孫 斌，唐 琳，張軍芳，孫建富，崔 巖，王 英，王恩澤，李 強(qiáng)，李香子

(延邊大學(xué)，東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心，吉林省肉?？茖W(xué)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)重大需求協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林 延吉 133002)

延邊牛屬寒溫帶山區(qū)的役肉兼用品種，適應(yīng)性較強(qiáng)。在延邊等地溫度極低的冬季，延邊牛同樣可正常生產(chǎn)、生存，且體現(xiàn)出遺傳穩(wěn)定性與較高生產(chǎn)性能。在-26 ℃時(shí)才出現(xiàn)明顯的不安[1]，但依然能保持正常食欲和反芻，因此，延邊牛既是我國(guó)東北部寶貴的抗寒品種又是研究大型哺乳動(dòng)物抗寒不可多得的優(yōu)秀模型。

恒溫動(dòng)物面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)是在冷應(yīng)激期間對(duì)產(chǎn)熱的需求增加。當(dāng)保溫機(jī)制(例如蜷縮行為、血管收縮、立毛)不足以抵抗外界溫度過(guò)低時(shí)，則機(jī)體需要通過(guò)震顫和非震顫產(chǎn)熱機(jī)制來(lái)維持恒定的體溫。然而持續(xù)震顫產(chǎn)熱會(huì)影響到動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)、睡眠反而會(huì)出現(xiàn)適得其反的效果，出生于寒冷環(huán)境的動(dòng)物肌肉沒(méi)有充分發(fā)育，無(wú)法有效地通過(guò)震顫產(chǎn)熱[2]，所以處于寒冷環(huán)境中的哺乳動(dòng)物震顫產(chǎn)熱逐漸被非震顫產(chǎn)熱所替代。眾所周知，棕色脂肪是非震顫產(chǎn)熱的主要部位，通過(guò)其產(chǎn)熱可以維持機(jī)體核心體溫、促進(jìn)在冬眠中動(dòng)物的蘇醒。棕色脂肪產(chǎn)熱受中樞神經(jīng)所控制，其機(jī)理是中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放去腎上腺素以激活β-腎上腺受體和細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)，從而增加線(xiàn)粒體底物的供應(yīng)和呼吸能力，使機(jī)體內(nèi)的甘油三酯分解為游離的脂肪酸并作為線(xiàn)粒體氧化的燃料，同時(shí)誘導(dǎo)解偶聯(lián)蛋白-1的活性。在棕色脂肪線(xiàn)粒體中，豐富的UCP1活性加速了高氧化能力，這是發(fā)熱過(guò)程的核心[3]。解偶聯(lián)蛋白是位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)家族的成員，這些蛋白質(zhì)與能量消耗、生熱、游離脂肪酸的調(diào)節(jié)和活性氧的減少有關(guān)[4]。UCP屬于一類(lèi)線(xiàn)粒體內(nèi)膜(IMM)蛋白，在其作用下，IMM兩側(cè)可無(wú)跨膜質(zhì)子濃度差，下調(diào)由質(zhì)子濃度差介導(dǎo)的氧化磷酸化(OXPHOS)速度，對(duì)三磷酸腺苷(ATP)的生成造成干擾，UCP釋放效能的本質(zhì)在于解除局部正常呼吸鏈內(nèi)應(yīng)有的電子傳遞和磷酸化雙方的偶聯(lián)性，導(dǎo)致OXPHOS過(guò)程呈空轉(zhuǎn)狀態(tài)[5]。根據(jù)其功能分為：UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5[6]。解偶聯(lián)蛋白-1(Uncoupling protein-1,UCP1以前稱(chēng)為T(mén)hermogenin)是線(xiàn)粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)離子載體，由于UCP1在非顫動(dòng)產(chǎn)熱(NST)中的作用而被稱(chēng)之為熱生成素。大多數(shù)研究認(rèn)為，UCP1基因主要在脂肪組織中表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體通過(guò)UCP1蛋白的激活從而使能量代謝增加，該蛋白將質(zhì)子原動(dòng)力作為熱量散發(fā)。作為一種解偶聯(lián)蛋白，UCP1在長(zhǎng)鏈脂肪酸(FA)的存在下通過(guò)線(xiàn)粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)H+，這使棕色脂肪線(xiàn)粒體產(chǎn)生熱量[7]。延邊牛在抗寒適應(yīng)性上有著較好表現(xiàn)，現(xiàn)今還未明確UCP1參與延邊牛體溫調(diào)節(jié)與否。

