常 芮，蔡伊娜，王周平，彭池方*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；3.深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045）

抗生素被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)療保健和畜牧業(yè)中，主要用于治療細(xì)菌感染［1］。其中，卡那霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，由于其水溶性強(qiáng)、對(duì)許多革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有廣譜抗菌作用，同時(shí)兼具價(jià)格便宜和用藥方便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于獸藥和飼料添加劑［2］。然而，抗生素的過(guò)度使用會(huì)對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境安全帶來(lái)很大的問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō)，抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增加和其他副作用，如耳毒性、腎毒性等毒性作用，并對(duì)神經(jīng)肌肉接頭產(chǎn)生阻滯作用，引起過(guò)敏反應(yīng)等，嚴(yán)重時(shí)致人死亡［3－4］。近年來(lái)，抗生素濫用已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。對(duì)食品中的抗生素設(shè)置限量是食品安全管控的重要手段，如歐盟委員會(huì)明確規(guī)定牛奶中卡那霉素的最高殘留量為150μg/kg［5］。目前常見(jiàn)食品中卡那霉素殘留的檢測(cè)方法有高效液相色譜法（HPLC）［6－7］、液相色譜－質(zhì)譜法［8－9］等，但這些方法存在儀器昂貴、檢測(cè)繁瑣耗時(shí)和要求專(zhuān)業(yè)人員等限制因素，無(wú)法滿足卡那霉素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求。為了保障食品的質(zhì)量和安全，有必要建立簡(jiǎn)單、快速的卡那霉素檢測(cè)方法。

目前許多研究者采用免疫分析法［10－11］、熒光測(cè)定法和比色法［12－15］等技術(shù)實(shí)現(xiàn)了卡那霉素的快速檢測(cè)。其中，側(cè)流免疫層析分析試紙是最受人們關(guān)注的一種技術(shù)。它具有便攜、易保存、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，特別適于即時(shí)檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，在食品質(zhì)量安全檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)以及醫(yī)療診斷等諸多方面均有很廣泛的應(yīng)用［16－17］。在側(cè)流層析試紙條的檢測(cè)方法中，最常用的檢測(cè)模式是基于膠體金標(biāo)記物的比色法。目前，側(cè)流層析分析技術(shù)也被應(yīng)用于抗生素的檢測(cè)，但利用抗體識(shí)別進(jìn)行檢測(cè)的較多。由于抗體生產(chǎn)周期長(zhǎng)、穩(wěn)定性較差、成本高，使基于抗體的試紙條的應(yīng)用受到限制。Song 等［18］利用親和層析的SELEX 系統(tǒng)成功地篩選出高親和力的卡那霉素及其衍生物的適配體。截止目前，僅有少數(shù)研究者將該適配體應(yīng)用于試紙條實(shí)現(xiàn)卡那霉素的檢測(cè)。例如，Ying 等［19］采用DNA 功能化的金納米球（AuNPs－DNA）作為探針，采用磁性微球（MMS）快速分離卡那霉素適配體的互補(bǔ)鏈（cDNA），應(yīng)用層析試紙檢測(cè)cDNA，并將其轉(zhuǎn)換為卡那霉素濃度，以此完成卡那霉素的高靈敏檢測(cè)。因此，具有高親和力、高特異性的卡那霉素適配體，為開(kāi)發(fā)基于適配體的側(cè)流層析技術(shù)檢測(cè)卡那霉素提供了機(jī)會(huì)。

