.4-6.5。121℃滅菌30min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖55g/L、可溶性淀粉30g/L、棉籽蛋白10g/L、黃豆餅粉（中溫）15g/L、酵母膏5g/L、硫酸鎂2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、碳酸鈣4g/L，消前pH7.0，消后pH6.7，121℃滅菌30min。

(4)培養(yǎng)條件

斜面與平板培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28-30℃，培養(yǎng)時(shí)間10-12d。

種子搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間3d，搖瓶裝量40ml/250ml。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間10-11d，搖瓶裝量30ml/250ml，接種量10%。

種子罐培養(yǎng)條件（20L）：培養(yǎng)溫度29-30℃，培養(yǎng)時(shí)間3-4d，罐壓0.05MPa，通氣比1：0.8-1.2，轉(zhuǎn)速100-300rPa。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件（50L）：培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間9-11d，罐壓0.05-0.1MPa，通氣比1：0.3-0.8，轉(zhuǎn)速300-500rPa，接種量10%-15%。

(5)相關(guān)參數(shù)的檢測

①多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的測定：取發(fā)酵液1ml，加無水甲醇4ml，充分振蕩1min，超聲30min，用HPLC測定多殺菌素的產(chǎn)量。色譜條件：C18反相柱（250mm×4.0mm）；流動(dòng)相為甲醇:乙晴:水=45:45:10（v/v/v，其中水含.0.5%乙酸銨）；流速1.0ml/min檢測波長244nm。

②葡萄糖含量測定：使用S-10系列生物傳感分析儀。

③氨基氮含量測定：甲醛法。

④生物量的測定：發(fā)酵液5ml，3500r/min離心15min，計(jì)算沉淀固體占發(fā)酵液的質(zhì)量百分比。

2.結(jié)果與分析

(1)種子液培養(yǎng)從搖瓶放大種子罐的優(yōu)化

文獻(xiàn)中關(guān)于刺糖多孢菌種子液培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基種類比較多，使用的氮源主要有動(dòng)物蛋白胨、植物蛋白胨、微生物蛋白胨以及棉籽蛋白、黃豆粉、酵母粉、酵母膏等，碳源主要使用的是淀粉、糊精、葡萄糖。孢子用不同的氮源與碳源復(fù)配及無機(jī)鹽組成的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲呈現(xiàn)不同情況，不論是生物量（表2）還是菌體形態(tài)差異比較大（圖1），其中10號培養(yǎng)基在搖瓶中表現(xiàn)生物量最大，孢子發(fā)芽繁殖成菌絲，菌絲體在培養(yǎng)期內(nèi)形態(tài)成相對大小統(tǒng)一的球形，球形邊緣的菌絲向外延伸，每個(gè)球形中心比較密實(shí)、飽滿，向外延伸的菌絲比較舒展（圖1），非常符合做為種子液移種進(jìn)行發(fā)酵的條件。在種子培養(yǎng)放大過程，發(fā)現(xiàn)用10號培養(yǎng)基作為20L種子罐培養(yǎng)基，生物量不如搖瓶培養(yǎng)生物量大，孢子發(fā)芽比在搖瓶培養(yǎng)慢近30h，甚至有的罐批孢子不發(fā)芽，通過對比發(fā)現(xiàn)葡萄糖在種子液培養(yǎng)時(shí)對孢子的發(fā)芽有一定的抑制，在培養(yǎng)基配方中對碳源進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，去掉葡萄糖改由淀粉做為單一的碳源，結(jié)果顯示孢子的發(fā)芽時(shí)間、生物量及菌絲形態(tài)同搖瓶結(jié)果相同，非常符合移種的條件。10號培養(yǎng)使用的是酪蛋白，是一種非常優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白，其價(jià)格比較貴，國外酪蛋白也叫酪胰蛋白，而國內(nèi)酪蛋白與胰蛋白是2種不同的蛋白質(zhì)，酪蛋白的價(jià)格是胰蛋白價(jià)格的5-6倍，選用胰蛋白替代酪蛋白，進(jìn)行種子液培養(yǎng)，結(jié)果顯示與使用酪蛋白的培養(yǎng)基，移種時(shí)不論是菌絲形態(tài)還是生物量都能滿足移種的條件，而且在價(jià)格上也比較符合工業(yè)化大生產(chǎn)的要求，最終確定了20L種子罐種子液培養(yǎng)基礎(chǔ)最佳配方：淀粉15g/L、酵母膏3g/L、胰蛋白30g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸鎂2g/L。