20世紀(jì)70年代David nichollis和Daninel Ricquier 首先發(fā)現(xiàn)了UCP1基因[8]，且成功克隆并定位于4號(hào)染色體上，基因大小為13 kb，有6個(gè)外顯子，并發(fā)現(xiàn)其在人體內(nèi)主要表達(dá)于棕色脂肪組織內(nèi)。但現(xiàn)今已有學(xué)者證實(shí)，部分其他組織內(nèi)同樣表達(dá)UCP1，諸如胰腺、白色脂肪組織、胸腺、縱向平滑肌與骨骼肌[9]；目前，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)各物種的基因長(zhǎng)度、外顯子數(shù)目、編碼區(qū)長(zhǎng)度、表達(dá)區(qū)域都有一定的差異，小鼠的UCP1基因位于8號(hào)染色體中且長(zhǎng)度為8 109 bp、外顯子數(shù)目有6個(gè)、CDS區(qū)長(zhǎng)度為924 bp。山羊的UCP1位于17號(hào)染色體中且基因長(zhǎng)度為6 899 bp、外顯子數(shù)目有6個(gè)、CDS區(qū)長(zhǎng)度為918 bp。在進(jìn)一步探究UCP1基因下，其基因序列不斷在其他哺乳動(dòng)物內(nèi)被檢出。研究家畜領(lǐng)域，通過(guò)分析牛UCP1基因的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，(C+G)%的含量水平正向相關(guān)于動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境溫度，可見(jiàn)UCP1和?？购韵嚓P(guān)[10]。因此，本研究以延邊牛皮下脂肪組織為研究對(duì)象，克隆測(cè)序得到其UCP1的CDS區(qū)序列，同時(shí)針對(duì)此序列特征開(kāi)展生物信息學(xué)研究，了解UCP1基因在延邊牛不同組織中的表達(dá)變化，為延邊牛UCP1基因功能分析提供了新的數(shù)據(jù)，可有效指導(dǎo)延邊牛UCP1功能的深入研究。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于2020年11月，在延邊德海牧場(chǎng)選取3頭為20月齡的雌性延邊牛，借助無(wú)菌剪刀逐一提取其心、腿部肌肉、肝、皮下組織、脾、腎與肺作為組織樣品放入冷凍管中，至冷凍管內(nèi)，同時(shí)馬上移至液氮內(nèi)，放于實(shí)驗(yàn)室，存儲(chǔ)于冰箱(-80 ℃)內(nèi)。

1.2 主要試劑

核酸裂解液(Life)、GoldView I 型核酸染劑(Solarbio)、pMD18-T(TaKaRa)、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(TIANGEN)、熒光定量試劑盒(TIANGEN)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T4DNA Ligase、普通質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素、瓊脂糖、引物(均購(gòu)自與上海生工)。

1.3 儀器與設(shè)備

干式恒溫器(GL-1800)購(gòu)自海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司，小型臺(tái)式冷凍型離心機(jī)(5417R)購(gòu)自Eppendorf公司，超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)購(gòu)自Thermo公司，電泳儀(Model 300 V)購(gòu)自L(fǎng)ABNET公司，qRT-PCR儀(Mx3005P)購(gòu)自Agilent公司，梯度PCR儀(TC-5000)購(gòu)自TECHNE公司，多功能分子成像系統(tǒng)(型號(hào)Azure 600)購(gòu)自Azure Biosystems公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)合成

使用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank中已公布的牛UCP1基因(登錄號(hào)：KR711477.1)序列設(shè)計(jì)普通PCR(擴(kuò)增UCP1基因的CDS區(qū))及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，將管家基因GAPDH(登錄號(hào)NM_001034034.2)當(dāng)作內(nèi)參。表1所示為引物詳情，上海生工負(fù)責(zé)合成引物。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 延邊牛組織總RNA的提取及cDNA的合成