經(jīng)典的核酸與金納米粒子偶聯(lián)方式是利用巰基修飾的核酸與納米金粒子通過(guò)共價(jià)鍵相結(jié)合。然而，巰基化核酸與納米金粒子的結(jié)合方式不能控制納米粒子表面核酸的空間構(gòu)象，其表面核酸雜交速率較慢。Wu 等［20］利用多聚腺苷（PolyA）作為核酸鏈的錨定塊實(shí)現(xiàn)了與納米金粒子的非共價(jià)結(jié)合。該方法可有效調(diào)節(jié)納米金粒子表面核酸的構(gòu)象和密度，并顯著提高AuNPs－DNA 復(fù)合物與核酸鏈的雜交速率以及核酸檢測(cè)的靈敏度。本文嘗試將AuNPs@polyA－DNA 復(fù)合物作為探針應(yīng)用于側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l，通過(guò)簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)構(gòu)建的膠體金試紙條即可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的卡那霉素檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA，上海生工生物工程有限公司）；氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸三鈉（Sigma－Aldrich）；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、磷酸三鈉、蔗糖、吐溫-20（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；上述試劑均為分析純。鏈霉親和素（SA，生物技術(shù)級(jí)別，活性：15 U/mg，上海生工生物工程有限公司）；硫酸卡那霉素（USP 級(jí)別，效價(jià)：750μg/mg，上海生工生物工程有限公司）；硝酸纖維素膜（NC，HF130）、玻璃纖維素膜（金標(biāo)墊，VL78）、玻璃纖維素膜（樣品墊，SB06）、吸水紙（SX27）、PVC膠板，均購(gòu)于上海金標(biāo)公司。實(shí)驗(yàn)用水均為18.2 MΩ·cm的Millipore超純水。

QL－901 漩渦混勻器（江蘇海門(mén)其林醫(yī)用儀器廠）；JEOL－2100 透射電鏡（日本電子株式會(huì)式）；ZJ－600 多通道膠體金讀取儀（無(wú)錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司；VS－100C 恒溫混勻儀（無(wú)錫沃信儀器有限公司）；pH計(jì)（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；分析天平；高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）。所有的寡核苷酸鏈（HPLC純度）均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（見(jiàn)表1）。

表1 卡那霉素適配體側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l所用的核酸序列Table1 Nucleic acid sequence for kanamycin aptamer lateral chromatographic strip

1.2 AuNPs的合成與功能化

AuNPs 的制備采用文獻(xiàn)報(bào)道的檸檬酸鈉還原法［20］：將100 mL 0.01%的HAuCl4加入250 mL 錐形瓶中，加熱攪拌至溶液爆沸，保持1～2 min。隨后，迅速加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌。溶液的顏色由淺黃色逐漸變?yōu)樯钭仙?，最后變成酒紅色，保持加熱10 min，室溫冷卻，4 ℃冷藏備用。實(shí)驗(yàn)用于合成和儲(chǔ)備納米材料的玻璃器皿均用王水（鹽酸∶硝酸=3∶1）浸泡12 h，用水洗滌干凈后使用。

AuNPs 的功能化參考文獻(xiàn)報(bào)道制備［21］：將5～15μL 100μmol/L 的polyA－DNA 加入1 mL 4 倍濃縮的檸檬酸三鈉還原的納米金（10 nmol/L）中混合均勻，然后加入20 μL 500 mmol/L 的檸檬酸緩沖液（pH 3.0）?；旌暇鶆蚝?，在室溫下孵育30～60 min。孵育完成后，加入60 μL pH 7.6 的500 mmol/L HEPES 緩沖液，調(diào)整AuNPs 溶液的pH 至中性，室溫下孵育2～4 h。以10 000 r/min 離心20 min，沉淀物加入重懸液（20 mmol/L Na3PO4，5%BSA，10%蔗糖，0.25%Tween－20）復(fù)溶，10 000 r/min 20 min 離心3次除去未反應(yīng)的核酸，最終加入400μL重懸液，4 ℃冷藏備用。

1.3 SA－生物素－DNAT和SA－生物素－DNAC的制備

DNAT被用于固定在檢測(cè)線（T zone）上用于捕獲適配體進(jìn)一步形成AuNPs－DNA－Apt－DNAT復(fù)合物，DNAC被固定在控制線（C zone）從而捕獲AuNPs@polyA－DNA形成AuNPs@polyA－DNA－DNAC復(fù)合物。SA與DNAT、DNAC端部修飾的生物素具有較高的親和力，因此，制備了SA－DNAT和SA－DNAC偶聯(lián)物。100μL 2.5 mg/mL的SA與100μL 250μmol/L生物素化的DNAT和DNAC在4 ℃下孵育1 h，以完成SA 與Biotin－DNAT和Biotin－DNAC的結(jié)合。為除去游離的生物素化核酸，使用超濾管（MWCO 30 kDa）6 000 r/min 20 min離心3次，重懸于300μL 10 mmol/L PBS中，制備好的復(fù)合物儲(chǔ)存于4 ℃。

