黃水林 何 明

(深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測(cè)科技有限公司，廣東 深圳 518040)

B族維生素是人體內(nèi)一類(lèi)重要的水溶性維生素，在人體代謝的甲基化、三羧酸循環(huán)等過(guò)程中，起著非常重要的作用，如果攝入不夠或者過(guò)量均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的代謝難以進(jìn)行，從而產(chǎn)生疾病[1-3]。有研究[4]表明，高蛋氨酸、低葉酸和維生素B6、B12的飲食可能與netrin-1的表觀遺傳沉默導(dǎo)致的記憶喪失有關(guān)。而B(niǎo)族維生素在嬰兒的正常發(fā)育中至關(guān)重要[5-6]，如果攝入不足，可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[7]。

GB 10765—2010和GB 10767—2010對(duì)嬰幼兒奶粉中允許添加的8種B族維生素給出了明確的限量。目前關(guān)于嬰幼兒奶粉及配方食品中B組維生素的分析方法主要集中在光譜分析法[8-9]、色譜分析法[10]、色譜質(zhì)譜分析法[11-13]和微生物法[14-16]。光譜分析法無(wú)分離步驟，每次只能測(cè)定一種目標(biāo)物且受雜質(zhì)影響較大。色譜分析法可同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)物，但目標(biāo)物數(shù)量太多，分離難度較大。微生物法步驟便捷，檢測(cè)快速，但檢測(cè)成本較高。質(zhì)譜法則具有目標(biāo)物選擇性高，檢出限低和多種化合物準(zhǔn)確定性定量的優(yōu)點(diǎn)，科研工作者也進(jìn)行了相關(guān)研究，如陳美君等[12]建立了同時(shí)測(cè)定11種水溶性維生素的串聯(lián)質(zhì)譜法，但未使用內(nèi)標(biāo)物對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正；嚴(yán)華等[13]所建立的方法，雖然使用了內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，但測(cè)定10種水溶性維生素，需要使用兩種離子化模式，并要切換流動(dòng)相組成，分析時(shí)間較長(zhǎng)。研究擬使用直接超聲提取，等電點(diǎn)沉淀蛋白的前處理方法，建立一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的10種水溶性維生素B的方法，為嬰幼兒食品中多種維生素的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

質(zhì)譜儀：API4000Q TRAP型，美國(guó)AB SCIEX公司；

液相色譜系統(tǒng)：LC-30AD型，日本島津公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Advantage A10型，法國(guó)Merck Millipore公司；

高速冷凍離心機(jī)：1-14K型，德國(guó)Sigma公司；

渦旋混勻器：IKA MS3型，德國(guó)IKA公司。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：泛酸(純度≥95.8%)、煙酸(純度≥98.5%)、煙酰胺(純度≥98.0%)、葉酸(純度≥91.3%)、吡哆醛(純度≥98.0%)、吡哆醇(純度≥98.5%)、吡哆胺(純度≥98.2%)、硫胺素(純度≥98.0%)、核黃素(純度≥98.5%)、生物素(純度≥99%)，德國(guó)Dr公司；

內(nèi)標(biāo)物：泛酸-D4(純度≥98.0%)、煙酸-D4(純度≥98.0%)、煙酰胺-D4(純度≥98.0%)、葉酸-D4(純度≥97.0%)、吡哆醛-D3(純度≥98.5%)、吡哆醇-D3(純度≥94.5%)、吡哆胺-D3(純度≥98.0%)、硫胺素-13C3(純度≥97.0%)、核黃素-13C4-15N2(純度≥95.0%)、生物素-D4(純度≥95.0%)，加拿大Research Chemical公司；