借助TRIzol Reagent試劑盒，同時(shí)遵循此試劑盒說(shuō)明，完成小塊脂肪組織標(biāo)本總RNA的提取，由超微量分光光度計(jì)輔助，對(duì)此RNA質(zhì)量(OD260/280)完成測(cè)定，對(duì)與要求相符的總RNA實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，存放于-20 ℃環(huán)境中，待用。逆轉(zhuǎn)錄采用天根FastKing一步法試劑盒，反轉(zhuǎn)錄體系為50 μL：Total RNA 5 μL,5×FastKing-RT SuperMIX 10 μL，RNase-free water 35 μL。

1.6 延邊牛UCP1基因CDS區(qū)克隆

將cDNA當(dāng)作模板，通過(guò)上述引物(表1)，并借助PCR法，對(duì)延邊牛UCP1基因CDS區(qū)實(shí)施擴(kuò)增。設(shè)定0.02 mL的PCR反應(yīng)總體系：cDNA模板(1 μg/μL)、正向引物(10 μmol/L)、負(fù)向引物(10 μmol/L)、2×Taq PCR MasterMixⅡ、RNase-free water 依次為2.0，0.5，0.5，10.0，7.0 μL。以下為擴(kuò)增步驟：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性0.5 min，58 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min；4 ℃ 1 min。待反應(yīng)結(jié)束，對(duì)0.01 mL反應(yīng)產(chǎn)物，開(kāi)展瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。經(jīng)由瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，完成與預(yù)期大小相符的PCR產(chǎn)物的回收。將回收所得目標(biāo)DNA片段連接pMD18-T載體，制備0.01 mL的連接反應(yīng)體系：目標(biāo)DNA片段4 μL(0.1 μmol/L)，pMD18-T載體1 μL(0.01 μmol/L)，10×T4DNA Ligase Buffer 4 μL，以及1 μL 的T4DNA連接酶于4 ℃下進(jìn)行一整夜連接，轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基實(shí)施涂布，經(jīng)由單菌落開(kāi)展擴(kuò)繁，再提取質(zhì)粒，同時(shí)PCR鑒定，生工生物(上海)負(fù)責(zé)對(duì)鑒定出的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.7 延邊牛UCP1基因生物信息學(xué)分析

采用Blast對(duì)印度牛(Bosindicus，登錄號(hào)：XM_019977126.1)、普通牛(Bostaurus,登錄號(hào)：NM_001166528.1)、綿羊(Ovisaries，登錄號(hào)：NM_001280694.1)、古猿(Odocoileusvirginianustexanus，登錄號(hào)：XM_020891215.1)、美洲草原野牛(Bisonbison，登錄號(hào)：XM_010830300.1)、南美羊駝(Vicugnapacos，登錄號(hào)：XM_031692232.1)、白犀(Ceratotheriumsimum，登錄號(hào)：XM_004426473.1)、東北虎(Pantheratigrisaltaica，登錄號(hào)：XM_007091783.2)進(jìn)行同源性對(duì)比分析，針對(duì)延邊牛UCP1對(duì)應(yīng)序列，借助表2所示在線(xiàn)軟件實(shí)施生物信息學(xué)分析。

表2 生物信息學(xué)軟件Tab.2 Bioinformatics software

1.8 延邊牛各組織相對(duì)表達(dá)量分析

將GAPDH當(dāng)作內(nèi)參基因，借助qRT-PCR對(duì)延邊牛每組織樣品內(nèi)UCP1基因相對(duì)表達(dá)水平展開(kāi)測(cè)定，反應(yīng)體系為20 μL：2×SuperReal Premixplus 10 μL，50×Rox Reference Dye 0.3 μL，正向、負(fù)向引物皆為0.6 μL(10 μmol/L)，另有1 μL 的cDNA模板(1 μg/μL)以及7.5 μL 的RNase-free ddH2O。各待檢樣品皆安排3個(gè)重復(fù)，以下為反應(yīng)步驟：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 32 s，循環(huán)35次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。借助2-ΔΔCT法，對(duì)所得數(shù)據(jù)開(kāi)展分析，將脾當(dāng)作對(duì)比組織。利用Graphpad軟件對(duì)UCP1基因在延邊牛不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，差異具顯著水平的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

