李俊辰 ，申倩 ，馬育曉 ，林海月 ，張宇

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，治療困難，常罹患終身[1]。目前，銀屑病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率大約是0.1%～3.0%，且在持續(xù)升高，而發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此全球?qū)τ阢y屑病的研究仍在進(jìn)一步探索[2]。

藥物配伍是中醫(yī)臨證組方過程中的重要環(huán)節(jié)之一，“藥對”就是藥物配伍的一種重要體現(xiàn)?！八帉Α蹦軌蛲ㄟ^藥物之間的配合而達(dá)到超過單味藥功效的效果[3]。“土茯苓-茵陳”藥對是中國中西醫(yī)結(jié)合治療皮膚病奠基人邊天羽教授治療銀屑病的常用“藥對”。銀屑病系列藥方以土茯苓、茵陳作為君藥，發(fā)揮清熱祛濕的作用，佐以其他藥物，臨床治療銀屑病的效果顯著[4]，因此，“土茯苓-茵陳”藥對是治療銀屑病的系列藥方中的核心組分，下文簡稱為核心組分。

中醫(yī)藥重視藥物之間的配伍關(guān)系，在臨床上常多種中藥同時使用發(fā)揮功效，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有整體性、系統(tǒng)性等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于篩選中藥活性成分、闡釋中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制、老藥新用、中藥方劑主成分與配伍關(guān)系等方面的研究[5]。本文將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探索核心組分治療銀屑病的作用機(jī)制。

1 資料方法

1.1 核心組分化合物及作用靶點(diǎn)的篩選 釆用TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），以土茯苓、茵陳為關(guān)鍵詞，口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，收集并篩選出核心組分的活性化合物及其作用靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的確定 利用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）、Genecards（https：//www.genecards.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）以及藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）疾病數(shù)據(jù)庫，以銀屑病為關(guān)鍵詞，高相關(guān)性為標(biāo)準(zhǔn)，篩選匯總疾病的高關(guān)聯(lián)度靶點(diǎn)。

1.3 疾病-化合物共同靶點(diǎn)的篩選 利用VennPainter軟件，將核心組分化合物的作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，篩選出二者共同的作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將核心組分中的化合物、銀屑病以及二者的共同靶點(diǎn)蛋白上傳至 Cytoscape軟件（http：//www.cytoscape.org/）生成體現(xiàn)藥物-共同靶點(diǎn)-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，以探究核心組分的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 利用String（https：//string-db.org/）蛋白互作數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析共同靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用，并用R語言進(jìn)行計數(shù)分析。

1.6 基因功能注釋（GO）功能富集分析 利用Cytoscape軟件對共同靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，以了解共同靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，通過Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com/tools/index，php/）對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.7 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用 David（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件將共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，對共同靶點(diǎn)蛋白在信號通路中的作用做注釋分析，得到核心組分治療銀屑病的信號通路，通過Omicshare軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.8 主要化合物-共同靶點(diǎn)分子對接 為了進(jìn)一步驗(yàn)證靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果的可靠性，對篩選所得的主要化合物及主要相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org）下載主要相關(guān)靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載主要化合物結(jié)構(gòu)，使用DockThor軟件將主要化合物與主要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 核心組分化合物及作用靶點(diǎn)的篩選 利用TCMSP分別查找核心組分的化合物及作用靶點(diǎn)，經(jīng)過整理，核心組分活性化合物共有26種，其中土茯苓15種、茵陳13種（二者共有的化合物為槲皮素、β-谷甾醇），見表1。查找核心組分中化合物的靶點(diǎn)，通過篩選，共有103個化合物作用靶點(diǎn)。

表1 核心組分中26個候選化合物的基本信息

2.2 疾病靶點(diǎn)及藥物-疾病共同靶點(diǎn)的確定 利用OMIM、Genecard、PharmGkb以及TTD疾病數(shù)據(jù)庫，匯總、去重后篩選出1 475個疾病靶點(diǎn)。結(jié)合化合物的103個靶點(diǎn)，利用VennPainter軟件，分析得出核心組分與銀屑病的共同靶點(diǎn)有44個。

2.3 藥物-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-共同靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中一共有68個節(jié)點(diǎn)，包括1個銀屑病節(jié)點(diǎn)（紅色）、1個核心組分節(jié)點(diǎn)（黃色三角）、2個土茯苓、茵陳節(jié)點(diǎn)（黃色橢圓）、44個共同靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)（粉色）、20個化合物節(jié)點(diǎn)（綠色），其中，有6種化合物由于與藥物-疾病共同靶點(diǎn)沒有聯(lián)系，因此未參與網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。在20種化合物中，包括土茯苓的9種化合物、茵陳的13種化合物，其中二者共同包含的化合物是槲皮素和β-谷甾醇，說明這2種化合物在核心組分組成中占到重要地位。調(diào)控的靶點(diǎn)數(shù)目排前5位的化合物是槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、異鼠李素，說明這些化合物在核心組分治療銀屑病中起主要作用。化合物調(diào)控的靶點(diǎn)數(shù)目前4位是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（PTGS）-1、絲氨酸蛋白酶（PRSS）-1、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）-γ、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞過多癥病毒癌基因同源物（REL）-A，是核心組分治療銀屑病的主要靶點(diǎn)。

