楊慧，曹麗麗，趙繼萍，劉曉菲，潘云，徐嘉蔚，董亮

1 山東大學齊魯醫(yī)學院，濟南250012；2 山東省千佛山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科；3 臨沂市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科；4 山東大學齊魯醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病[1]。一項最新的調(diào)查顯示，我國20歲及以上人群哮喘的患病率為4.2%[2]，哮喘已經(jīng)成為嚴重影響我國居民健康的公共衛(wèi)生問題之一。氣道慢性炎癥被認為是哮喘的基本病理改變和反復發(fā)作的主要病理生理機制，表現(xiàn)為IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細胞因子釋放增多以及嗜酸性粒細胞(EOS)浸潤、黏液分泌增多和免疫球蛋白E(IgE)產(chǎn)生[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠2型固有淋巴細胞(ILC2s)顯著增多，而ILC2s是Th2型細胞因子的重要來源，能夠與Th2型細胞因子共同參與哮喘的發(fā)病過程[4-5]。但既往ILC2s與哮喘關系的研究多停留在動物模型實驗階段，相關的臨床研究較少。本研究觀察了不同類型哮喘患者外周血ILC2s變化，并探討其臨床意義。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年11月—2019年9月山東大學齊魯醫(yī)院收治的哮喘患者46例。根據(jù)抗原特異性IgE(sIgE)水平[1，6-7]分為過敏性哮喘(AA，sIgE≥0.35 kUA/L)21例(AA組)、非過敏性哮喘(NAA，sIgE<0.35 kUA/L)25例(NAA組)，根據(jù)外周血EOS計數(shù)[2，8]分為嗜酸性粒細胞性哮喘(EA，EOS計數(shù)≥0.3×109/L)24例(EA組)、非嗜酸性粒細胞性哮喘(NEA，EOS計數(shù)<0.3×109/L)22例(NEA組)。所有哮喘患者符合2018年全球哮喘倡議[7]和我國《支氣管哮喘診治指南》[1]中的診斷標準。納入標準：①符合哮喘診斷標準；②入組前至少4周未接受過抗哮喘藥物治療，如支氣管擴張劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑、茶堿類藥物等。排除標準：①年齡<18歲或>65歲者；②合并其他肺部疾病者，如支氣管擴張癥、間質(zhì)性肺疾病、肺良惡性腫瘤等；③合并心、肝、腦、腎等重要臟器嚴重疾病者；④合并免疫系統(tǒng)疾病者；⑤妊娠期或哺乳期婦女。AA組男12例、女9例，年齡19～65(43.19±15.09)歲，BMI(23.64±3.49)kg/m2；NAA組男10例、女15例，年齡25～65(47.44±10.42)歲，BMI(25.66±2.86)kg/m2。EA組男10例、女14例，年齡22～65(45.33±12.68)歲，BMI(24.71±3.19)kg/m2；NEA組男12例、女10例，年齡19～65(45.68±13.21)歲，BMI(24.76±3.47)kg/m2。同期隨機選取在山東大學齊魯醫(yī)院體檢健康的志愿者13例(NC組)，均無變應性疾病史或過敏史，近3個月內(nèi)無感染史或用藥史。其中，男4例、女9例，年齡23～65(42.69±13.57)歲，BMI 26.30(23.15，28.20)kg/m2。AA組、NAA組、NC組基本臨床資料具有可比性，EA組、NEA組、NC組基本臨床資料亦具有可比性。本研究經(jīng)山東大學齊魯醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[批準號：KYLL-2017(KS)-112]，所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 外周血ILC2s檢測 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血2 mL，置于含EDTA的真空采血管中。取100 μL于1.5 mL EP管中，加入紅細胞裂解液300 μL，充分混勻，冰上靜置15 min。4 ℃下450×g離心10 min(離心半徑99 mm)，棄上清液，向沉淀中加入紅細胞裂解液200 μL，充分混勻。以相同條件再次離心，棄上清液。向沉淀中加入PBS 1 mL重懸，4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向沉淀中加入人Fc受體結合抑制劑20 μL，充分混勻，室溫靜置15 min。4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向沉淀中加入PBS 1 mL重懸，4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向沉淀中分別加入FITC-Lin抗體20 μL、PE/Cy5-CD127抗體5 μL、PE-CRTH2抗體5 μL和PBS 70 μL，充分混勻，室溫避光孵育15 min。取上述混合液100 μL加入PBS 1 mL重懸，4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向所得沉淀中加入PBS 1 mL重懸，重懸液經(jīng)300目一次性過濾網(wǎng)過濾，將濾出液轉移至新的離心管中。2 h內(nèi)上流式細胞儀檢測，分選Lin-CD127+CRTH2+的淋巴細胞并定義為ILC2s[6]，所得數(shù)據(jù)用FlowJo軟件進行分析。

