楊雨希，康天惠，孫雪純，杜振霞*

（1.北京化工大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069）

塑料包裝材料因使用方便、成本低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于藥物的生產(chǎn)、儲存及使用環(huán)節(jié)，但其含有的添加劑及其降解產(chǎn)物在與藥品的接觸過程中，可能會從接觸材料中遷移出來，作為雜質(zhì)進入藥品中，或與藥品活性成分形成加合物［1］，或改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性［2］，對藥物的質(zhì)量造成影響，甚至產(chǎn)生毒性，從而影響藥品的安全性和有效性［3］。

在藥品包裝材料的安全性評估中需進行實際藥品的浸出試驗，然而藥品基質(zhì)通常很復(fù)雜，且包裝材料遷移的浸出物通常為痕量水平，因此需要選擇一種合適的樣品前處理技術(shù)。目前，浸出物的常用前處理方法主要有液液萃取法（LLE）［4－5］、固相萃取法（SPE）［6］、攪拌棒吸附萃取法（SBSE）［7］等?？椢锵辔捷腿。‵abric phase sorptive extraction，F(xiàn)PSE）是由Kabir和Furton在2014年提出的一種新型樣品前處理技術(shù)［8－9］。該技術(shù)通過溶膠－凝膠法將吸附劑化學(xué)鍵合在具有大量活性基團的織物基材表面，如棉布、聚酯和玻璃布等天然或人工合成的纖維材料上，形成均勻的超薄涂層。FPSE克服了傳統(tǒng)吸附萃取技術(shù)的缺點，增大了接觸面積，進而提高了富集倍數(shù)和富集速度，是一種高效、簡單、綠色的微萃取技術(shù)，已應(yīng)用于環(huán)境［10］、食品［11］和生物樣品［12］的前處理。

藿香正氣水是一種常見的中成藥，一般灌裝在聚乙烯材質(zhì)的塑料瓶中上市。藿香正氣水是采用乙醇和水作為溶劑制成，成品中含有40%～50%的酒精成分［13］，較高濃度的乙醇會加速包裝瓶中的添加劑及其降解產(chǎn)物向藥液遷移，經(jīng)口服后可能會對人體健康造成潛在危害。因此，有必要開發(fā)一種藿香正氣水中浸出物的檢測方法。

本研究在織物表面鍵合了聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂層用于富集藿香正氣水中包裝材料的浸出物，探究了提取和解吸條件對回收率的影響。選擇乙醇/水（1∶1，體積比）、異丙醇作為可提取物提取溶液，利用超高效液相色譜－四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC－QTOF MS）篩查2種提取液中的可提取物，然后利用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）靶向檢測實際藥液中上述可浸出物的含量，并對可浸出物進行了風(fēng)險評估。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity 超高效液相色譜儀、Waters Quattro Premier 三重四極桿質(zhì)譜儀、Waters Xevo G2－S四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；Milli－Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；MTN－2800D 氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；SHA－BA 水浴恒溫振蕩器（華普達儀器有限公司）；WH－861 渦旋混合器（太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司）。

色譜純和質(zhì)譜純甲醇（美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國Aladdin 公司）；Milli－QⅠ級超純水；二氯甲烷、丙酮、鹽酸（分析純，北京化工廠）；三氟乙酸（99%）、甲基三甲氧基硅烷（98%）；氫氧化鈉固體（96%）均購于阿拉丁試劑有限公司；羥基封端的聚二甲基硅氧烷（PDMS－OH，粘度為700～800 cst，Gelest Inc.）；無水乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；異丙醇（質(zhì)譜純，美國Fisher 公司）。標準品：抗氧劑168、抗氧劑1010、抗氧劑1076、鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）、芥酸酰胺、棕櫚酸、紫外吸收劑UV－1164、紫外吸收劑UV－1577均購于阿拉丁試劑有限公司，純度均大于95%；用于織物相吸附萃取的織物基材（100%纖維素）購自北京某商場；藿香正氣水口服液瓶（規(guī)格10 mL，高密度聚乙烯材質(zhì)）收集于中國的一家制藥公司。

1.2 可提取物實驗

本研究通過可提取物的全面篩查找出潛在的浸出物。由于藿香正氣水含有40%～50%的酒精，因此采用乙醇/水（1∶1，體積比）模擬該藥品的溶劑配方進行可提取物實驗，乙醇/水（1∶1）也是美國藥典新通則USP<665>［14］推薦的提取溶劑。此外，為獲得更全面的可提取物清單，選擇異丙醇作為提取溶劑以模擬最惡劣的儲存環(huán)境。

