祝鍇燁 吳秋雪 羅海靜 張偉偉,2* 邵淑麗,2

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，齊齊哈爾 161006；2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，齊齊哈爾 161006)

紫云英苷(AG)又名紫云英甙、山柰酚-3-葡萄糖苷、百蕊草素Ⅱ、黃芪苷，分子式為C21H20O11，是一種天然的黃酮類化合物，是多種植物如黃芪、百蕊草、荷葉、杜仲、報春花、桑樹葉、蕁麻等的生物活性成分之一[1]。陳金川[2]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷作為生物體中的抗氧化劑，能夠有效清除氧自由基。Qu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷提高了雄性Sprague-Dawley大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性并降低了血清中丙二醛(MDA)的含量。但紫云英苷對過量運動造成的氧化損傷是否有修復作用尚未見報道。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)又名谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶，它能催化L-丙氨酸中的氨基酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，主要存在于肝臟和腎臟中，可參與細胞氮代謝和肝糖異生，ALT是肝臟中最活躍的轉(zhuǎn)氨酶之一，目前常作為肝臟損傷的標志物[4]。超氧陰離子是生物體內(nèi)氧代謝首先形成的自由基，當自由基相對過剩，會攻擊生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，進而破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能。大量研究已經(jīng)證實，生物體內(nèi)本身就具有內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)，具有清除多余自由基的能力，其中包括抗超氧陰離子自由基(ASAFR)[5]。

miRNAs為長度18～25個核苷酸的非編碼RNA，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明miRNAs參與了體內(nèi)的氧化還原過程，在氧化應激的過程發(fā)揮重要作用，一些miRNAs可以通過誘導自由基生成或抑制抗氧化過程來誘導氧化損傷[6]，其中的miR-155和環(huán)氧化酶(Cox)表達呈正相關(guān)，其過表達生成的自由基是哮喘患者氧化應激的主要來源[7]；miR-155還可以靶向叉頭框蛋白O1(FOXO1)，抑制線粒體自噬，促進MPC5細胞氧化應激損傷[8]；此外，miR-155表達增加大鼠原代心肌細胞活力,抑制H9C2細胞凋亡,促進H9C2細胞的氧化應激[9]。在發(fā)生肝臟疾病時，miR-155在肝細胞、內(nèi)皮細胞和炎癥細胞中表達上調(diào)[10]。此外，miR-155表達升高與急性乙肝患者血清ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性與乙肝e抗原(HBeAg)水平呈正相關(guān)[11]。但紫云英苷能否緩解急性力竭運動所導致的肝臟組織氧化損傷，其抗氧化作用是否與miR-155相關(guān)的研究尚未見報道。因此，本試驗以C57BL/6J雄性小鼠為研究對象，采用急性力竭運動方法制備小鼠肝臟組織氧化應激模型，研究紫云英苷對力竭運動后小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性、肝臟組織中抗超氧陰離子自由基(ASAFR)活力和miR-155表達的變化，初步探索紫云英苷抗氧化作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物及飼糧：48只8周齡無特定病原體(SPF)級C57BL/6J雄性小鼠及基礎(chǔ)飼糧購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司，將6只小鼠放在1個籠子(27 cm×17 cm×13 cm)中。試驗開始前動物適應環(huán)境1周。

主要試劑：純度為98%的紫云英苷購自上海源葉生物科技有限公司；ALT和ASAFR檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；蛋白質(zhì)含量測定試劑盒和Trizol試劑購自美國賽默飛世爾科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海東洋紡生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物。

儀器設備：Spark10M多功能酶標儀(Tecan，瑞士)、Z32HK高速臺式冷凍離心機(Hermle，德國)、TH-86-340-LA(-80 ℃)超低溫冰箱(北京天地精儀科技有限公司)、Mastercycler Realplex 4熒光定量PCR儀(Eppendorf，德國)、NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計(Thermo，美國)、電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試驗方法