甲醇、乙酸銨：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

鹽酸、氫氧化鈉、氨水：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

實(shí)驗(yàn)用水：Milli-Q超純水：Milli-Q Advantage A10型超純水系統(tǒng)。

1.3 色譜條件優(yōu)化

在相同的色譜條件下，對(duì)比Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)對(duì)多種水溶性維生素的分離效果，有機(jī)流動(dòng)相為甲醇，無(wú)機(jī)流動(dòng)相為10 mmol/L乙酸銨，設(shè)定有機(jī)相為A相，無(wú)機(jī)相為B相，進(jìn)樣體積10 μL；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；梯度洗脫程序：0～2 min，2% A；2～5 min，2%～35% A；5～7 min，35%～95% A；7～9 min，95% A；9～10 min，95%～2% A；10～15 min，2% A。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 分別稱(chēng)取適量的維生素標(biāo)準(zhǔn)品及其同位素內(nèi)標(biāo)，稱(chēng)取適量的標(biāo)準(zhǔn)品至容量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸定容，配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L(折算標(biāo)準(zhǔn)品純度)。其中葉酸使用0.5%氨水配制。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液 10種維生素分別取0.5 mL于10 mL容量瓶，用水定容，混成50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.4.3 內(nèi)標(biāo)中間液 取0.25 mL于10 mL容量瓶，用水定容，混成25 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 分別準(zhǔn)確移取2.0，10，20，50，100，200，500 μL的標(biāo)準(zhǔn)中間液于50 mL容量瓶中，加入100 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，用水稀釋中間液至各級(jí)質(zhì)量濃度為2.0，10，20，50，100，200，500 μg/L，得到標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，其中內(nèi)標(biāo)濃度均為50 μg/L。

1.5 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在ESI離子源下，采用全掃描模式和MRM掃描模式，氣簾氣207 kPa；毛細(xì)管電壓5 000 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣(GAS1)345 kPa；加熱輔助氣(GAS2)345 kPa；碰撞氣(CAD)中等；使用流動(dòng)相混合的流動(dòng)注射的方式將標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入質(zhì)譜，通過(guò)全掃描確定[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰(m/z)，MRM掃描確定最優(yōu)電壓。于三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜中進(jìn)行測(cè)定。對(duì)最佳超聲時(shí)間和基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行探討，并通過(guò)不同水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 樣品前處理優(yōu)化

稱(chēng)取2.5 g配方奶粉于50 mL塑料離心管，加入50 μL質(zhì)量濃度為25 mg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液，加入25 mL 40～50 ℃溫水，使配方奶粉充分溶解，超聲(5，10，15，20，25，30 min)，待樣品冷卻至室溫后，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1.8，靜置2 min，再用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.6。加蓋后以10 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm水相濾膜，根據(jù)各個(gè)化合物含量差異再用水稀釋一定的倍數(shù)，使含量在線性范圍內(nèi)，供UPLC-MS/MS測(cè)定。計(jì)算出水溶性維生素的回收率，確定最優(yōu)超聲時(shí)間。

1.7 基質(zhì)效應(yīng)探究

取空白原料基粉，按照優(yōu)化后的前處理方法進(jìn)行處理，得到基質(zhì)液，用基質(zhì)液配置標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，同時(shí)配置相同濃度的溶劑曲線(曲線均不添加內(nèi)標(biāo))，供儀器測(cè)定后于Excel軟件擬合曲線方程?；|(zhì)效應(yīng)由基質(zhì)曲線方程和溶劑曲線方程的斜率之比表示。

1.8 方法學(xué)驗(yàn)證

用純水配制質(zhì)量濃度為2.0～500.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中含內(nèi)標(biāo)50 μg/L。在空白的基粉中添加低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的前處理方法處理，并于儀器測(cè)定結(jié)果。以信噪比S/N=3和S/N=10分別測(cè)定方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)。同時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，并按照樣品本底值附近的1，2，5倍水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)，測(cè)定所有水溶性維生素的含量，并計(jì)算出回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.9 樣品測(cè)定

隨機(jī)選取20個(gè)實(shí)驗(yàn)室的日常樣品，用所建立的方法對(duì)多種水溶性維生素進(jìn)行測(cè)定，判斷結(jié)果與明示值之間的偏差。

1.10 數(shù)據(jù)處理

多種水溶性維生素按照1.5方法處理，使用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定不同樣品的峰面積，通過(guò)內(nèi)標(biāo)校正曲線進(jìn)行定量計(jì)算，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)于Excel 2007軟件中計(jì)算分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)前期比較了Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱對(duì)多種目標(biāo)物的峰型及分離度的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BEH C18柱分離度不及T3色譜柱，且C18柱分離硫胺素和核黃素容易峰展寬。因此選擇Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)作為分離柱。同時(shí)，考慮到目標(biāo)物的極性較大，因此選擇了洗脫能力相對(duì)較弱的甲醇作為有機(jī)相，并且在水相中添加乙酸銨以增大流動(dòng)相整體的離子強(qiáng)度，從而改善峰型，在此色譜柱及流動(dòng)相條件下進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫程序。最終10種水溶性維生素的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

