田志剛，張樹偉，陳 芳，常利芳，賈舉慶，張曉軍，李 欣

(1.山西省科技情報(bào)與戰(zhàn)略研究中心，山西 太原 030001；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031 )

由于長期以來采用密植和高水肥的栽培方式，小麥白粉病在世界范圍內(nèi)日趨嚴(yán)重。該病害由布氏白粉菌 (Blumeriagraminisf.sp.tritici，Bgt)引起，常年流行于我國各小麥主產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。發(fā)掘抗病基因、選育抗病品種是緩解小麥白粉病最經(jīng)濟(jì)有效的措施[1]。

目前，國內(nèi)外已從小麥基因組中鑒定并正式命名了68個(gè)抗白粉病位點(diǎn) (Pm1～Pm68)[2]，并且有12個(gè)位點(diǎn)上的Pm基因已被克隆。其中，9個(gè)基因(Pm1[3]、Pm2[4]、Pm3[5]、Pm5[6]、Pm8[7]、Pm17[8]、Pm21[9]、Pm41[10]和Pm60[11])均為核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(Nucleotide binding site，NBS)基因。NBS基因廣泛存在于植物中，是數(shù)量最多的一類抗病基因，其編碼蛋白通過結(jié)合三磷酸腺苷或三磷酸鳥苷來參與抗病信號傳導(dǎo)，進(jìn)而引發(fā)植株對病原菌的抗病反應(yīng)[12]。水稻[13]、玉米[14]、大豆[15]等作物中的NBS序列已被分離。

2015年，Bouktila等[16]利用普通小麥品種中國春的第一代測序數(shù)據(jù)，首次分離了436條小麥NBS序列，并初步分析了家族保守域結(jié)構(gòu)。隨后，喬麟軼等[17]利用中國春第二代測序數(shù)據(jù)，從全基因組范圍內(nèi)分離了2 406條小麥NBS序列，分析了序列鄰近的SSR位點(diǎn)，并在2AL染色體上篩選出3個(gè)可能與抗白粉病基因Pm4a連鎖的NBS-SSR標(biāo)記。上述研究成果為小麥基因組中NBS家族的分離鑒定奠定了基礎(chǔ)，但尚未從轉(zhuǎn)錄組水平研究NBS對白粉菌的響應(yīng)情況。

本研究利用小麥?zhǔn)馨追劬{迫后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]分析TaNBS家族的表達(dá)水平變化，并選擇差異表達(dá)顯著基因進(jìn)行qRT-PCR和病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)驗(yàn)證，以期發(fā)掘抗白粉病相關(guān)TaNBS基因，為小麥抗病育種提供分子依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和菌株

小麥種質(zhì)CH7124由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。該種質(zhì)由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院暢志堅(jiān)研究員選育，對白粉菌生理小種E09表現(xiàn)為免疫[19]。白粉菌種E09由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院段霞瑜研究員惠贈，由本實(shí)驗(yàn)室繁殖、保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 以注冊號PRJNA243835檢索SRA數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm. nih. gov/sra/)，下載小麥接種白粉菌后0，24，48，72 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用Tophat 2.0軟件將reads比對到小麥參考基因組上(中國春TGACv1版本，http：//tgac-browser.tgac.ac.uk/)；之后用cufflinks組裝轉(zhuǎn)錄本，并用edger獲得轉(zhuǎn)錄本的FPKM(Expression fragment per kilobase of exon model per million mapped reads)值。

利用小麥NBS家族序列[17]從上述轉(zhuǎn)錄本中檢索并篩選受白粉菌脅迫后表達(dá)量差異顯著的TaNBS，篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2|FPKMt/FPKMt0|≥1。所得結(jié)果用MeV軟件輸出。

1.2.2 白粉菌接種與鑒定 將CH7124播于育苗盤內(nèi)，種子萌發(fā)后移入人工培養(yǎng)箱，設(shè)置22 ℃光照16 h/16 ℃黑暗8 h。待植株生長至三葉期，用掃拂法充分接種白粉菌種E09的分生孢子。并在接菌的0，24，48，72 h剪取植株葉片，于-80 ℃保存。

1.2.3 qRT-PCR 用RNA提取試劑盒 (DP420，天根生化，北京 )提取樣品的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (RR036A，寶生物，北京 )反轉(zhuǎn)錄cDNA。在羅氏Light Cycler?96-PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR，所用引物序列列于表1。使用的酶為SYBR Premix ExTaqⅡ(寶生物，北京 )，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，所得結(jié)果采用Fold-change法進(jìn)行分析。

1.2.4 大麥條紋花葉病毒 (BSMV)接種液制備 涉及的載體均購自北京信捷創(chuàng)輝生物科技有限公司。使用表1中的引物擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)測序驗(yàn)證后用無縫克隆試劑盒 (B632219，生工生物，上海 )將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體BSMV-γ上，將其與BSMV-α、BSMV-β線性化處理后用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1340，Thermo Fisher，美國)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。之后將上述BSMV-α、BSMV-β+BSMV-γ-目的片段、BSMV-γ的轉(zhuǎn)錄物各取10 μL混合，加入90 μL DEPC水和120 μL GKP Buffer，制成240 μL接種液。