表1 種子罐培養(yǎng)基的組成（g/L）Tab.1 Composition of the seed tank medium (g/L)

表2 種子搖瓶培養(yǎng)參數(shù)Tab.2 Seed shaker training parameters

表3 搖瓶與種子罐10號培養(yǎng)基相關(guān)數(shù)據(jù)對比Tab.3 Comparison of shaker and Seed Can Medium No.10

圖1 種子搖瓶菌絲形態(tài)Fig.1 Shape of seed Shaelium

(2)發(fā)酵液培養(yǎng)從搖瓶放大到發(fā)酵罐的優(yōu)化

①攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵培養(yǎng)的影響

多殺菌素的搖瓶發(fā)酵采用的250ml三角瓶裝量30ml，轉(zhuǎn)速從240r/min到300r/min，對發(fā)酵產(chǎn)量的影響比較大，影響值一般在20%左右（表4）。觀察菌絲形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)速低時(shí)，菌絲體斷裂的速度明顯慢，一般比高轉(zhuǎn)速幾乎慢24h，pH從前期高點(diǎn)下降的速度略慢，糖消耗略慢，說明多殺菌素發(fā)酵對溶氧要求比較大，但是在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)增加轉(zhuǎn)速對菌體形態(tài)影響不是很大，并沒有影響到菌絲體從初級代謝進(jìn)入到次級代謝，可是放大到發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速低時(shí)，前期菌絲生長很難從初級代謝進(jìn)入到次級代謝，菌絲體經(jīng)過10-20h的遲滯期后，進(jìn)入快速對數(shù)生長期，菌絲體不是繼續(xù)斷裂進(jìn)行繁殖，而是開始產(chǎn)生大量的分枝，有分枝的菌絲體通過分枝生長纏繞有呈球的趨勢，此時(shí)發(fā)酵液pH一直在7.4以上，產(chǎn)單位的能力非常低，甚至不產(chǎn)單位，此時(shí)罐內(nèi)的溶氧水平均在50%以上；當(dāng)把攪拌轉(zhuǎn)速提高后，發(fā)現(xiàn)纏繞的菌絲體開始斷裂，斷裂后的菌絲體不再產(chǎn)生分枝，而是產(chǎn)生大量的菌絲體斷裂的片斷，發(fā)酵液pH由7.4以上下降到7.0以下，產(chǎn)單位的能力明顯增加。說明攪拌轉(zhuǎn)速高低對菌絲體的代謝有非常大的影響作用，通過提高轉(zhuǎn)速改變菌絲體的代謝方式，使菌絲體由初級代謝進(jìn)入到次級代謝，但是過高攪拌轉(zhuǎn)速產(chǎn)生剪切力越大，對菌絲體的影響也比較大，會加速菌絲體的損傷和衰老，為此對攪拌轉(zhuǎn)速在50L發(fā)酵進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)菌體經(jīng)過遲滯期0-10h轉(zhuǎn)速100r/min，11-20h轉(zhuǎn)速200r/min后，對數(shù)期轉(zhuǎn)速500r/min，加快菌體的繁殖和斷裂，讓菌體快速由初級代謝進(jìn)入次級代謝，pH值一般在40-48h達(dá)到最高值7.4以上，然后開始下降到7.0以下進(jìn)入次級代謝，多殺菌素產(chǎn)物合成最適pH為6.5-7.0[4]，進(jìn)入穩(wěn)定期100h后降低轉(zhuǎn)速200-300r/min，減少攪拌剪切力對菌絲體的損傷，保證菌絲體產(chǎn)單位的能力，轉(zhuǎn)速調(diào)整后發(fā)酵單位比調(diào)整前提高近5倍（圖2）。

表4 不同菌株在不同轉(zhuǎn)速下對搖瓶發(fā)酵單位的影響Tab.4 Effect of different strains on the bottle fermentation units at different speeds

圖2 50L發(fā)酵罐在不同攪拌下參數(shù)變化情況Fig.2 Changes of 50L Fermenter under different mixing