由于10種水溶性維生素均含有親核基團(tuán)，在電噴霧電離源的正離子模式下，可形成穩(wěn)定的[M+H]+母離子，且響應(yīng)較高。雖然部分化合物在負(fù)離子模式下也有響應(yīng)，但為了方便測(cè)定，最終選擇在正離子模式下測(cè)定。將標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射的方式注入離子源，對(duì)準(zhǔn)分子離子及其二級(jí)子離子進(jìn)行掃描，每秒采集數(shù)最多的碎片作為定量峰，響應(yīng)次之的作為定性峰。同時(shí)，由于不同的化合物，在同一離子化模式下，會(huì)具有各自不同的最優(yōu)去簇電壓(DP)，因此需要優(yōu)化以獲得較高的響應(yīng)。另外不同的準(zhǔn)分子離子在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)下，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞電壓(CE)，使最終采集方法的各個(gè)二級(jí)子離子都達(dá)到最佳響應(yīng)。具體的離子參數(shù)見(jiàn)表1。

圖1 10種水溶性維生素的MRM色譜圖Figure 1 MRM chromatograms of ten water-soluble vitamins

2.3 超聲時(shí)間對(duì)外標(biāo)回收率的影響

由于方法使用了內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行校正，所以最終回收率會(huì)較高。但為了保證較高的靈敏度，以及避免結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，需要針對(duì)外標(biāo)物的實(shí)際回收率進(jìn)行前處理?xiàng)l件的優(yōu)化。為了避免基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響，試驗(yàn)前期先使用未添加10種維生素的乳粉基粉按1.4的前處理方式進(jìn)行處理，同時(shí)測(cè)定本底值，所得基質(zhì)液按照1.3的配制方法用以配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，不添加內(nèi)標(biāo)。由于待測(cè)定維生素較多，因此，按照目標(biāo)物的出峰時(shí)間，初步確認(rèn)10種維生素的極性大小，選擇不同極性的4種維生素(吡哆胺、煙酰胺、煙酸和核黃素)進(jìn)行不同超聲時(shí)間下的加標(biāo)試驗(yàn)，對(duì)回收率進(jìn)行考察。4種維生素在超聲10 min時(shí)，回收率基本達(dá)到最大，此后變化不明顯，可能是由于維生素極性均較大，在乳粉中添加后也未與基質(zhì)形成穩(wěn)定的結(jié)合態(tài)，但可能會(huì)在基質(zhì)表面形成一定的物理吸附，當(dāng)提取時(shí)間過(guò)短時(shí)，目標(biāo)物未能與基質(zhì)解離，并與水相形成氫鍵，所以回收率較低。最終，為了節(jié)省提取的時(shí)間，減少試驗(yàn)成本，選取10 min為最佳超聲時(shí)間。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖2。雖然在不使用內(nèi)標(biāo)校正的情況下，10種維生素的回收率較高，但只是校正了基質(zhì)效應(yīng)的影響，而未對(duì)回收率進(jìn)行校正，但使用內(nèi)標(biāo)定量，則可以在不配制基質(zhì)曲線的情況下，同時(shí)校正基質(zhì)效應(yīng)和回收率，測(cè)定結(jié)果也更為準(zhǔn)確。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由于嬰幼兒奶粉中含有較多的蛋白、氨基酸等水溶性雜質(zhì)，在測(cè)定過(guò)程中，會(huì)對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)造成影響。一般可以通過(guò)凈化或者色譜分離等手段進(jìn)行除雜，但由于蛋白、氨基酸等物質(zhì)含量要遠(yuǎn)大于目標(biāo)物，因此一般的凈化方法，基質(zhì)剩余仍較多，而針對(duì)試驗(yàn)的前處理方法，由于維生素作為添加劑加入，為了簡(jiǎn)化試驗(yàn)，選用了直接超聲提取，等電點(diǎn)沉淀蛋白的處理方法。這樣導(dǎo)致了溶液中的雜質(zhì)較多，因此試驗(yàn)也通過(guò)優(yōu)化液相梯度洗脫程序，使目標(biāo)物與基質(zhì)盡可能分離，從而減少基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)的影響。為進(jìn)一步考察基質(zhì)效應(yīng)，使用乳粉基粉配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率K1與純水配制曲線的斜率K2作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10種維生素的曲線斜率比值ME(Matrix effect)為15.8%～184.0%，抑制和增強(qiáng)效果均超過(guò)20%，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)明顯，但由于實(shí)際定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線是含同位素內(nèi)標(biāo)曲線，可同時(shí)對(duì)回收率和基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正，因此盡管基質(zhì)效應(yīng)雖然明顯，但對(duì)方法整體靈敏度影響不大的情況下，最終使用純水配制的內(nèi)標(biāo)曲線進(jìn)行定量。