1.4 側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l的組裝

試紙條由樣品墊、結(jié)合墊（金標(biāo)墊）、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC 膠板組成。將樣品墊和結(jié)合墊切成適當(dāng)?shù)某叽?，加?0 mmol/L PBS 浸泡30 min 后，在45 ℃下干燥。將之前制備的75 μL AuNPs@polyA－DNA 探針均勻地噴涂在結(jié)合墊上，37 ℃干燥2 h。用三維噴點(diǎn)儀器將30 μL 的SADNAT和SA－DNAC復(fù)合物均勻噴涂在NC 膜上，分別作為T(mén) 線區(qū)域和C 線區(qū)域，T 線和C 線之間的距離固定為5 mm。在NC 膜上噴涂T 線和C 線，37 ℃干燥12 h 后，將樣品墊、結(jié)合墊、NC 膜、吸水墊按圖1依次粘貼在PVC板上，將組裝好的試紙條均勻切割為4 mm的寬度，放入分裝帶中，密封保存。

1.5 卡那霉素的檢測(cè)

卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液用緩沖液分別稀釋至終濃度為5、8、15、25、50、125、250 ng/mL，適配體用水稀釋至1μmol/L。將99μL 不同濃度的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液與1μL 適配體溶液混合孵育20 min，反應(yīng)完成后將混合液加入到樣品墊進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)3 min后測(cè)定相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度（T/C）。

1.6 特異性分析

為評(píng)估制備的側(cè)流層析試紙條的特異性，選用土霉素（TER）、硫酸慶大霉素（GEN）、阿卡米星（AMI）、阿泊拉霉素（APR）、卡那霉素（KAN）進(jìn)行特異性驗(yàn)證。各種抗生素的質(zhì)量濃度為100 ng/mL，其它檢測(cè)條件均相同，測(cè)定并比較檢測(cè)區(qū)域的顏色強(qiáng)度。

1.7 樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

根據(jù)GB 31650－2019食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，動(dòng)物源性食品中卡那霉素的添加量不得高于100μg/kg［12］。因此，選取接近最高檢出限的3個(gè)濃度（50、125、250 ng/mL）驗(yàn)證試紙條對(duì)樣品檢測(cè)的可行性。將蜂蜜樣本稀釋10倍，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。添加不同濃度的卡那霉素后，將1μL適配體（1μmol/L）與99μL預(yù)處理后的蜂蜜溶液混合，孵育20 min后，加樣于上述試紙條檢測(cè)卡那霉素。3 min后，測(cè)試試紙條的顯色信號(hào)。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs的表征

用傳統(tǒng)的檸檬酸鈉還原法合成AuNPs，并在試紙條中作為探針。用透射電子顯微鏡對(duì)制備的AuNPs 進(jìn)行表征，顯示AuNPs 的分散良好，粒徑在15 nm 左右（圖1A）。不同粒徑的AuNPs 在可見(jiàn)光段具有特異的吸收光，本文制備的15 nm 的AuNPs 在520 nm 處有單一的特征吸收峰，當(dāng)與polyA－DNA結(jié)合時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)紅移至530 nm（圖1B），初步證明polyA－DNA成功修飾了納米金顆粒。

圖1 AuNPs的TEM圖（A）及紫外－可見(jiàn)吸收光譜圖（B）Fig.1 TEM image（A）and UV－Vis absorption spectra（B）of AuNPs

2.2 卡那霉素適配體試紙條的設(shè)計(jì)