根據(jù)ASTM F1980－16《醫(yī)療器械無菌材料系統(tǒng)加速實驗標準指南》［15］，60 ℃是保持聚合物材料完整性的最高溫度。根據(jù)USP<665>通則，建議將包材在40 ℃下浸泡21 d。根據(jù)阿侖尼烏斯公式進行溫度和時間的換算［15］，相當(dāng)于在60 ℃下浸泡5.25 d。因此，為模擬更惡劣的提取環(huán)境并加快實驗進度，本研究采用60 ℃浸泡塑料瓶，在第5.25 d 采樣后直接氮氣吹干，復(fù)溶后過濾膜，采用UPLCQTOF MS進行非靶向篩查。

1.3 織物相萃取介質(zhì)的制備

1.3.1 纖維布的預(yù)處理將一塊10.0 cm×5.0 cm 的純棉纖維布用去離子水清洗數(shù)次后，依次浸泡于1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液中活化1 h，用去離子水洗滌至中性后干燥過夜。

1.3.2 溶膠－凝膠涂層的制備將10 g PDMS、10 mL溶膠－凝膠前驅(qū)體甲基三甲氧基硅烷、20 mL二氯甲烷－丙酮（50∶50，體積比）和4 mL 三氟乙酸（含5%水）混合均勻制備成溶膠。將處理過的纖維布浸入溶膠中4 h 后取出，置于烘箱內(nèi)50 ℃老化12 h，依次用二氯甲烷和甲醇漂洗后干燥1 h，裁剪成2.0 cm×2.0 cm的小片待用。

1.4 織物相萃取步驟

萃取前將涂層織物置于10 mL 甲醇－乙腈（50∶50，體積比）混合物中，超聲清洗10 min，以清潔并活化涂層。將5 mL 藿香正氣水樣品、織物萃取相和聚四氟乙烯磁力攪拌子置于玻璃樣品瓶中，以700 r/min 萃取30 min 后，取出織物并輕輕地壓在紙巾上使其干燥。將織物用1 mL 乙腈超聲洗脫10 min，洗脫液氮吹至干，用1 mL 乙腈復(fù)溶，過0.22μm 有機濾膜后上機檢測。將涂層織物再次按上述步驟清潔并干燥后，保存于密閉容器中待用。

1.5 色譜－質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件采用Waters ACQUITYTMUPLC CORTECS C18（100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）色譜柱；流動相：由A 相（甲醇）和B 相（正模式為含0.1%甲酸水溶液，負模式為水）組成；梯度洗脫程序：0～3 min，60%～99% A；3～9 min，99% A；9～9.1 min，99%～60% A；9.1～11 min，60% A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2μL。

1.5.2 飛行時間質(zhì)譜條件電離模式：ESI+或ESI－；檢測模式：MSE；掃描范圍：m/z50～1 200；毛細管電壓：3 kV（+）、2.5 kV（－）；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；錐孔電壓：30 V；碰撞能量：20～60 eV；實時校正LockSpray：亮氨酸腦啡肽作為實時校正溶液，正模式m/z556.277 6、負模式m/z554.262 0，每30 s 切換1 次進行質(zhì)量數(shù)的校正。

1.5.3 三重四極桿質(zhì)譜條件電離模式：ESI + 或ESI－；掃描方式：選擇離子模式（SIR）；掃描范圍：m/z50～1 200；毛細管電壓：3 kV（+）、2.5 kV（－）；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：600 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；錐孔電壓：30 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 可提取物的確證

乙醇/水（1∶1）和異丙醇的可提取物樣品與空白樣品的基峰強度（BPI）色譜圖分別如圖1 和圖2 所示。采用自建譜庫結(jié)合互聯(lián)網(wǎng)在線檢索的方法對可提取物進行鑒定。本實驗室的自建譜庫由300 種聚合物添加劑的詳細信息組成，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、理論質(zhì)量、保留時間和碎片離子等。UNIFI 軟件可通過在線圖書館自動對可提取物進行識別，并與譜庫中的物質(zhì)相匹配。對于自建聚合物譜庫中無法直接識別的化合物，利用UNIFI 軟件通過聯(lián)網(wǎng)篩查的方式進行鑒定。在2 種浸泡液中共檢出33 種化合物，結(jié)果如表1所示。

圖1 乙醇/水（1∶1）的可提取物樣品（A）與空白樣品（B）的UPLC－QTOF MS基峰強度（BPI）色譜圖Fig.1 UPLC－QTOF MS base peak intensity（BPI）chromatograms of extractables in ethanol/water（1∶1）（A）and blank sample（B）

圖2 異丙醇可提取物樣品（A）與空白樣品（B）的UPLC－QTOF MS基峰強度（BPI）色譜圖Fig.2 UPLC－QTOF MS base peak intensity（BPI）chromatograms of extractables in isopropanol（A）and blank sample（B）