②對發(fā)酵培養(yǎng)使用碳源的優(yōu)化

在已發(fā)表的大量文獻(xiàn)中報(bào)道，多殺菌素發(fā)酵使用的培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖、糊精、淀粉，其中有的是葡萄糖和淀粉復(fù)配，有的以葡萄糖和糊精復(fù)配，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)以葡萄糖和淀粉復(fù)配，每24h測定一次還原糖和總糖，做出菌絲體糖的代謝曲線，發(fā)現(xiàn)還原糖在第7天基本已經(jīng)消耗完，而總糖在第10天放罐還有2%以上的量，培養(yǎng)基加入的淀粉量為3%，說明菌體幾乎沒有利用淀粉；用單獨(dú)的葡萄糖和淀粉做為單一的碳源進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)使用葡萄糖的發(fā)酵液和使用葡萄糖和淀粉進(jìn)行復(fù)配的發(fā)酵液產(chǎn)物合成基本上相同，而單獨(dú)用淀粉做碳源的發(fā)酵液，產(chǎn)物合成受阻，幾乎沒有產(chǎn)物合成，進(jìn)一步驗(yàn)證淀粉做為碳源在多殺菌素的發(fā)酵中幾乎不被菌體所利用。從搖瓶放大到50L發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，其葡萄糖、總糖代謝與搖瓶基本相同，放罐時(shí)葡萄糖殘留幾乎為0，而總糖的殘留在2%以上（圖3）。在50L發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，對碳源進(jìn)行了優(yōu)化，使用葡萄糖做為單一的碳源，對葡萄糖加入量進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖加入量大于9%時(shí)，開始產(chǎn)生了明顯的葡萄效應(yīng)，菌體遲滯期、生長期明顯延長，pH上升到高點(diǎn)時(shí)間推遲，下到pH7.0的時(shí)間延長，菌絲體在顯微鏡下觀察，斷裂的速度較慢，產(chǎn)物合成比較少，說明培養(yǎng)基中高配比的葡萄糖對多殺菌素發(fā)酵菌體的生長和產(chǎn)物的合成，有非常明顯的抑制作用，葡萄糖效應(yīng)非常明顯，試驗(yàn)7%最終產(chǎn)量達(dá)到707mg/L，9%最終產(chǎn)量只有274mg/L，相差158%（圖4）。因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的配比應(yīng)低于9%，最佳控制在8%以下，后期葡萄殘留較低時(shí)可采取補(bǔ)葡萄糖的方法進(jìn)行控制，已保證菌體的正常代謝和產(chǎn)物的合成，關(guān)于補(bǔ)糖工藝的控制方法研究將在后續(xù)的工藝優(yōu)化中展開。

圖3 搖瓶、50L發(fā)酵罐葡萄糖、總糖代謝曲線（A：搖瓶；B：50L發(fā)酵罐）Fig.3 Shattle,50L Fermenter Glucose,Total Sugar Metabolic Curve (A:Shaker；B:50L Fermenter)

圖4 50L發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基葡萄糖含量7%、9%PH變化及產(chǎn)量增長情況（A：PH；B：產(chǎn)量）Fig.4 Change of basic medium glucose content of 7%,9% PH and yield growth of 50L Fermenter(A:PH；B:yield)

③消沫劑對發(fā)酵培養(yǎng)的影響

多殺菌素在搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)由于受裝料量和轉(zhuǎn)速的制約，過程中并沒有泡沫的產(chǎn)生，所以在培養(yǎng)基礎(chǔ)料中并沒有加入消泡劑，但是在放大試驗(yàn)中，過程中的泡沫還是比較嚴(yán)重，主要原因是發(fā)酵過程使用的氮源比較豐富，尤其是在通氣和攪拌提高時(shí)泡沫越來越多，影響到了發(fā)酵過程尤其是產(chǎn)物的合成，需要通過加入一定量消沫劑進(jìn)行消泡。試驗(yàn)共選取了天然油酯豆油、聚醚類（GP型、GPE型）、硅類共5種消沫劑進(jìn)行毒性試驗(yàn)，加入量分別為0.1%、0.3%、0.5%，結(jié)果都對產(chǎn)物的合成產(chǎn)生不同程度的毒性，豆油＜硅類＜聚醚類（表5）?？紤]到消沫劑對產(chǎn)物合成的影響，在發(fā)酵過程中首先使用豆油做為消泡劑，結(jié)果效果非常差，幾乎沒有效果，加入后泡沫仍然存在，而且會使發(fā)酵液pH快速下降，發(fā)酵液變粘；聚醚型消泡劑加入后，泡沫快速消失，而且持續(xù)時(shí)間比較長，但是對產(chǎn)物合成影響非常大，發(fā)酵液產(chǎn)物會下降或后續(xù)產(chǎn)物合成速度減慢；硅類對發(fā)酵液菌體的生長代謝影響較少，但是消泡時(shí)間持續(xù)比較短，少量時(shí)影響較小，隨著加量的增加，對產(chǎn)物的合成影響也很大，產(chǎn)物合成速度明顯下降，甚至停止增長。在50L罐放大發(fā)酵時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，為了防止滅菌時(shí)跑料和溢料加入少量的硅消泡劑，一般控制在0.015%-0.02%，接種后隨著通氣和攪拌的提高，發(fā)酵液的泡沫越來越大，當(dāng)泡沫無法控制影響到發(fā)酵時(shí)，采用一次滴加的方法，發(fā)酵液的泡沫沒有時(shí)，停止滴加，當(dāng)發(fā)酵液泡沫再次出現(xiàn)到無法控制時(shí)，進(jìn)行滴加，確保加入的消泡劑越少越好。