本試紙條的設(shè)計(jì)是基于核酸適配體鏈與卡那霉素結(jié)合后導(dǎo)致其與AuNPs@polyA－DNA 探針的結(jié)合能力下降或喪失此性質(zhì)。如圖2 所示，當(dāng)樣品溶液中不含卡那霉素時(shí)，卡那霉素的適配體與AuNPs@polyA－DNA探針結(jié)合，并在T線區(qū)域被DNAT捕獲形成AuNPs－DNA－Aptamer－DNAT復(fù)合物。由于AuNPs 的富集，在T 線區(qū)域可以觀察到清晰的紅色條帶。當(dāng)樣品溶液中含卡那霉素時(shí)，卡那霉素可與適配體結(jié)合。此時(shí)，樣品溶液中的適配體不能與AuNPs@polyA－DNA 探針結(jié)合，從而在T 線區(qū)域難以捕獲AuNPs@polyA－DNA，T 線較淺或不顯色。此外，AuNPs@polyA－DNA 探針上含有一段可與C 線上核酸鏈序列DNAC互補(bǔ)的序列，無(wú)論AuNPs@polyA－DNA 探針是否與適配體鏈結(jié)合，都可使AuNPs@polyA－DNA探針在C線區(qū)域被DNAc捕獲而呈紅色。

圖2 基于側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)卡那霉素的原理圖Fig.2 Schematic illustration of kanamycin detection based on lateral chromatographic strip

2.3 檢測(cè)參數(shù)的優(yōu)化

系統(tǒng)地優(yōu)化了試紙條制備過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)條件，包括SA 與DNAT的比例、SA－Biotin－DNAT偶聯(lián)物濃度、適配體濃度、孵育時(shí)間和溫度，以實(shí)現(xiàn)在T 線和C 線區(qū)域呈現(xiàn)清晰的條帶和對(duì)卡那霉素產(chǎn)生靈敏穩(wěn)定的響應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)以膠體金試紙定量分析儀測(cè)得的T線區(qū)域的光強(qiáng)度及變化為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1 緩沖液的選擇選擇了3 種大分子，包括牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白（Casein）、吐溫－20（Tween 20），作為緩沖液的封閉劑，比較了它們對(duì)顯色結(jié)果的影響。由于封閉劑的濃度會(huì)影響溶液在試紙條上的流動(dòng)，因此配制了4xSSC（0.1%Tween 20）、4xSSC（0.5%Tween 20）、4xSSC（1%Tween 20）以及不同濃度BSA和Casein共9種溶液，在核酸適配體試紙條上滴加60μL緩沖液，并比較試紙條的顯色效果。結(jié)果如圖3 所示，當(dāng)選擇的封閉劑為BSA 和Casein 時(shí)，在對(duì)照組的T 線上存在一定非特異性吸附，而選擇Tween 20 為封閉劑時(shí)，對(duì)照組的T 線上未見(jiàn)非特異性吸附。此外，當(dāng)Tween 20 的濃度大于0.5%時(shí)，檢測(cè)組有明顯的紅色條帶，且Tween 20的濃度增加，條帶的顏色基本不變。因此本實(shí)驗(yàn)選擇緩沖液為4xSSC（0.5%Tween 20）。

圖3 不同Running buffer對(duì)試紙條顯色的影響Fig.3 Effects of different running buffers on lateral flow strip coloration

2.3.2 SA與DNAT比例的影響SA 可靜電吸附固定在NC 膜上，并通過(guò)與生物素的特異性結(jié)合將生物素修飾的核酸固定在NC 膜上。SA 與生物素修飾核酸的偶聯(lián)不僅影響核酸在NC膜上的固定量，也影響核酸與探針的雜交效率。有研究報(bào)道SA 與生物素化核酸制備復(fù)合物所用的最優(yōu)摩爾比為1∶6［20］。為獲得最佳的顯色效果，以SA的終濃度為3 μmol/L，考察了SA 與Biotin－DNAT的不同摩爾比（2∶1、1∶1、1∶3、1∶6、1∶9、1∶12）對(duì)試紙條T 線顯色信號(hào)強(qiáng)度的影響。將所得的各種復(fù)合物分別噴涂在NC 膜上，組裝成試紙條，并分別測(cè)試試紙條T 線區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果如圖4 所示，在1∶6 的比例下，條帶的光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大值。因此，選擇SA 與DNAT的最佳摩爾比為1∶6。

圖4 SA與Biotin－DNAT的比例對(duì)試紙條T線信號(hào)強(qiáng)度的影響（n=3）Fig.4 Effect of streptavidin to Biotin－DNAT ratio on signal intensity of T line of lateral chromatographic strip（n=3）