借助超微量分光光度計(jì)，對(duì)RNA質(zhì)量(OD260/280之比)展開(kāi)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)此項(xiàng)指標(biāo)處于1.8～2.0，RNA結(jié)構(gòu)具良好完整性，未見(jiàn)DNA與蛋白污染，能夠參與后續(xù)研究。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)施瓊脂糖凝膠(1%)電泳分析，顯示出1條約750 bp的DNA片段(圖1)，在長(zhǎng)度上基本相符于預(yù)期DNA片段(長(zhǎng)度為749 bp)。

2.2 UCP1基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列分析結(jié)果 通過(guò)NCBI中Blast對(duì)延邊牛UCP1基因CDS區(qū)核苷酸序列與印度牛、普通牛、綿羊、古猿、美洲草原野牛、南美羊駝、白犀、東北虎的基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，延邊牛UCP1基因與印度牛的同源性為99.47%、普通牛97.40%、綿羊96.72%、古猿95.56%、美洲草原野牛97.40%、南美羊駝90.11%、白犀90.12%、東北虎88.29%?；诟魑锓N的UCP1基因編碼區(qū)核苷酸(Nt)序列，借助軟件MEGA 7.0完成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的制作，結(jié)果顯示，在親緣關(guān)系上，延邊牛和印度牛親緣關(guān)系最近，和南美羊駝最遠(yuǎn)(圖2)。

2.2.2 UCP1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 借助ProtParam在線(xiàn)工具分析延邊牛UCP1的理化屬性，發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為27.065 61 ku，理論等電點(diǎn)是8.92，蛋白分子式是C1206H1938N320O350S17，總原子數(shù)為3 831。UCP1基因共編碼249個(gè)氨基酸，氨基酸組成如表3所示，其中Val(V)最多，且不含Pyl(O)，氨基酸構(gòu)成為攜負(fù)電殘基(Asp+Glu)、正電殘基(Arg+Lys)的個(gè)數(shù)各為19，25個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)與消光系數(shù)依次是48.24，13 450，可見(jiàn)，此蛋白缺乏穩(wěn)定性，脂溶系數(shù)是91.53，網(wǎng)狀紅細(xì)胞(RBC)于體外的半衰期是30 h，總平均親水性(GRAVY)等于0.212，可見(jiàn)此蛋白具備一定親水性。

表3 UCP1蛋白的氨基酸組成Tab.3 Composition of amino acid of UCP1

借助在線(xiàn)軟件ProtScale，對(duì)延邊牛UCP1的疏水性展開(kāi)預(yù)測(cè)，獲得圖3所示結(jié)果，在UCP1所含氨基酸中，占比較高的為親水性殘基，總體顯示具親水性，此結(jié)果相符于軟件Protparam預(yù)測(cè)結(jié)果。

2.2.3 延邊牛UCP1蛋白的磷酸化位點(diǎn)與糖基化位點(diǎn) 在蛋白質(zhì)的功能與活性中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾發(fā)揮著十分關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其中最為廣泛的翻譯后修飾為蛋白質(zhì)的糖基化與磷酸化。借助Net Phos 3.1分析UCP1潛在的磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)UCP1所含磷酸位點(diǎn)總計(jì)21個(gè)，其中絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)與酪氨酸(Y)依次占11，9，1個(gè)(圖4)。分別借助NetNGlyc 1.0與NetOGlyc 4.0，對(duì)UCP1潛在的N-糖基化、O-糖基化位點(diǎn)展開(kāi)分析，發(fā)現(xiàn)O-糖基化位點(diǎn)有4個(gè)，所處位置為第5，7，104，241位氨基酸；N-糖基化潛在位點(diǎn)有3個(gè)，所處位置為第113，121位氨基酸。