表1 可提取物篩查結(jié)果Table 1 The possible identification results of the extractables

（續(xù)表1）

2.2 溶膠－凝膠涂層的表征

溶膠－凝膠吸附涂層類似于海綿狀的多孔三維網(wǎng)絡(luò)，具有高孔隙率和良好的滲透性，通過分子間相互作用（倫敦色散力、偶極－偶極相互作用和氫鍵作用等）達到吸附的目的。經(jīng)PDMS 修飾后，純棉布的實物圖如圖3A 所示，在涂覆后的4 cm2棉布上PDMS 的平均負載量為19.46 mg，相對標準偏差（n=6）為4.0%。如圖3B、C、D 所示，掃描電鏡（SEM）圖顯示了在溶膠－凝膠吸附劑涂覆前后織物基材表面形態(tài)的變化。由SEM 圖可見，涂覆前棉纖維表面光滑，涂覆后表面變得粗糙，說明PDMS 鍵合在織物表面，展現(xiàn)了較高的吸附容量。

圖3 PDMS涂覆后的純棉布實物圖（A），未涂覆的織物基材放大1 000倍（B）、溶膠－凝膠PDMS涂層放大1 000倍（C）、溶膠－凝膠PDMS涂層放大3 000倍（D）的掃描電鏡圖Fig.3 Image of sol－gel coated FPSE media（A），and scanning electron microscopy of uncoated cellulose fabric substrate at 1 000×magnification（B），sol－gel PDMS coated FPSE membrane at 1 000×magnification（C）and 3 000×magnification（D）

2.3 萃取與解吸參數(shù)的優(yōu)化

將可提取實驗中鑒別的33 種可提取物列為潛在的浸出物清單，通過UPLC－MS/MS 靶向檢測藿香正氣水中33種潛在的浸出物。由于可提取物中大多數(shù)為添加劑的降解產(chǎn)物，無法得到標準品，因此將其按結(jié)構(gòu)分成亞磷酸酯類、受阻酚類、鄰苯二甲酸酯類、脂肪酸類、酰胺類、三嗪類及其他。在每類中選擇1～2 種化合物或與其結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)作為內(nèi)標物進行方法學(xué)優(yōu)化，所選擇的8 種標準品為抗氧劑168、抗氧劑1010、抗氧劑1076、鄰苯二甲酸二乙基己酯、芥酸酰胺、棕櫚酸、UV－1164、UV－1577。優(yōu)化實驗在加標量為100 ng/mL的藥液中進行，每個萃取參數(shù)重復(fù)3次實驗取平均值。采用加標回收率評估提取效率。

2.3.1 提取時間考察了提取時間（5～60 min）對提取效率的影響，結(jié)果顯示，隨著提取時間的延長，8種分析物的回收率逐漸增加，在30 min時達到最大。但進一步延長提取時間（30～60 min）會導(dǎo)致某些化合物的回收率降低，可能是由于少量的分析物又回溶到樣品溶液中。因此，選擇最優(yōu)提取時間為30 min。

2.3.2 離子強度通常，向樣品中添加氯化鈉提高樣品的離子強度，有利于疏水性的目標化合物向萃取介質(zhì)遷移（鹽析效應(yīng)），從而提高萃取效率。但較高的鹽含量會增加樣品的粘度，使傳質(zhì)速率降低，從而減慢目標物的提取速率［16］。因此，實驗考察了氯化鈉含量（0%、2%、5%、10%）對萃取效率的影響。結(jié)果表明，隨著氯化鈉含量的增加，8 種分析物的回收率均呈下降趨勢，說明鹽的加入不利于萃取。因此，在后續(xù)的實驗中不加鹽。

2.3.3 解吸溶劑種類比較了3 種溶劑對解吸效率的影響，使用甲醇（MEOH，相對極性0.762）、乙腈（ACN，相對極性0.46）或甲醇－乙腈混合物（50∶50）對目標分析物進行反萃取。如圖4 所示，乙腈顯示出最好的反萃取能力，因此實驗選擇乙腈為解吸溶劑。

圖4 解吸溶劑種類對分析物回收率的影響Fig.4 Effect of desorption solvent type on recoveries of the analytes

2.3.4 解吸溶劑體積為了獲得更高的洗脫效率，考察了解吸溶劑乙腈體積為0.5、1、2 mL（小于0.5 mL乙腈不足以浸沒萃取介質(zhì)）時對解吸效率的影響。由圖5可知，乙腈體積為0.5 mL時，8種目標物的回收率較低。乙腈體積為1 mL時可將目標化合物解吸完全，若繼續(xù)增加解吸溶劑體積，回收率未明顯增加。因此，實驗選擇解吸溶劑乙腈的體積為1 mL。

圖5 解吸溶劑體積對分析物回收率的影響Fig.5 Effect of desorption solvent volume on recoveries of the analytes