2.3.3 SA－Biotin－DNAT偶聯(lián)物濃度的影響在NC 膜的檢測(cè)區(qū)域固定SA－Biotin－DNAT偶聯(lián)物，通過(guò)DNAT與Aptamer 互補(bǔ)序列之間的雜交，捕獲AuNPs@polyADNA－Aptamer 復(fù)合物。因此，在檢測(cè)區(qū)上固定適當(dāng)量的SA－Biotin－DNAT偶聯(lián)物是確保AuNPs@polyA－DNAAptamer 復(fù)合物在檢測(cè)區(qū)被捕獲并獲得清晰條帶的關(guān)鍵因素。為了取得更好的顯色效果，本實(shí)驗(yàn)分別將1～7μmol/L的SA－Biotin－DNAT偶聯(lián)物噴涂檢測(cè)區(qū)，測(cè)試試紙條T線區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果如圖5所示，隨著偶聯(lián)物濃度的增加，檢測(cè)區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到4 μmol/L 時(shí)，光強(qiáng)度達(dá)到最大，繼續(xù)增大偶聯(lián)物濃度，光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇4 μmol/L SA－Biotin－DNAT偶聯(lián)物噴涂檢測(cè)區(qū)。

圖5 SA－Biotin－DNAT偶聯(lián)物濃度對(duì)試紙條T線信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of streptavidin－Biotin－DNAT conjugate concentration on signal intensity of T line of lateral chromatographic strip

2.3.4 適配體濃度的影響將不同濃度Aptamer（1、5、10、15 nmol/L）與25 ng/mL 卡那霉素結(jié)合。結(jié)果如圖6 所示，當(dāng)Aptamer濃度較高（15 nmol/L）時(shí)，卡那霉素與其結(jié)合后，游離狀態(tài)的Aptamer 存在較多，可與AuNPs@polyADNA和DNAT雜交，使得T線顯色較深。當(dāng)Aptamer濃度較低（1 nmol/L）時(shí)，即使不存在卡那霉素，T線的顯色很弱。當(dāng)Aptamer 的濃度為5 或10 nmol/L 時(shí)，即便無(wú)卡那霉素，試紙條T 線上的顯色均比較清晰，而加入25 ng/mL 卡那霉素后，信號(hào)強(qiáng)度明顯降低。其中，以10 nmol/L Aptamer對(duì)卡那霉素響應(yīng)信號(hào)的變化值最大。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Aptamer的最佳濃度為10 nmol/L。

圖6 適配體濃度對(duì)卡那霉素檢測(cè)的影響Fig.6 Effect of aptamer concentration on kanamycin detection

2.3.5 孵育時(shí)間與溫度對(duì)卡那霉素檢測(cè)的影響為確?？敲顾嘏cAptamer完全結(jié)合，優(yōu)化了體系的孵育時(shí)間和溫度。結(jié)果顯示，隨著卡那霉素與適配體孵育時(shí)間的增加，檢測(cè)區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度增加。當(dāng)孵育時(shí)間大于20 min時(shí)，試紙條的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度可保持穩(wěn)定。因此，選擇20 min 作為卡那霉素與適配體的孵育時(shí)間。此外，孵育溫度在20 ℃～40 ℃之間變化時(shí)，試紙條的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度基本保持不變。因此，選用室溫孵育即可。