表1 使用的qRT-PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR used

1.2.5 小麥VIGS體系建立 當(dāng)CH7124幼苗第2片葉展開時(shí)，滴加10 μL接種液并摩擦接種，之后保持濕潤和黑暗24 h，移入正常生長環(huán)境，待第3片葉產(chǎn)生病毒斑表型，表明接種成功。當(dāng)VIGS植株第4片葉展開時(shí)，剪取有病毒斑的葉片，一部分置于含有苯并咪唑的MS培養(yǎng)基上接種白粉菌E09，7 d后采用0～4級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查反應(yīng)型[20]，每個(gè)目的基因調(diào)查3株VIGS植株；另一部分樣本提取總RNA，按照1.2.3描述的方法鑒定目的基因的表達(dá)水平。

1.2.6 基因序列分析 利用基因的表達(dá)序列比對小麥參考基因組(中國春IWGSCv1.0版本，http：//wheat-urgi.versailles.inra.fr/)得到基因組序列，進(jìn)而獲得基因結(jié)構(gòu)特征。將基因起始密碼子前2 000 bp基因組序列遞交PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果

通過組裝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得小麥在接種白粉菌4個(gè)時(shí)間點(diǎn)后的基因表達(dá)數(shù)據(jù)；根據(jù)FPKM值，將基因分為不表達(dá) (FPKM=0 )、低表達(dá) (FPKM≤2)、中表達(dá)(2

圖1 小麥接種白粉菌后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果Fig.1 The assembly of transcriptome data for wheat after inoculation with Bgt

2.2 NBS序列的分離

利用2 406條小麥NBS家族序列檢索組裝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得1 283條分布于21條染色體上的、具有表達(dá)數(shù)據(jù)的TaNBS(FPKM>0 )，占比53.3%；其中，在小麥4A和7D染色體上分布的TaNBS最多，各有101條，而4B和4D染色體分布較少，分別為16，15條 (圖2)。

圖2 具有表達(dá)數(shù)據(jù)的TaNBS在染色體上的分布Fig.2 Distribution of TaNBSs with expression data on wheat chromosomes

2.3 TaNBS對白粉菌的響應(yīng)

基于差異顯著性分析，進(jìn)一步篩選出395條接種Bgt后表達(dá)水平變化顯著的TaNBS基因，這些基因可大致分為5類，第1類在接種后24 h內(nèi)表達(dá)水平降低，之后持續(xù)升高；第2類在接種48 h內(nèi)表達(dá)水平升高，之后下降；第3類在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出升-降-升的變化趨勢；第4類在接種48 h內(nèi)表達(dá)水平降低，之后上升；第5類在接種后持續(xù)上升(圖3)。

圖3 小麥接種白粉菌E09后表達(dá)水平變化差異顯著的TaNBSFig.3 TaNBSs with significant changes in expression levels after inoculation with Bgt

2.4 TaNBS的qRT-PCR驗(yàn)證

從上述第5類基因中選擇10個(gè)表達(dá)水平變化差異最為顯著的TaNBS進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，有3個(gè)基因在接種白粉菌24，48，72 h均保持上調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。其中，位于7D染色體的Ta7dlLoc004854在接種24，72 h顯著上調(diào)(P<0.05)，48 h顯著上調(diào)(P<0.05)；同樣位于7D染色體的Ta7dlLoc000139在接種24，48，72 h均保持顯著上調(diào)(P<0.05)，但上調(diào)倍數(shù)呈下降趨勢；而位于3A染色體的Ta3asLoc007663在接種24 h顯著上調(diào)(P<0.05)，48，72 h顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4)。

其余基因的表達(dá)水平變化與轉(zhuǎn)錄組不一致。Ta4dsLoc004039在接種24 h 無顯著變化，在48 h呈極顯著(P<0.01)上調(diào)，隨后在72 h顯著下調(diào)(P<0.05)；Ta1dsLoc003044僅在24 h顯著上調(diào)(P<0.05)；Ta2asLoc021716僅在72 h顯著上調(diào)(P<0.05)；Ta3dlLoc008638、Ta1bsLoc018729、Ta2dlLoc029209和Ta6alLoc012531的表達(dá)水平無顯著變化(圖4)。

使用倍數(shù)法分析表達(dá)數(shù)據(jù)，設(shè)0 h為對照；不同小寫字母代表顯著差異，P<0.05。圖5同。The expression data are processed by the Fold-change method setting 0 h as control；different lowercase letters represent significant differences,P<0.05.The same as Fig.5.