1.3 血清sIgE檢測 采集哮喘患者清晨空腹外周靜脈血2 mL，4 ℃下3 000 r/min離心10 min(離心半徑99 mm)，留取上層血清，采用ELISA法檢測血清sIgE。

1.4 血漿總免疫球蛋白E(tIgE)、IL-5、IL-13檢測 采集哮喘患者清晨空腹外周靜脈血2 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下5 500 r/min離心15 min(離心半徑99 mm)，留取上層血漿。采用ELISA法檢測血漿tIgE、IL-5、IL-13。

1.5 EOS檢測 采集哮喘患者清晨空腹外周靜脈血2 mL，經(jīng)全自動血細胞分析儀檢測EOS數(shù)量。

1.6 肺功能檢測 哮喘患者入組當日采用肺功能測試儀檢測第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%pred)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)。

2 結果

2.1 AA患者和NAA患者外周血ILC2s變化及其與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平以及EOS計數(shù)、FEV1%pred、FEV1/FVC的關系

2.1.1 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平和EOS計數(shù)以及FEV1%pred、FEV1/FVC比較 見表1、2。

表1 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13水平及EOS計數(shù)比較

表2 三組外周血sIgE、tIgE水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比較

2.1.2 AA患者和NAA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE以及EOS計數(shù)、FEV1%pred、FEV1/FVC的關系 AA患者和NAA患者外周血ILC2s與IL-5(r分別為0.86、0.74)、IL-13(r分別為0.53、0.57)和EOS計數(shù)(r分別為0.76、0.84)均呈正相關關系(P均<0.05)，與sIgE(r分別為-0.01、0.10)、tIgE(r分別為-0.12、0.38)和FEV1/FVC(r分別為-0.24、-0.34)均無明顯相關性(P均>0.05)。AA患者外周血ILC2s與FEV1%pred無明顯相關性(r=-0.30，P>0.05)，而NAA患者外周血ILC2s與FEV1%pred呈負相關關系(r=-0.41，P<0.05)。

2.2 EA患者和NEA患者外周血ILC2s變化及其與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平以及EOS計數(shù)、FEV1%pred、FEV1/FVC的關系

2.2.1 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平和EOS計數(shù)以及FEV1%pred、FEV1/FVC比較 見表3、4。

表3 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13水平及EOS計數(shù)比較[M(P25，P75)]

表4 三組外周血sIgE、tIgE水平和FEV1%pred、FEV1/FVC比較

2.2.2 EA患者和NEA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE和EOS計數(shù)以及FEV1%pred、FEV1/FVC的關系 EA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、tIgE和EOS計數(shù)均呈正相關關系(r分別為0.67、0.65、0.61、0.70，P均<0.05)，與FEV1%pred呈負相關關系(r=-0.52，P<0.05)，而與sIgE、FEV1/FVC無明顯相關性(r分別為0.12、-0.37，P>0.05)。NEA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE和EOS計數(shù)以及FEV1%pred、FEV1/FVC均無明顯相關性(r分別為0.39、-0.25、0.28、0.14、0.25、0.22、0.17，P均>0.05)。

3 討論

近年來，哮喘的發(fā)病率和病死率持續(xù)上升，已成為全球第二大致死和致殘疾病[9]。目前，越來越多學者認為哮喘是一種異質(zhì)性肺病綜合征[10]，根據(jù)臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制不同，可分為不同的表型和內(nèi)型。如根據(jù)致病因素不同分為AA、NAA以及自發(fā)性哮喘[11]，根據(jù)氣道主要浸潤的炎癥細胞不同分為EA和NEA。這種不同的表型或內(nèi)型，使哮喘的臨床表現(xiàn)、嚴重程度以及對治療的反應性存在明顯差別。

ILC2s是由骨髓造血干細胞分化而來的，最早由MJOSBERG等[12]在健康嬰幼兒和成人腸道、肺、外周血中發(fā)現(xiàn)的一種CRTH2+lin-CD127+CD45+固有淋巴樣細胞，其在IL-2、IL-25、IL-33等刺激下可分泌大量IL-13。有研究報道，哮喘患者誘導痰中ILC2s明顯升高[8]。在哮喘小鼠肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)ILC2s明顯升高，并證實ILC2s是IL-5、IL-13的重要來源細胞[3,13]。結果提示，ILC2s和Th2型細胞因子在哮喘發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。