2.4 適配體鏈的優(yōu)化及試紙條的檢測(cè)性能

在前述實(shí)驗(yàn)中，所選用的卡那霉素Aptamer 鏈有21個(gè)堿基，與AuNPs@polyA－DNA 和DNAT的互補(bǔ)堿基分別為10 個(gè)和11 個(gè)堿基，互補(bǔ)鏈之間的親和力偏低；這可能使得雜交效率偏低，從而導(dǎo)致所需適配體的濃度偏高，并影響卡那霉素的檢測(cè)。適當(dāng)?shù)脑黾覣ptamer 鏈與AuNPs@polyA－DNA 和DNAT的互補(bǔ)堿基數(shù)，有助于提高雜交效率并可能改善對(duì)卡那霉素的檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)在Aptamer鏈的末端適當(dāng)增加了堿基數(shù)。其中Aptamer 1為在Aptamer 鏈5′端增加了5 個(gè)堿基，Aptamer 2 為Aptamer 鏈5′端和3′端各增加了3 個(gè)堿基。Aptamer、Aptamer 1和Aptamer 2濃度分別為20、20、10 nmol/L時(shí)，測(cè)試了試紙條對(duì)0～250 ng/mL 范圍內(nèi)卡那霉素的響應(yīng)。結(jié)果顯示，3 種適配體鏈均呈現(xiàn)較好的線性和較高的靈敏度。當(dāng)選用Aptamer 2時(shí)，肉眼可分辨25 ng/mL卡那霉素顯著抑制了T 線區(qū)域的顯色，試紙條對(duì)卡那霉素的線性范圍為5.0～125 ng/mL（r2= 0.99），檢出限（LOD，S/N= 3）為1.5 ng/mL（見(jiàn)圖7）；而選用Aptamer 和Aptamer 1 時(shí)，肉眼可分辨卡那霉素濃度為125 ng/mL，其檢出限分別為7.5 ng/mL和4.0 ng/mL。因此，Aptamer 2 鏈在此試紙條中的檢測(cè)效果更優(yōu)。與近年已報(bào)道的側(cè)向?qū)游鲈嚰堖M(jìn)行比較［19，22－23，25－28］（見(jiàn)表1），本方法的檢測(cè)靈敏度超過(guò)典型的熒光檢測(cè)方法［23－24］和基于辣根過(guò)氧化物酶催化信號(hào)放大的電化學(xué)檢測(cè)方法［27］。盡管靈敏度低于銀納米粒子信號(hào)放大的側(cè)向?qū)游鲈嚰垼?8］，但與磁性納米富集信號(hào)放大的試紙相當(dāng)［19］。本文所建立的側(cè)向?qū)游鲈嚰垷o(wú)需信號(hào)放大步驟，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

表1 幾種卡那霉素檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of several methods for kanamycin detection based on nanoparticles

2.5 特異性分析

選用質(zhì)量濃度均為100 ng/mL 的TER、GEN、AMI、APR、KAN 進(jìn)行特異性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，只有卡那霉素才會(huì)在T 線區(qū)域出現(xiàn)明顯的顯色抑制。測(cè)試其他幾種常見(jiàn)抗生素的檢測(cè)信號(hào)，結(jié)果顯示其交叉反應(yīng)率均小于0.4%，表明無(wú)明顯交叉反應(yīng)。因此，該側(cè)流層析試紙條傳感器具有很高的特異性。

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證該側(cè)向?qū)游鲈嚰埖膶?shí)際應(yīng)用性能，將上述試紙條應(yīng)用于添加卡那霉素（25、50、250 ng/mL）蜂蜜樣本的測(cè)試，所得回收率為95.1%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.4%～8.5%。結(jié)果表明，該側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l應(yīng)用于實(shí)際樣品中卡那霉素的檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 結(jié) 論

本文采用AuNPs@polyA－DNA 作為探針，構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、靈敏和低成本的卡那霉素適配體側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l。相比常見(jiàn)的巰基化核酸探針，本納米探針不僅成本顯著降低，且能與互補(bǔ)核酸鏈快速雜交，并在試紙條上完成顯色。通過(guò)優(yōu)化互補(bǔ)鏈（卡那霉素核酸適配體）的序列提高T 線區(qū)域的核酸鏈雜交效率，可將試紙條肉眼分辨和定量分析卡那霉素的靈敏度提高5倍。測(cè)得卡那霉素的線性范圍為5～125 ng/mL，檢出限為1.5 ng/mL。方法具有高靈敏、高特異性、高重復(fù)性和架構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本文的設(shè)計(jì)策略主要基于提高檢測(cè)區(qū)上膠體金核酸探針的雜交速度和效率，包括膠體金探針表面核酸密度和核酸鏈的親和力，研究結(jié)果顯示，上述因素對(duì)試紙條的檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性具有非常關(guān)鍵的影響。因此，進(jìn)一步探索如何提高各類(lèi)核酸納米探針在側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l的雜交速度和效率，有望開(kāi)發(fā)出更敏感、更穩(wěn)定的適配體傳感檢測(cè)方法。