2.5 TaNBS的VIGS驗(yàn)證

利用BSMV侵染CH7124植株，分別誘導(dǎo)Ta7dlLoc004854、Ta7dlLoc000139和Ta3asLoc007663的表達(dá)水平下調(diào)，獲得VIGS植株；qRT-PCR結(jié)果顯示，VIGS植株中Ta7dlLoc004854、Ta7dlLoc000139和Ta3asLoc007663的表達(dá)水平與對照植株相比顯著下調(diào)(圖5)。剪取VIGS植株第4片葉進(jìn)行離體接種白粉菌E09，結(jié)果如表2所示，VIGS植株BSMV-Ta7dlLoc004854和BSMV-Ta3asLoc007663對E09表現(xiàn)為免疫(IT=0)，與未侵染BSMV的CK植株表型一致；而VIGS植株BSMV-Ta7dlLoc000139的葉片上出現(xiàn)零星孢子，其中，2株表現(xiàn)為高抗(IT=1)，1株表現(xiàn)為中抗(IT=2)。推測Ta7dlLoc000139表達(dá)水平的降低引起了植株抗性減弱(圖5)。

表2 VIGS植株離體接種白粉菌E09的反應(yīng)型Tab.2 The infection type of VIGS plants inoculated with Bgt race E09 in vitro

2.6 Ta7dlLoc000139序列特征

序列分析表明，Ta7dlLoc000139全長4 042 bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，無可變剪切；在其起始密碼子前2 000 bp區(qū)域內(nèi)包含大量CGCG-Box、GATA-Box和CAAT-Box等調(diào)控元件，顯示該基因的表達(dá)可能受到調(diào)控(圖6)。

CK.未侵染BMSV的植株；1～3.侵染BMSV的植株。CK and number 1 to 3 refer to plants not inoculated and inoculated with BMSV，respectively.

圖6 Ta7dlLoc000139的基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件預(yù)測Fig.6 Gene structure and prediction of regulatory elements in promoter region of Ta7dlLoc000139

3 結(jié)論與討論

鑒定抗病基因用于品種選育可有效緩解小麥白粉病病害。一些抗白粉病基因如Pm2、Pm8和Pm21，已成功應(yīng)用于小麥生產(chǎn)。然而，由于小麥白粉菌種致病型多且變異快，大多數(shù)抗病品種在推廣應(yīng)用5 a左右會逐漸喪失抗性[21]。因此，廣泛、持續(xù)地發(fā)掘小麥抗白粉病基因尤為重要。NBS基因在植物抵御病原菌入侵過程中發(fā)揮重要作用。目前，小麥全基因組中的NBS序列已被分離[16-17]，但有關(guān)NBS家族基因受白粉菌侵染后轉(zhuǎn)錄水平變化的研究尚未見報(bào)道。本研究從小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分離了1 283條具有表達(dá)水平的NBS序列，約有46.7%的NBS基因未表達(dá)，可能是由于其表達(dá)具有時(shí)期或組織特異性，或者受其他病原菌誘導(dǎo)，或者一些基因已經(jīng)是失去功能的假基因，顯示了多倍體物種中基因家族功能的復(fù)雜性。

由于已克隆的9個(gè)NBS類抗白粉病基因在受白粉菌侵染后均持續(xù)上調(diào)[3-11]，本研究從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選擇受侵染24，48，72 h后表達(dá)水平均持續(xù)上調(diào)并且差異最大的10個(gè)TaNBS進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，最終獲得3個(gè)受白粉菌誘導(dǎo)的TaNBS。其中，Ta3asLoc007663位于小麥3A染色體，與抗白粉病基因Pm44[22]均位于短臂；而Ta7dlLoc004854和Ta7dlLoc000139所在的7D染色體尚無正式命名的Pm基因，目前只有TaRPP13-3被報(bào)道[23]。TaRPP13-3屬于NBS家族，同樣對白粉菌種E09表現(xiàn)為抗病，但是該基因位于7D短臂18 Mb的基因組位置，而Ta7dlLoc004854和Ta7dlLoc000139分別位于長臂717，632 Mb位置，不是同一基因。因此，Ta7dlLoc004854和Ta7dlLoc000139可能是2個(gè)新的白粉菌響應(yīng)基因位點(diǎn)。

本研究利用VIGS技術(shù)下調(diào)Ta7dlLoc000139后，植株抗病性減弱，表明Ta7dlLoc000139與抗病性相關(guān)，可能是一個(gè)抗白粉病基因。該基因啟動(dòng)子區(qū)包含大量的調(diào)控元件，推測其表達(dá)水平會受到轉(zhuǎn)錄因子或者上游基因的調(diào)控。后續(xù)研究將利用遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)對Ta7dlLoc000139進(jìn)行功能驗(yàn)證，如最終證實(shí)其為抗白粉病基因，將為小麥抗病分子育種提供新的抗源。

本研究從小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分離了395個(gè)差異表達(dá)TaNBS基因，利用qRT-PCR證實(shí)3個(gè)TaNBS在小麥抗病材料CH7124中受Bgt脅迫后持續(xù)上調(diào)，其中，Ta7dlLoc000139經(jīng)VIGS下調(diào)后，植株抗性從免疫(IT=0)變?yōu)楦呖?IT=1)或中抗(IT=2)，推測Ta7dlLoc000139是1個(gè)新的抗白粉病基因。