李華 肖萍萍 蘇俊男 賴 冬 林姝婷 黃金梅 田麗紅

（1 廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院科教部，福建 廈門 361021；2 廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院血液/風濕免疫科，福建 廈門 361021；3 廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院輸血科，福建 廈門 361021）

缺血性疾病是臨床常見病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命，長期缺血容易對血管內(nèi)皮細胞（VEC）造成不可逆的傷害，導致血管供血不足，器官衰竭，最終導致嚴重的并發(fā)癥[1]。缺血性腦血管?。ㄈ缒X梗死）、缺血性心臟?。ㄈ缧募」Ｋ溃?、缺血性下肢病變（如閉塞性血栓血管炎）在臨床上較為常見，嚴重危害人類健康。但藥物治療和血管搭橋治療嚴重缺血性血管疾病存在一定的局限性。組織工程血管移植是一種很有前景的缺血性疾病治療技術。血管再生是組織修復、組織移植和手術修復的關鍵因素之一。內(nèi)皮細胞是血管壁形成的重要組成部分，也是是組織工程血管移植的重要材料，內(nèi)皮細胞的植入有助于形成復雜的、有功能的新生血管系統(tǒng)[2-3]。然而，內(nèi)皮細胞來源的不足，限制了內(nèi)皮細胞的臨床應用[4]。人間充質(zhì)干細胞（human mesenchymal stem cells，MSCs）可以從多種組織中分離出來，如羊膜、絨毛膜、華通氏膠、羊水、臍帶血和骨髓等。MSCs具有多向分化和自我更新的特性，利用其分化為平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的能力，可以用作血管組織移植[2,4]。

MicroRNA（miRNA）是短鏈非編碼RNA，長度為20～25 nt，它通過抑制翻譯或破壞靶mRNA的穩(wěn)定來調(diào)節(jié)靶mRNA的表達，參與調(diào)節(jié)多種重要的生物學過程，包括細胞周期、造血、神經(jīng)發(fā)生、衰老、癌癥和心血管疾病[5]。有證據(jù)表明，miRNA是內(nèi)皮細胞功能的關鍵調(diào)節(jié)因子，尤其是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。Hu等[6]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-126可以抑制EVH1結(jié)構(gòu)域含蛋白1、磷酸肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基2和血管細胞黏附分子1三個靶基因來促進小鼠的血管生成。Lou教授等研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p通過靶向內(nèi)皮細胞中的AGPAT1增強脂肪酸的使用，促進小鼠的微血管生成，顯示miR-122-5p在組織修復中的治療潛力[7]。VEGF也是miR調(diào)節(jié)的一個靶點，miR-146[8]和miR-126均可增強VEGF的促血管生成作用，促進血管形成[9]。下調(diào)miR-26a-5p促進微血管內(nèi)皮細胞的管形成[10]。過表達miR-34a會通過靶向Notch通路增加vWF和CD31的表達，從而促進腦腫瘤干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化[11]。下調(diào)microRNA-145可提高vWF和CD31的表達，從而調(diào)節(jié)脂肪干細胞向微血管內(nèi)皮細胞分化，促進血管生成[12]。是否臍帶來源的間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮分化具有可行性，通過MicroRNA的調(diào)控來闡明其部分分化機制，有利于未來血管組織工程學的研究和臨床應用。

因此，本研究旨在鑒定與人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUCMSCs）向血管內(nèi)皮細胞分化相關的miRNA，從而闡明調(diào)控這一過程的miRNA分子。本研究從臍帶中分離出MSCs，并分化為內(nèi)皮細胞，檢測分化過程中vWF和CD31的水平以及分化前后miRNAs的變化。

1 材料與方法

1.1 MSCs的分離和培養(yǎng) 本項目經(jīng)廈門醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準（2016012），在知情同意的情況下，從健康的孕產(chǎn)婦捐贈者處獲取臍帶。用含25 mg/L慶大霉素的生理鹽水清洗3次后，將臍帶剪成1 cm×1 cm的小塊，然后切除下方的血管周圍沃頓氏果凍組織。將切除的組織切成3 mm×3 mm的切片，置于10 cm的組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有5 mL無血清的MSCs培養(yǎng)液（Yocon，北京），置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。第3天加入5 mL培養(yǎng)基，第7天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～9 d后，當細胞生長至融合傳代時，第13天用含1 mmol/L EDTA 2.5g/L胰蛋白酶消化，離心去上清，收集細胞，以8000個/cm2的密度接種到培養(yǎng)皿中。

1.2 MSCs向內(nèi)皮細胞分化 采用EBMTM-2內(nèi)皮細胞生長基礎培養(yǎng)基-2（Lonza），第三代的MSCs以5×104/cm2的濃度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，用EGMTM-2 MV微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（Lonza）誘導分化。根據(jù)試劑盒說明誘導2～3周后，收集細胞并通過流式細胞儀鑒定。