表5 不同類型的消泡劑對多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)物合成的影響Tab.5 Effects of Different Type of Antifoam on the Synthesis of Polyfungicide Fermentation Products

3.討論與結(jié)論

本試驗(yàn)在研究50L發(fā)酵罐放大時(shí)，進(jìn)一步確認(rèn)搖瓶與發(fā)酵罐的差異性，種子液培養(yǎng)在搖瓶中并沒有發(fā)現(xiàn)葡萄糖對孢子發(fā)芽有抑制作用，但在20L種子罐培養(yǎng)時(shí)葡萄糖對孢子發(fā)芽有明顯的抑制作用，試驗(yàn)找出了最終種子液培養(yǎng)既符合移種條件又經(jīng)濟(jì)的適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基：淀粉15g/L、酵母膏3g/L、胰蛋白30g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸鎂2g/L、pH7.2。

搖瓶轉(zhuǎn)速在240r/min還是300r/min并沒有影響菌體的生長代謝，生長過程產(chǎn)生斷裂的菌體片段，溶氧高低只是對最終產(chǎn)量造成影響；50L發(fā)酵罐放大試驗(yàn)中攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液培養(yǎng)菌體代謝有明顯的影響，即使溶氧水平在50%以上，菌體在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)速達(dá)不到一定值很難讓菌體由初級代謝進(jìn)入次級代謝，產(chǎn)物合成受阻，50L發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體在進(jìn)入對數(shù)生長期轉(zhuǎn)速至少要達(dá)到400r/min以上，菌體才能快速由初級代謝進(jìn)入到次級代謝，發(fā)酵液pH由最高點(diǎn)7.4以上降到7.0以下進(jìn)入最佳的產(chǎn)物合成所需pH[6]，進(jìn)入穩(wěn)定期100h后降低轉(zhuǎn)速200-300r/min，減少攪拌剪切力對菌絲體的損傷，保證菌絲體產(chǎn)單位的能力，轉(zhuǎn)速調(diào)整后發(fā)酵單位比調(diào)整前提高近5倍。

多殺菌素發(fā)酵培養(yǎng)放大試驗(yàn)使用的碳源經(jīng)過研究，確定葡萄糖做為單一碳源效果最佳[4]，而且基礎(chǔ)培養(yǎng)的含量不應(yīng)超過8%，在9%以上會導(dǎo)致明顯的葡萄糖效應(yīng)[5]，試驗(yàn)7%最終產(chǎn)量達(dá)到707mg/L，9%最終產(chǎn)量只有274mg/L，相差158%，發(fā)酵后期葡萄糖殘留低時(shí)可采用流加補(bǔ)糖方法進(jìn)行解決，關(guān)于補(bǔ)糖工藝的研究將會在下一步試驗(yàn)展開。

多殺菌素發(fā)酵放大研究確定培養(yǎng)基中濃度超過0.1%不論是何種消沫劑都對菌體的代謝產(chǎn)生毒性，天然油脂＜硅消泡劑＜聚醚類消泡劑，培養(yǎng)基最安全的使用濃度應(yīng)在0.015%-0.02%，過程泡沫無法控制時(shí)應(yīng)采用一次性滴加的方法，當(dāng)泡沫沒有時(shí)要停止加入，全程盡量減少消沫劑的使用。