2.2.4 延邊牛UCP1蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)及信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 借助在線(xiàn)軟件TMHMM 2.0Server，對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域展開(kāi)分析，發(fā)現(xiàn)此基因的編碼產(chǎn)物無(wú)跨膜螺旋(TMHs)結(jié)構(gòu)，跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的預(yù)測(cè)值19.008 57，蛋白質(zhì)前60個(gè)氨基酸的跨膜螺旋數(shù)預(yù)測(cè)值為10.980 09，位于膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的總概率22.995%(圖5)。

利用SignalP 4.1 Server在線(xiàn)軟件進(jìn)行分析，區(qū)分信號(hào)肽和非信號(hào)肽臨界值為D=0.450，UCP1預(yù)測(cè)D=0.158。參考信號(hào)肽假說(shuō)，判斷UCP1編碼蛋白無(wú)信號(hào)肽分布，是一類(lèi)非分泌蛋白(圖6)。

借助TargetP 1.1 Server與PSORT，對(duì)UCP1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，線(xiàn)粒體靶向肽(mTP)占比為0.029%，分泌通路信號(hào)位點(diǎn)(SP)占比為0.171%，同時(shí)不存在信號(hào)肽，故判斷其合成后未出現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)；UCP1的分布以細(xì)胞核為主(表4)。

表4 UCP1蛋白亞細(xì)胞定位Tab.4 Subcellular localization of UCP1 protein

2.2.5 UCP1蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 借助SOPMA軟件，對(duì)UCP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)預(yù)測(cè)，該序列主要是由α-螺旋、延伸鏈、無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角組成的混合型蛋白(圖7)。α-螺旋的氨基酸含量為134個(gè)，占比為54.03%；無(wú)規(guī)卷曲的氨基酸含量為68個(gè)，占比為27.42%；延伸鏈的氨基酸含量為32個(gè)，占比為12.90%；β-轉(zhuǎn)角的氨基酸含量為14個(gè)，占比為5.65%。利用ExPASy中 Swiss-model平臺(tái)構(gòu)建延邊牛UCP1蛋白可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖8)，全局模型質(zhì)量估計(jì)值為0.53，與模板相似性為65.45%。

2.3 UCP1基因在延邊牛不同組織間的差異表達(dá)

如圖9所示，對(duì)8個(gè)組織部位進(jìn)行UCP1基因表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UCP1基因在延邊牛的小腸和脂肪組織中表達(dá)量最高。在脾、腎臟中也有較高的相對(duì)表達(dá)量且差異顯著(P<0.05)，腿部肌肉和心臟表達(dá)量相對(duì)較低，且無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

解偶聯(lián)蛋白1在棕色脂肪和白色脂肪中[11],它是屬于線(xiàn)粒體陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的解偶聯(lián)蛋白亞家族中研究最多的載體[12]。UCP1是20世紀(jì)70年代中期在倉(cāng)鼠、大鼠和豚鼠棕色脂肪的線(xiàn)粒體中發(fā)現(xiàn)的[13]。UCP1被多項(xiàng)研究視為唯一的“真正的”解偶聯(lián)蛋白[14-15]，因?yàn)槿绻诤涞沫h(huán)境下在哺乳動(dòng)物中上調(diào)其質(zhì)子梯度，則會(huì)耗散線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子梯度，從而產(chǎn)生大量熱量。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，UCP1活性在褐色脂肪細(xì)胞中得到很好的調(diào)節(jié)，在寒冷環(huán)境暴露或過(guò)量喂養(yǎng)時(shí)，UCP1活性被誘導(dǎo)，從而促進(jìn)了適應(yīng)性生熱作用[16]。Riley等[17]證明了去甲腎上腺素誘導(dǎo)的產(chǎn)熱依賴(lài)于UCP1的存在，當(dāng)下丘腦中傳遞冷感時(shí)，兒茶酚胺會(huì)從交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放出來(lái)，從而激活褐色脂肪細(xì)胞的腎上腺素受體，進(jìn)而刺激依賴(lài)cAMP的蛋白激酶PKA，從而導(dǎo)致三酰甘油脂肪酶的活化，從而增加脂解作用。經(jīng)由脂解效應(yīng)釋放的游離脂肪酸(FFA)激活UCP1。激活后，UCP1使ATP合成的電化學(xué)質(zhì)子梯度短路，從而刺激電子傳輸并增強(qiáng)呼吸作用?？衫玫牡孜锶紵a(chǎn)生熱量并通過(guò)血液循環(huán)散發(fā)到身體的其他部位[18-19]。