圖1 藥物-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析共同靶點(diǎn)蛋白之間的相互關(guān)系，選擇高可信度（0.700），并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)：ATP結(jié)合盒C亞家族成員（ABCC）-1、PRSS-1、乙酰膽堿酯酶（ACHE）。節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，之間的連線表示蛋白質(zhì)之間相互作用的證據(jù)，見圖2。PPI計數(shù)排名前3位的靶點(diǎn)是白細(xì)胞介素（IL）-6、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A、表皮生長因子受體（EGFR），相互關(guān)系計數(shù)越多，說明該靶點(diǎn)在核心組分治療銀屑病中起更為重要的作用，見圖3。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI計數(shù)

2.5 GO功能富集分析 對核心成分化合物和銀屑病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)了697條結(jié)果，利用Omicshare軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理，展示前20個共同的基因功能，見圖4。排名前5位的分別是對氧水平的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、對低氧水平的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)以及對活性氧代謝過程的反應(yīng)。

圖4 GO功能富集

2.6 KEGG通路富集分析 對核心組分化合物與銀屑病的共同靶點(diǎn)利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05進(jìn)行篩選，并將結(jié)果利用Omicshare軟件可視化，見圖5。信號通路主要包括在糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、流體剪切損傷和動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染通路、結(jié)腸癌通路、癌癥蛋白多糖通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、腫瘤MicroRNAs通路、肝細(xì)胞癌通路、人巨細(xì)胞病毒感染通路、前列腺癌通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶 B（Akt）信號通路、低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、乙型肝炎、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、酪氨酸激酶受體（ErbB）信號通路、松弛素信號通路、細(xì)胞程序性死亡-配體1（PD-L1）表達(dá)和程序性細(xì)胞死亡蛋白（PD）-1檢查點(diǎn)信號通路、麻疹、丙型肝炎。

圖5 KEGG通路富集分析

2.7 主要化合物-主要靶點(diǎn)分子對接 將主要化合物槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素與主要靶點(diǎn)IL-6、VEGF-A、EGFR兩兩組合，進(jìn)行分子對接，見表2。根據(jù)DockThor結(jié)果顯示β-谷甾醇與IL-6，槲皮素、柚皮素與VEGF-A之間的分子結(jié)構(gòu)無法實(shí)現(xiàn)對接，證明二者之間可能不存在相互作用。當(dāng)配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定時，能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，根據(jù)最低結(jié)合能的結(jié)果顯示，排名前3位的是槲皮素與EGFR、β-谷甾醇與EGFR、β-谷甾醇與VEGF-A，見圖6。

圖6 主要化合物與主要靶點(diǎn)對接示意圖

表2 主要化合物-主要靶點(diǎn)對接最低結(jié)合能（kcal/mol）

3 討論

3.1 核心組分主要化合物對銀屑病的作用 根據(jù)TCMSP分析結(jié)果顯示，核心組分包含活性化合物共有26種，其中土茯苓15種、茵陳13種（二者共有的化合物為槲皮素、β-谷甾醇）。根據(jù)藥物-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)顯示，核心組分中起主要作用的化合物是槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、異鼠李素。

已有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病的主要病理改變是角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖[6]。Src家族酪氨酸激酶（SFK）是觸發(fā)細(xì)胞生長和分化信號通路的關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠通過與SFK分子結(jié)合，調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的生長[7]。β-谷甾醇的調(diào)控靶點(diǎn)數(shù)目僅次于槲皮素，其能夠抑制皮膚的炎性反應(yīng)，減少TNF、IL-1β和IL-6的釋放，改善銀屑樣特征性皮損[8]。柚皮素可以抑制IL-6的過度表達(dá)，減輕銀屑病皮損部位的炎性反應(yīng)[9]。此外，柚皮素可以降低銀屑病治療用藥甲氨蝶呤的肝毒性，減少不良反應(yīng)[10]。薯蕷皂苷元能通過阻滯細(xì)胞周期和降低核因子（NF）-κB水平而抑制人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞生長，同時通過調(diào)節(jié)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且通過抑制Toll樣受體（TLR）-4髓樣分化因子（Myd88）途徑下調(diào)促炎性細(xì)胞因子，此外，薯蕷皂苷元通過降低角質(zhì)形成細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)而部分抑制血管形成，因此，薯蕷皂苷元能從多個方面減輕銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[11]。目前，異鼠李素對銀屑病的作用機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護(hù)器官、預(yù)防肥胖等作用，相關(guān)機(jī)制包括調(diào)節(jié)PI3K-AKT、NF-κB、MAPK 等信號通路以及相關(guān)細(xì)胞因子和激酶的表達(dá)[12]。因此可推測異鼠李素可能通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，減輕皮損炎性反應(yīng)來治療銀屑病，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 核心組分與銀屑病主要共同靶點(diǎn)對銀屑病的作用 根據(jù)藥物-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)顯示，化合物調(diào)控的靶點(diǎn)數(shù)目前4位是PTGS-1、PRSS-1、PPAR-G、REL-A。