將48只8周齡C57BL/6J雄性小鼠在實驗室飼養(yǎng)1周，基礎(chǔ)飼糧喂養(yǎng)，正常飲水，室溫環(huán)境生存且均做了游泳測試。一次性力竭運動時將小鼠按體質(zhì)量隨機分為4組，二甲基亞砜(DMSO)組、力竭運動組、50 mg/kg紫云英苷組、100 mg/kg紫云英苷組，每組3個重復，每個重復4只。除DMSO組外，其余3組小鼠進行一次性力竭運動4 h；紫云英苷組在力竭運動后分別灌胃50和100 mg/kg的紫云英苷，力竭運動組在力竭運動后灌胃等量生理鹽水，DMSO組灌胃等體積生理鹽水配制的0.1%DMSO。各組小鼠灌注1 h后斷頸處死，取血液，離心制備血清，于冰塊上迅速解剖取肝臟，用預冷生理鹽水洗去肝臟血漬，濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標

1.3.1 抗氧化應激指標測定

按照試劑盒說明對血清和肝臟組織樣品進行處理，并測定血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力。

1.3.2 氧化相關(guān)miRNAs表達測定

從-80 ℃冰箱中取出4組小鼠的肝臟組織樣品，各組剪取等量組織，于液氮冷凍研磨后加入Trizol試劑提取總RNA，在NanoDropND-2000C中進行RNA定性和定量分析。各組樣品中各取1 μg總RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover說明，使用合成的特異性反轉(zhuǎn)錄引物將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以各組反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，選取U6基因作為內(nèi)參，在Eppendorf Mastercycler Realplex 4 PCR儀中進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)。反應體系為10 μL：TB Green Premix Ex TaqⅡ 5 μL，cDNA樣品2 μL，上、下游引物各0.5 μL，DEPC-treated H2O 2 μL。反應條件如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 min，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，得到miR-378a、miR-15b、miR-1906、miR-155、miR-18a、miR-99a、miR-137、miR-181a、miR-27a的Ct值，用2-△△Ct法計算各miRNAs的相對表達量。所用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 5.0軟件進行處理分析并作圖，以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性力竭運動對小鼠血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力的影響

由表2可知，與DMSO組相比，急性力竭運動4 h后，小鼠血清中ALT活性提高16.03倍(P<0.05)，肝臟組織中ASAFR活力降低43%(P<0.05)。

表2 急性力竭運動對小鼠血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力的影響Table 2 Effects of acute exhaustive exercise on ALT activity in serum and ASAFR activity in liver tissue of mouse

2.2 急性力竭運動對小鼠肝臟組織中miRNAs表達的影響

由圖1可知，與DMSO組相比，急性力竭運動4 h后，小鼠肝臟組織中miR-378a的相對表達量升高4.33倍(P<0.01)，miR-15b的相對表達量升高3.28倍(P<0.01)，miR-1906的相對表達量升高6.48倍(P<0.01)，miR-155的相對表達量升高6.29倍(P<0.01)，miR-18a的相對表達量升高3.80倍(P<0.01)，miR-99a的相對表達量升高4.97倍(P<0.01)，miR-137的相對表達量升高7.05倍(P<0.01)，miR-181a的相對表達量升高3.52倍(P<0.05)，miR-27a的相對表達量降低80%(P>0.05)。

“*”表示與二甲基亞砜組相比差異顯著(P<0.05)，“*”表示與二甲基亞砜組相比差異極顯著(P<0.01)，“ns”表示與二甲基亞砜組相比差異不顯著(P>0.05)?！?” mean significant difference compared DMSO group (P<0.05), “*” mean extremely significant difference compared DMSO group (P<0.01)， and “ns” mean no significant difference compared DMSO group (P>0.05).圖1 急性力竭運動對小鼠肝臟組織中miRNAs表達的影響Fig.1 Effects of acute exhaustive exercise on miRNAs expression in liver tissue of mouse

2.3 紫云英苷對急性力竭運動后小鼠血清中ALT活性和肝臟組織ASAFR活力的影響

由表3可知，與力竭運動組相比，急性力竭運動后灌胃50 mg/kg紫云英苷使小鼠血清中ALT活性降低77%(P<0.05)，肝臟組織中ASAFR活力升高1.77倍(P<0.05)；急性力竭運動后灌胃100 mg/kg紫云英苷使小鼠血清中ALT活性降低91%(P<0.05)，肝臟組織中ASAFR活力升高1.95倍(P<0.05)。上述結(jié)果表明,紫云英苷可顯著改善由急性力竭運動造成的小鼠血清中ALT活性提高和肝臟組織ASAFR活力的降低。