AA是指接觸花粉、塵螨、過冷空氣等過敏原導致Th2型細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-13)水平升高，從而引起的一種氣道慢性炎癥性疾病，早期被認為是一種適應性Th2細胞介導的免疫反應[5]。但HALIM等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ILC2s與Th2型細胞因子共同介導AA的發(fā)病過程，并且即使不依賴于適應性免疫應答，ILC2s仍可誘導IL-5、IL-13產(chǎn)生，提示固有免疫在AA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。NAA通常被認為是由非Th2型免疫反應介導，具有成人遲發(fā)性發(fā)病的特點。但國外一項研究發(fā)現(xiàn)，NAA患者外周血ILC2s顯著高于健康志愿者[15]。提示ILC2s可能參與NAA的發(fā)病過程。本研究AA患者外周血ILC2s明顯高于健康志愿者，并且外周血ILC2s與IL-5、IL-13呈正相關關系，與既往研究[14]結果一致。提示ILC2s可能通過介導Th2型細胞因子IL-5、IL-13產(chǎn)生，參與AA的發(fā)病過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，AA患者外周血IL-13水平較NAA患者和健康志愿者顯著升高，而外周血IL-5水平雖然高于健康志愿者，但與NAA患者比較差異無統(tǒng)計學意義。說明IL-13可能在AA的發(fā)病過程中具有更為重要的作用。TANG等[16]在非變應性哮喘患者肺泡灌洗液、外周血單核細胞中均發(fā)現(xiàn)IL-5水平升高。本研究結果亦發(fā)現(xiàn)，NAA患者外周血ILC2s、IL-5水平均高于健康志愿者。提示IL-5可能參與NAA的發(fā)病過程。sIgE和tIgE是由B細胞分化成的漿細胞分泌產(chǎn)生的免疫球蛋白。本研究AA患者外周血sIgE、tIgE水平均高于NAA患者，但AA患者和NAA患者外周血sIgE、tIgE水平均與外周血ILC2s無明顯相關性，提示ILC2s可能與變應反應無明顯關系。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，AA患者與NAA患者FEV1%pred、FEV1/FVC比較差異均無統(tǒng)計學意義，并且FEV1/FVC與外周血ILC2s無明顯相關性，AA患者外周血ILC2s與FEV1%pred無明顯相關性，而NAA患者外周血ILC2s與FEV1%pred呈負相關關系。我國《支氣管哮喘診治指南》將哮喘分為間歇狀態(tài)、輕度持續(xù)、中度持續(xù)、重度持續(xù)4級，而FEV1%pred是評價哮喘嚴重程度分級的重要指標[1]。由此可見，ILC2s或能反映哮喘嚴重程度。

SMITH等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EA在大劑量糖皮質(zhì)激素作用下，ILC2s仍可通過局部不受控制地產(chǎn)生Th2型細胞因子IL-5、IL-13，從而促進哮喘患者EOS持續(xù)增多。但臨床鮮見ILC2s與NEA關系的報道。本研究EA患者外周血ILC2s、IL-5水平顯著高于NEA患者，但血漿IL-13水平與NEA患者比較差異無統(tǒng)計學意義。提示IL-5在EA的發(fā)病過程中可能具有重要作用。而NEA患者外周血ILC2s和Th2型細胞因子水平與健康志愿者比較差異均無統(tǒng)計學意義，說明NEA可能是一種非Th2型、非ILC2s介導的免疫反應。本研究EA患者外周血EOS計數(shù)顯著高于NEA患者，進一步證實EA存在高嗜酸性粒細胞血癥狀態(tài)。EA患者與NEA患者外周血sIgE、tIgE水平比較差異均無統(tǒng)計學意義，但EA患者外周血ILC2s與外周血tIgE水平呈正相關關系。提示ILC2s或能參與調(diào)控tIgE產(chǎn)生。此外，EA患者與NEA患者FEV1%pred比較差異無統(tǒng)計學意義，EA患者FEV1/FVC明顯低于NEA患者；相關性分析發(fā)現(xiàn)，EA患者外周血ILC2s與FEV1%pred呈負相關關系，與FEV1/FVC無明顯相關性，NEA患者外周血ILC2s與FEV1%pred、FEV1/FVC均無明顯相關性。但這并不能說明EA患者與NEA患者存在肺功能差異，需要進一步驗證。

綜上所述，外周血ILC2s可能通過介導Th2型細胞因子產(chǎn)生，參與AA、NAA和EA的發(fā)病過程，并可作為評估哮喘嚴重程度的指標，但其對NEA發(fā)病的影響不大。