1.3 流式細胞術鑒定細胞 收集細胞并用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗一次。流式細胞儀計數(shù)活細胞，制片1×106細胞，用100 μL PBS重懸。在細胞中加入熒光抗體（5 μL），在25 ℃下孵育10 min。PBS洗滌3次后，每個樣本用100 μL PBS重懸，使用NovoCyteTM流式細胞儀（ACEA，San Diego，CA，美國）分析。

1.4 RNA水平檢測 使用Trizol（Ambion，上海）從細胞中提取RNA，并使用Hiscript逆轉(zhuǎn)錄酶（VAZYME，南京，）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Xu等[13]文獻描述。利用特異性引物完成miRNA的逆轉(zhuǎn)錄。然后采用SYBR Green Master Mix（VAZYME，南京，）對該cDNA進行進行實時PCR（RT-PCR）檢測RNA水平，miRNA水平檢測采用相同的逆轉(zhuǎn)錄引物。

1.5 蛋白質(zhì)水平檢測 采用Western blot方法檢測CD31和vWF蛋白水平，使用冷的RIPA緩沖液（beyotime，上海）、PVDF膜（Millipore，上海）和抗體，根據(jù)Zheng等[14]文獻所述步驟進行操作。

1.6 雙熒光素報告酶分析 獲得用于雙熒光素酶報告基因檢測的CD313'UTR和vWF 3'UTR質(zhì)粒，分別命名為CD313'UTR和vWF 3'UTR。采用HEK293細胞（IMMOCELL，廈門，）進行雙熒光素酶報告基因檢測，如Xu等[15]所述。將CD313'UTR與陰性對照miRNA mimic（miRNA-nc）或miR-26a-5p mimic共轉(zhuǎn)染到細胞中；vWF 3'UTR與陰性對照miRNA-NC或miR-15a-5p，miR-761，miR-335-5p and miR-16-5p mimic共轉(zhuǎn)染到細胞中。并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，上海），根據(jù)試劑說明共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞。48 h后，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（Promega，北京）進行雙熒光素酶報告基因檢測。

1.7 成管實驗 通過體外血管形成實驗來檢測MSCs的血管生成潛能，如前所述[16]，將基質(zhì)（康寧）與培養(yǎng)基按等比例混合，以50 μL/孔的體積加到96孔板中。將分化9天的細胞收獲，以2×104細胞/孔的密度播種于96孔板中，孵育12 h。倒置顯微鏡下拍照觀察管的形成情況。

1.8 統(tǒng)計學分析 兩組比較采用非配對樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。結(jié)果在P＜0.05被認為有統(tǒng)計學差異。所有統(tǒng)計分析均采用SPSS軟件（22.0版）。圖表和熱圖使用GraphPad Prism 8制作。

2 結(jié)果

2.1 間充質(zhì)干細胞的增殖與鑒定 從新鮮人臍帶中分離的細胞呈成纖維細胞樣，梭形形態(tài)，呈黏附生長（圖1A）。從第7代到第8代，增殖率顯著增加（圖1B）。流式細胞術結(jié)果顯示，MSCs標志物CD29、CD44、CD105表達，不表達HLA-G、HLA-DR、CD80、CD86、CD45、CD31、CD34、vWF（圖1C）。這些結(jié)果表明，間充質(zhì)干細胞被成功地分離和增殖。

圖1 間充質(zhì)干細胞的特征

2.2 MSCs向內(nèi)皮細胞分化的誘導 誘導分化后，MSCs呈短梭形，與未分化的MSCs明顯不同（圖2A）。誘導分化9天的細胞能夠形成獨立條索狀的血管樣結(jié)構(gòu)（圖2B）。在誘導期，細胞生長迅速。Western blot、RT-PCR和流式細胞術檢測CD31和vWF的表達（圖3）。誘導第9天，約60%的培養(yǎng)細胞中觀察到CD31和vWF的表達（圖3A）。隨著培養(yǎng)的進行，CD31和vWF的表達逐漸誘導增加，而未分化的MSCs（第0天）在整個細胞培養(yǎng)過程中不表達內(nèi)皮標志物（圖3B-3D），表明MSCs成功分化為內(nèi)皮細胞。

圖2 （A）不同時間點誘導分化后MSCs的形態(tài)特征。（B）分化9 d后細胞間充質(zhì)細胞被誘導形成血管。

圖3 （A）誘導9天后流式細胞術鑒定誘導的間充質(zhì)干細胞。（B）RTPCR檢測內(nèi)皮特異性標志物的表達。（C-D）western blot檢測內(nèi)皮特異性標志物的表達。ns：無差異；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