本研究以延邊牛皮下脂肪組織為材料成功克隆出UCP1基因，并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，延邊牛UCP1蛋白理化性質(zhì)不穩(wěn)定，且親水性殘基多于疏水性殘基，所以該蛋白是親水性蛋白。參考信號(hào)肽假說(shuō)，判斷UCP1編碼蛋白無(wú)信號(hào)肽分布，是一類(lèi)非分泌蛋白。UCP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，此相符于其轉(zhuǎn)錄模式。蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTM)過(guò)程很復(fù)雜，其中羥基化、磷酸化、泛素化、甲基化與乙酰化等較為常見(jiàn)[20]。蛋白質(zhì)PTM是指，在mRNA翻譯后形成蛋白質(zhì)環(huán)節(jié)的一類(lèi)化學(xué)修飾。具體可理解為，在蛋白質(zhì)合成環(huán)節(jié)，受到修飾酶的作用，部分生化功能性基團(tuán)(碳水化合物、磷酸基、脂類(lèi)、乙?；c糖類(lèi)等)和蛋白質(zhì)骨架(或側(cè)鏈)共價(jià)結(jié)合。蛋白質(zhì)PTM可使蛋白質(zhì)的生理活性、成熟度、物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)類(lèi)型增多，功能更完善、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、作用更專(zhuān)一、調(diào)控更精準(zhǔn)，對(duì)于細(xì)胞活動(dòng)發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。經(jīng)預(yù)測(cè)延邊牛UCP1蛋白PTM，發(fā)現(xiàn)潛在磷酸化位點(diǎn)有 21個(gè)，O端糖基化位點(diǎn)有4個(gè)，這些修飾能夠經(jīng)由將新基團(tuán)連接上特定氨基酸側(cè)鏈途徑，使蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

大部分研究顯示，UCP1在棕色脂肪(BAT)的線(xiàn)粒體內(nèi)特異表達(dá)，為成熟BAT特異性的產(chǎn)熱基因[21]。本試驗(yàn)通過(guò)Real-time PCR定量分析延邊牛不同組織中UCP1基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，UCP1基因表達(dá)卻在小腸較多。孫國(guó)權(quán)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，UCP1基因在西門(mén)塔爾牛各組織內(nèi)皆存在表達(dá)，但就表達(dá)水平而言，背膘相較其他組織皆偏高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，UCP1與產(chǎn)熱同維持體溫相關(guān)。趙丹等[23]的研究結(jié)果顯示，UCP1基因于牦牛腎內(nèi)表達(dá)水平相較其他組織顯著偏高。說(shuō)明UCP1基因不僅在不同物種中表達(dá)規(guī)律有所差異，而且在不同品種間表達(dá)規(guī)律也有差異。這可能由于UCP1基因的表達(dá)受能量、動(dòng)物年齡、暴露溫度、胰島素等因素的影響[24-26]。因現(xiàn)今僅有少量研究涉及延邊牛UCP1基因分析，未找到其確切的功能與調(diào)控機(jī)制，需開(kāi)展更為深入的探究。

此項(xiàng)研究以延邊牛脂肪組織為材料，進(jìn)行UCP1完整CDS區(qū)的克隆，其呈749 bp大小，編碼氨基酸量為249個(gè)，為親水性蛋白，所含磷酸化、O-糖基化、N-糖基化潛在位點(diǎn)的量依次為21，4，3個(gè)，無(wú)信號(hào)肽。預(yù)測(cè)UCP1蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其屬于混合型蛋白，構(gòu)成以α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈與無(wú)規(guī)卷曲為主。RT-PCR結(jié)果表明，延邊牛小腸組織內(nèi)的UCP1基因表達(dá)水平最高，其次為脂肪和脾組織。此研究發(fā)現(xiàn)可為延邊牛UCP1蛋白性質(zhì)與更為深入分析此基因功能給予指導(dǎo)。