2.3.5 解吸時間考察了解吸時間（5、10、15、20 min）對洗脫效率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)解吸時間從5 min增至10 min時，目標分析物的回收率顯著增加；若進一步延長解吸時間，回收率則保持恒定或略有降低，可能是因為分析物在FPSE介質(zhì)上發(fā)生了再吸收。因此，選擇最佳解吸時間為10 min。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

為消除基質(zhì)的影響，建立基質(zhì)校正標準曲線進行定量分析。取5 mL 空白樣品，采用“1.4”方法進行前處理得到空白樣品基質(zhì)，向其中添加8 種標準品得到系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)標準溶液，采用UPLC－MS/MS 檢測。8 種標準品（1 mg/L）的色譜圖如圖6 所示。以質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/L），峰面積為縱坐標（y），繪制8 種標準品的標準曲線。結(jié)果顯示，8 種標準品的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.996 1，檢出限（LOD，S/N≥3）為0.5～1.5μg/L，定量下限（LOQ，S/N≥10）為1.5～4.0μg/L（表2）。

表2 8種標準品的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of the 8 standards

圖6 8種標準品（1 mg/L）的色譜圖Fig.6 Chromatograms of the 8 standards（1 mg/L）

2.5 回收率與相對標準偏差

為驗證方法的準確性，進行了加標回收實驗。向空白藥液中添加10、50、100μg/L 3個水平的8種標準品，采用優(yōu)化后的FPSE方法對加標后藥液進行萃取，每個加標水平制備3組平行樣。由表3可見，8種標準品的平均加標回收率為73.8%～98.2%，RSD為0.98%～8.4%。

表3 8種標準品的平均加標回收率和相對標準偏差（n=3）Table 3 Average spiked recoveries and relative standard deviations（RSD）for the 8 standards at 3 spiked levels（n=3）

2.6 實際樣品的檢測

取5 mL 塑料包裝瓶內(nèi)的藿香正氣水置于玻璃樣品瓶中，經(jīng)“1.4”方法前處理后，通過超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜靶向測定在“2.1”可提取物實驗中篩查出的物質(zhì)。藥液中浸出物的含量均根據(jù)“2.4”中所選標準品的標準曲線計算得到，定量結(jié)果見表4。結(jié)果共檢出4 種浸出物，其中抗氧劑168（Irgafos 168）的氧化產(chǎn)物Irgafos 168－OX的質(zhì)量濃度最高，其余3種物質(zhì)的質(zhì)量濃度較低。

表4 藿香正氣水中浸出物的定量結(jié)果Table 4 Quantitative results of leachables in Huoxiang Zhengqi liquid

2.7 風(fēng)險評估

本實驗基于毒理學(xué)評價軟件Toxtree 和T.E.S.T.對4 種浸出物進行了風(fēng)險評估。首先通過Toxtree 軟件得到致癌性預(yù)測（遺傳毒性和非遺傳毒性），確定4種浸出物均無遺傳毒性。然后通過T.E.S.T.軟件得到浸出物的大鼠LD50。根據(jù)公式（1），可由LD50預(yù)測得到無明顯作用劑量（NOEL）［17］，根據(jù)ICH Q3C 指導(dǎo)原則，NOEL可用于推導(dǎo)成人每日允許暴露量（PDE），見公式（2）［18］。

式中，Weight adjustment取50 kg，F(xiàn)1～F5均為不確定因子，根據(jù)ICH Q3C指導(dǎo)原則中不確定因子的取值規(guī)則［18］，在本研究中的取值依次為5、10、10、10、1。根據(jù)藥方說明，每人每次服用藿香正氣水10 mL，一日兩次，依據(jù)“2.6”實際藥液中浸出物的近似含量計算患者的每日實際攝入量（見表5）。結(jié)果表明4 種浸出物的每日攝入量均未超過PDE 值，因此藿香正氣水中的浸出物對人體而言是相對安全的。

表5 藿香正氣水中4種浸出物的毒理學(xué)評價結(jié)果Table 5 Toxicological assessment results of 4 kinds of leachables in Huoxiang Zhengqi liquid

3 結(jié) 論

本研究建立了塑料包裝瓶藿香正氣水中可提取物與浸出物的快速篩查、定量分析方法。首先通過可提取物實驗得到了包裝瓶的浸出物清單，然后通過織物相萃取技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用對8 種標準品進行了方法學(xué)驗證，最后對浸出物進行了檢測，共檢出4 種化合物。風(fēng)險評估實驗發(fā)現(xiàn)4 種浸出物含量處于相對安全的范圍。本文建立的方法具有操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，也可用于其他藥品中浸出物的檢測，為藥品生產(chǎn)企業(yè)選擇合適的藥品包裝材料提供了參考依據(jù)。