表3 紫云英苷對急性力竭運動后小鼠血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力的影響Table 3 Effects of astragalin on ALT activity in serum and ASAFR activity in liver tissue of mouse after acute exhaustive exercise

2.4 紫云英苷對急性力竭運動后小鼠肝臟組織中miR-155表達的影響

由圖2可知，與力竭運動組相比，急性力竭運動后灌胃50 mg/kg紫云英苷使小鼠肝臟組織中miR-155相對表達量降低66%(P<0.01)；急性力竭運動后灌胃100 mg/kg紫云英苷使小鼠肝臟組織中miR-155相對表達量降低60%(P<0.01)。

“*”表示與二甲基亞砜組相比差異顯著(P<0.05)，“*”表示與二甲基亞砜組相比差異極顯著(P<0.01)。“##”表示與力竭運動組相比差異極顯著(P<0.01)?！?” mean significant difference compared with DMSO group (P<0.05), and “*” mean extremely significant difference compared with DMSO group (P<0.01). “##” mean extremely significant difference compared with exhaustive exercise group (P<0.01).圖2 紫云英苷對急性力竭運動后小鼠肝臟組織中miR-155表達的影響Fig.2 Effects of astragalin on miR-155 expression in liver tissue of mouse after acute exhaustive exercise

3 討 論

不同強度的有氧運動對機體影響并不相同，中低強度的有氧運動對健康有益，而當長時間高強度的有氧運動使機體進入力竭狀態(tài)時，產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，會引起嚴重的炎癥，造成氧化應激以及器官損害。肝臟是代謝內(nèi)源性和外源性化合物并負責解毒的主要器官，可通過多種途徑維持正常的體內(nèi)平衡。由于在急性力竭運動中作為能量來源的是肝糖原，所以肝臟也是力竭運動后ROS產(chǎn)生的主要來源，當肝臟組織中增加生成2～3倍或更多的ROS，超過正常的生理適應范圍時，則導致ROS的積累和抗氧化劑狀態(tài)的降低，從而增加氧化應激，導致免疫系統(tǒng)功能下降和氧化損傷增加，誘導肝細胞凋亡，使肝臟組織出現(xiàn)纖維化，中心靜脈充血，產(chǎn)生炎性浸潤和局灶性壞死。造成肝臟組織損傷[12-14]。Lim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在高強度運動中，腸上皮的通透性增加，脂多糖(LPS)很容易泄漏到門脈循環(huán)中，然后被進一步運輸?shù)礁闻K。Ruhee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，急性力竭運動會導致雄性C57BL/6J小鼠的肝臟組織損傷和肝細胞死亡，肝臟組織中促炎細胞因子白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA相對表達量顯著增加。通常ALT被作為肝組織的病理損傷標志物，血液中ALT活性提高代表肝細胞的膜功能完整性喪失，急性力竭運動會嚴重損害肝臟，增加血液中ALT活性[17]。氧自由基具有強氧化性，可引起脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物如MDA等，嚴重損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應，同時在生物體內(nèi)本身就具有清除多余氧自由基的能力，抗氧化物質(zhì)主要包括SOD、CAT等[5]。研究表明，ASAFR活力作為抗氧化能力的標志物之一，反映了組織清除超氧陰離子自由基的總能力，ASAFR活力下降代表組織內(nèi)抗氧化能力的下降[18]。本試驗中C57BL/6J雄性小鼠一次性游泳4 h后，與DMSO組相比，肝臟組織中ASAFR活力下降、血清中ALT活性升高，該結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，說明4 h游泳運動造成了小鼠肝臟組織抗氧化能力下降和氧化損傷。