表1 10種維生素的質(zhì)譜分析參數(shù)?Table 1 MS/MS parameters of ten water-soluble vitamins

圖2 超聲時(shí)間對(duì)回收率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on recovery (n=6)

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

將標(biāo)準(zhǔn)系列曲線按優(yōu)化后的UPLC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定。10種維生素均以外標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線方程，見(jiàn)表2。10種維生素曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998 7，相關(guān)系數(shù)較高，說(shuō)明外標(biāo)物在曲線濃度范圍內(nèi)呈良好的線性。通過(guò)對(duì)空白基粉的低濃度加標(biāo)，以信噪比S/N=3和S/N=10分別計(jì)算方法檢出限為10～50 μg/kg，方法定量限為30～150 μg/kg，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。因?yàn)閶胗變耗谭壑?，?huì)額外添加水溶性維生素，而方法的定量限遠(yuǎn)低于一般的樣品含量，同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)的情況下，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量。

2.6 精密度、回收率及重復(fù)性

為了驗(yàn)證方法的回收率，選擇已添加維生素的陽(yáng)性嬰幼兒配方奶粉為樣品，日內(nèi)平均測(cè)定6次，取平均值為本底值。以本底值的3個(gè)不同倍數(shù)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加回收，同一水平的樣品于24 h內(nèi)做6次平行試驗(yàn)，并根據(jù)回收率結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示(表3)，平均回收率范圍在85.7%～102.0%，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值RSDs在1.11%～5.69%。由于受到內(nèi)標(biāo)物的校正，大大降低了隨機(jī)誤差，所以結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值較低。同時(shí)，回收率結(jié)果中出現(xiàn)回收率偏差較大的情況，可能是由于樣品中結(jié)合態(tài)維生素的提取存在一定的偏差，從而影響了回收率結(jié)果。綜合考慮，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)均能滿(mǎn)足一般樣品含量的分析測(cè)定要求，因此試驗(yàn)不對(duì)樣品進(jìn)行酶解處理。

表2 10種維生素的校準(zhǔn)曲線參數(shù)、檢出限及定量限Table 2 The parameters of calibration curve and limits of detection and quantitation for ten water-soluble vitamins

表3 10種維生素的方法學(xué)結(jié)果Table 3 Methodological results of ten water-soluble vitamins (n=6)

2.7 方法的實(shí)際應(yīng)用

為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性，隨機(jī)選取20個(gè)實(shí)驗(yàn)室的日常嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示，20個(gè)樣品中，10種維生素的含量均在明示值的85.6%～113.0%，最大偏差約為15%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)嬰幼兒配方奶粉中的10種水溶性維生素進(jìn)行直接超聲提取，優(yōu)化了超聲提取時(shí)間；調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)沉淀效果良好；優(yōu)化的色譜條件下，10種維生素分離效果好，峰型對(duì)稱(chēng)，且通過(guò)與基質(zhì)分離，一定程度上降低了基質(zhì)效應(yīng)；通過(guò)流動(dòng)注射的方式，對(duì)10種維生素的各個(gè)離子對(duì)響應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，方法的檢出限和定量限可滿(mǎn)足嬰幼兒奶粉中水溶性維生素的含量測(cè)定要求；回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表明，使用同位素內(nèi)標(biāo)校正后，方法的這兩項(xiàng)數(shù)據(jù)都能滿(mǎn)足測(cè)定要求。