2.3 靶向CD31和vWF的miRNA的預測和驗證 使用TarBase、miRDB和mirDIP預測靶向CD31或vWF的miRNA。這三個數(shù)據(jù)庫只預測了1個靶向CD31的miRNA和9個靶向vWF的miRNA（圖4A，4B）。為了鑒定參與MSCs向內(nèi)皮細胞分化的miRNA，分別收集分化0、3、7和9天的MSCs。隨后檢測細胞中這些miRNA的水平，發(fā)現(xiàn)分化第9天，靶向CD31的miR-26a-5p水平顯著下降，靶向vWF的miR-24-3p、miR-15b-5p、miR-497-5p、miR-214-3p、miR-761、miR-335-5p和miR-16-5p水平顯著下降。而miR-15a-5p、miR-195-5p與誘導前無顯著差異（圖4C-4E）?；谝陨辖Y(jié)果，本研究選擇miR-26a-5p、miR-15a-5p、miR-761、miR-355-5p和miR-16-5p通過雙熒光素酶報告基因檢測進行驗證。結(jié)果表明，miR-26a-5p靶向CD31的3'UTR，miR-761、miR-335-5p和miR-16-5p靶向vWF的3'UTR，而miR-15a-5p不靶向vWF的3'UTR（圖4F）。

圖4 預測和鑒定靶向CD31或vWF的miRNA。（A）預測靶向CD31的miRNA。（B）預測靶向vWF的miRNA。（C-E）不同分化時間點miRNA的表達。（F）雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒炞CmiRNAs靶向CD31或vWF的能力。ns：無差異；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

3 討論

間充質(zhì)干細胞在再生醫(yī)學中具有潛在的治療能力，特別是MSCs在體外誘導內(nèi)皮細胞功能，體內(nèi)促進血管生成。因此，MSCs作為一種有前景的治療方法將在缺血性疾病中被廣泛研究。心肌梗死、缺血性腦卒中和嚴重肢體缺血的動物研究表明，人MSCs能促進個體發(fā)生，加速組織再生。在MSC來源方面，臍帶與其他組織相比，具有以下幾個優(yōu)點：獲得比替代組織更安全，冷凍保存仍能保持細胞活力，傳播微生物和體細胞突變的風險低，獲取該組織不存在道德和倫理問題。因此，臍帶是間充質(zhì)干細胞的重要來源。此外，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）已經(jīng)被證明可以誘導MSCs向內(nèi)皮細胞分化[15]。EGF和VEGF的結(jié)合可以誘導MSCs具有內(nèi)皮細胞的一些特征，內(nèi)皮細胞有助于新生血管的形成，通常表達特異性的表面生物標志物，包括CD31、CD34、vWF、VE-Cadherin、血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）。有研究報道，VEGF、bFGF、IGF、EGF同時刺激MSCs可更有效地誘導MSCs向內(nèi)皮細胞分化。在這項研究中，本研究利用上述刺激因子誘導臍帶來源的MSCs分化成內(nèi)皮細胞。但是間充質(zhì)干細胞分化為內(nèi)皮細胞涉及多種基因和相互作用的信號通路的調(diào)節(jié)關系，MSCs向內(nèi)皮細胞分化的基因表達變化尚不完全清楚。通過探索mirRNA的調(diào)控機制，部分闡明相關調(diào)控機制，為臨床缺血性疾病的治療提供依據(jù)。

證據(jù)表明，miRNA在MSCs向內(nèi)皮細胞分化中發(fā)揮關鍵作用。miRNA是一種包含17-25個核苷酸的單鏈小RNA，不編碼任何蛋白質(zhì)，被認為是生物過程的調(diào)節(jié)者。miRNA通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合，導致其降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控基因表達。研究表明，miRNA靶向MSCs分化相關的關鍵轉(zhuǎn)錄因子[17]。過表達miR-126通過激活PI3K/Akt和MAPK/ERK通路并釋放旁分泌因子促進MSCs向內(nèi)皮細胞分化[18]。本研究探索了參與MSCs分化內(nèi)皮細胞的miRNA。本研究篩選和驗證的變化水平的miRNA針對CD31或vWF是內(nèi)皮細胞的表面標記。分化后發(fā)現(xiàn)，miR-26a-5p的水平，miR-24-3p，miR-15b-5p，mir-497-5-p，mir-214-3-p，mir-761，mir-335-5p，和miR-16-5p被降低了。有報道稱，下調(diào)miR-26a-5p可促進微血管內(nèi)皮細胞的形成，這與本研究類似。miR-15b/miR-16抑制血管生成[19]。miR-24靶向GATA4和PAK 2抑制血管生成[20]。據(jù)報道，miR-214可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮對血管生成刺激的反應[21]；miR-335-5p與血管生成調(diào)控相關[22]。這些研究與本研究工作一致，本研究利用熒光素酶報告系統(tǒng)也驗證了其調(diào)控作用。然而，人臍帶來源的MSCs衍生的血管內(nèi)皮細胞在體內(nèi)形成血管的能力仍有待進一步探索。這些miRNA調(diào)控MSCs向內(nèi)皮細胞分化的具體分子機制尚待進一步研究。

總之，本研究成功地分離和誘導了臍帶間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞的分化，同時還發(fā)現(xiàn)MSCs分化后，靶向CD31的miR-26a-5p和靶向vWF的miRNAs（包括miR-24-3p、miR-15b-5p、miR-497-5p、miR-214-3p、miR-761、miR-335-5p、miR-16-5p）水平下降，初步揭示了MSCs向內(nèi)皮細胞分化的分子機制，為體外血管形成的進一步研究奠定了基礎。