PTGS-1在銀屑病中的作用主要體現(xiàn)在導(dǎo)致血管內(nèi)皮生成異常，和增強(qiáng)內(nèi)皮的炎性反應(yīng)2個方面[13-14]。PRSS-1是肽酶S1家族中的一員，S1家族在銀屑病的炎性反應(yīng)中起重要作用，但PRSS-1對銀屑病的具體機(jī)制尚不明確，可能與炎性反應(yīng)密切相關(guān)[15]。PPAR-G是PPAR脂肪酸代謝中的關(guān)鍵基因，研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者的皮損組織與健康人皮膚組織相比，包含PPAR-G在內(nèi)的7個PPAR脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)都降低，說明銀屑病的發(fā)生不僅與免疫相關(guān)，也與各種代謝途徑相關(guān)[16]。REL-A屬于NF-κB家族，研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB能夠與TNF-α聯(lián)合作用影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展[17]。

3.3 核心組分治療銀屑病的作用方向及信號通路 KEGG信號通路富集分析可以看出核心組分治療銀屑病的信號通路主要集中在氧水平、免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化等方面。銀屑病的病理特征包括角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和/或關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的炎性反應(yīng)，以及微血管的異常新生，其中角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖，會導(dǎo)致表皮細(xì)胞對氧的需求增加。與健康人相比，銀屑病患者表皮組織的HIF-1α表達(dá)顯著增加[18]。獲得2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎“氧感知通路”反映了生物體對氧的反應(yīng)機(jī)制，同時也提示醫(yī)者銀屑病的發(fā)生發(fā)展是否與其有密不可分的關(guān)系。從現(xiàn)有的文獻(xiàn)來看，在皮膚損傷或感染后，病原體相關(guān)分子模式被TLR識別[19]。在角質(zhì)形成細(xì)胞中，NF-κB被TLR激活，并易位至核內(nèi)，以誘導(dǎo)人源抗菌肽（LL-37）和HIF-1α表達(dá)[20]。LL-37通過抑制泛素連接酶-E3對HIF-1α的水解，而增加HIF-1α的水平[21-23]。而后HIF-1α通過HIF-1α/VEGF/Akt/eNOS通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生成，引發(fā)銀屑病[24-25]。另一方面，NF-κB與IL-36共同作用，通過IL-6影響Th17/Treg平衡產(chǎn)生更多的Th17細(xì)胞[26]。Th17細(xì)胞活化后通過STAT3/HIF-1α/RORγt/IL-17通路產(chǎn)生IL-17[27-28]。IL-17可通過調(diào)控絲聚合蛋白的表達(dá)，引起角質(zhì)形成細(xì)胞的角化不全[29]。綜上所述，HIF-1α相關(guān)通路在角質(zhì)形成細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞與Th17細(xì)胞的病理改變中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，進(jìn)而引起了角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖、血管新生異常活躍與一系列炎性反應(yīng)瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，因此，銀屑病的發(fā)生可能與HIF-1α相關(guān)通路密切相關(guān)。通過GO富集分析可以發(fā)現(xiàn)，核心組分治療銀屑病的作用主要體現(xiàn)在氧感知方面，同時KEGG富集結(jié)果中MAPK、HIF-1α、PI3K-AKT等信號通路均與氧感知相關(guān)，這說明核心組分對銀屑病的治療主要表現(xiàn)在對氧感知相關(guān)通路的調(diào)控上。

“土茯苓-茵陳”藥對是邊天羽教授治療銀屑病的系列藥方中的核心組分，臨床有良好的療效，但是藥理研究報道較少，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了“土茯苓-茵陳”藥對治療銀屑病多成分-多靶點(diǎn)-多通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，研究結(jié)果分析了“土茯苓-茵陳”藥對治療銀屑病的活性成分和分子機(jī)制，為進(jìn)一步開展“土茯苓-茵陳”藥對治療銀屑病作用機(jī)制的研究提供了科學(xué)依據(jù)。