肝臟是人類等哺乳動物的主要代謝器官，它充當糖原、脂蛋白、維生素、鐵和血液的儲存器官。已有研究表明肝細胞和肝臟組織中共有277個miRNAs表達，這些miRNAs參與調(diào)節(jié)多種代謝途徑，因此miRNAs表達的變化可能反映了肝臟組織潛在的損傷[19]。miRNA-155被認為是炎癥的重要調(diào)節(jié)劑，Klieser等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155的過表達通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)導致脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)和低密度脂蛋白受體(LDLR)表達上調(diào)，在肝巨噬細胞和肝星狀細胞中釋放TNF-α，ROS導致炎癥和氧化應激發(fā)生。Bala等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155表達水平的提高促進C57BL/6J小鼠的肝纖維化和酒精引起的脂肪性肝炎。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-378a的相對表達量在高血脂癥的小鼠肝臟組織中顯著提升。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b在非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)SD大鼠模型和棕櫚酸酯誘導的NAFLD LO2細胞模型中高表達。Lu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a在肝硬化和肝癌患者的血清中的相對表達量顯著提升。本試驗中，C57BL/6J小鼠4 h游泳運動后，與DMSO組相比，miR-155、miR-378a、miR-15b、miR-18a的mRNA相對表達量顯著提升，與上述研究結(jié)果一致。

在我們前期的研究中，檢測了不同濃度紫云英苷灌胃后C57BL/6J雄性小鼠血清中ALT活性的變化，結(jié)果表明灌胃50或100 mg/kg紫云英苷均不會對小鼠肝臟組織造成損傷。紫云英苷作為一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化的作用。Soromou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷通過核因子-κB(NF-κB)途徑發(fā)揮抗炎作用，抑制白細胞介素-1(IL-1)、IL-6和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生。Park等[25]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷可以作為暴露于太陽輻射的皮膚的抗氧化劑并保護可以保護細胞膜免受ROS的損傷。Cho等[26]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷可抑制LPS引起的上皮細胞凋亡和嗜酸性粒細胞增多，并作為LPS誘導的LPS-Toll樣受體(TLR)信號網(wǎng)絡的拮抗劑。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷對脂多糖(LPS)誘導的小鼠乳腺上皮細胞炎癥反應也有抑制作用。Vongsak等[28]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷對過氧化氫(H2O2)誘導的ROS產(chǎn)生抑制作用，并顯著降低了H2O2誘導的HEK-293細胞中的ROS產(chǎn)生。在本試驗中，與急性力竭運動組相比，小鼠力竭游泳運動4 h后，灌胃50或100 mg/kg紫云英苷均可以顯著改善急性力竭運動造成的血清中ALT活性提高和肝臟組織中ASAFR活力的降低，其中ASAFR活力與DMSO組無顯著差異，說明50和100 mg/kg的紫云英苷可以作為急性力竭運動造成的小鼠肝臟氧化損傷的抗氧化劑，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，但并未呈現(xiàn)顯著的劑量相關(guān)性。

研究表明miR-155與肝臟炎癥和氧化損傷相關(guān)性較高，并且紫云英苷對急性力竭運動后小鼠肝臟組織中miR-155表達的影響較為顯著，因此我們檢測了急性運動后灌胃紫云英苷對miR-155表達的影響。結(jié)果表明，與急性力竭運動組相比，急性力竭運動后灌胃50或100 mg/kg的紫云英苷均可以顯著改善急性力竭運動造成的肝臟組織中miR-155相對表達量的提高，與上一結(jié)果相同，但miR-155相對表達量的改變并沒有呈現(xiàn)對紫云英苷的劑量相關(guān)性。

綜上所述，我們推測紫云英苷的抗氧化作用與miR-155相關(guān)，但紫云英苷抗氧化作用的具體分子機制仍待進一步研究。

4 結(jié) 論

紫云英苷可以作為急性力竭運動引起的小鼠肝臟氧化損傷的抗氧化劑，灌胃50和100 mg/kg的紫云英苷均能改善急性力竭運動造成的小鼠血清中ALT活性的提高和肝臟組織中ASAFR活力的降低，并改善急性力竭運動造成的小鼠肝臟組織中miR-155相對表達量的提高。