楊兆艷，胡紅娟，李 新，王玲麗，田艷花

（1 山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系 太原 030031 2 山西省食品工業(yè)研究所 太原 030031 3 運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系 山西運(yùn)城 044000）

機(jī)體在正常生長代謝過程中產(chǎn)生自由基，而自由基具有多種生理功能，如激活細(xì)胞活性，參與信號傳導(dǎo)，排除細(xì)胞毒素并維持生命所需能量[1]。當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基時會導(dǎo)致機(jī)體正常細(xì)胞組織發(fā)生病變，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，并促進(jìn)炎癥、癌癥和糖尿病等疾病的病理學(xué)發(fā)展[2-4]。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)源性損傷和外源性氧化物質(zhì)刺激時，機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡被打破，造成活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在機(jī)體內(nèi)大量堆積，引起細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[5-6]。此外，過量自由基會導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生過氧化，增加膜的通透性[7]，同時降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系活性，損傷蛋白質(zhì)和DNA 等物質(zhì)，并誘導(dǎo)細(xì)胞加速凋亡[8]。大量研究表明，通過膳食補(bǔ)充天然抗氧化成分，一方面可以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)自由基水平[9-10]；另一方面可增強(qiáng)機(jī)體對外界的防御能力，進(jìn)而有助于維持機(jī)體的氧化動態(tài)平衡[11-12]。開發(fā)具有天然抗氧化活性的功能性食品和藥物已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

藍(lán)莓又名越橘，屬于杜鵑花科越橘屬（Ericaceae Vaccinium.spp）[13]，其果實(shí)呈現(xiàn)誘人的藍(lán)色，風(fēng)味獨(dú)特，主要種植于北美、俄羅斯和中國東北地區(qū)。其果實(shí)中富含豐富的花色苷、多酚、黃酮、維生素（A，C，E）、必需氨基酸和超氧化物歧化酶等多種活性成分，具有較高的醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)價值，深受人們的喜愛[14]，其中藍(lán)莓花色苷（Blueberry anthocyanins，BA） 是藍(lán)莓中重要的活性成分之一，被廣泛用于保健品和藥品等領(lǐng)域。大量研究表明BA 具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)視力和防衰老等功效[15]。此外，羅春麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)紫薯花青素對H2O2引起的HepG2 細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。林清華[17]研究結(jié)果表明BA 可通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，降低CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷。張震等[18]研究發(fā)現(xiàn)BA 能顯著降低BGC-823 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，同時細(xì)胞內(nèi)GSH-Px 和CAT 活性顯著增加，降低H2O2引起B(yǎng)GC-823 細(xì)胞氧化損傷。Tang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)枸杞花色苷提取物通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，減輕脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞抗氧化酶活性（GSH-Px、SOD 和CAT）來抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞氧化損傷。劉玲玲等[20]研究結(jié)果表明花青素通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS 含量和抑制H2O2對JNK 的激活，從而減輕阿爾茨海默癥模型細(xì)胞的氧化損傷。目前關(guān)于BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。

鑒于此，本研究采用H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞來構(gòu)建氧化損傷模型，采用MTT 法檢測細(xì)胞存活率，確定H2O2濃度、處理時間及BA 濃度范圍。采用流式細(xì)胞分析儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS 水平及凋亡率。ELISA 法檢測胞內(nèi)抗氧化酶（GSH-Px、SOD、CAT）活性及MDA 水平。RT-PCR 技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和凋亡相關(guān)蛋白的mRNA 表達(dá)量，Western blot 法檢測凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)量。通過上述研究評價BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為藍(lán)莓功能性食品開發(fā)和抗氧化藥物研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓，2019年5月購于東北小興安嶺；BA，實(shí)驗(yàn)室經(jīng)超聲提取獲得；人肺癌A549 細(xì)胞，北京協(xié)和細(xì)胞庫；H2O2，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。MTT，北京碧云天生物科技研究所；二甲基亞砜（DMSO），上海萊昂生物科技有限公司；DMEM 和雙抗（青霉素/鏈霉素），日本同仁公司；胎牛血清（FBS），美國Sigma 公司；胰蛋白酶消化液，美國HyClone 公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）和活性氧（ROS）試劑盒，南京建成生物工程研究所；磷酸鹽緩沖液（PBS）、蛋白濃度測定試劑盒（BCA）、細(xì)胞裂解液（RIPA），北京佛博生物科技有限公司；TRIzol 試劑，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3/9 和GADPH 抗體，美國CST 公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZE5 流式細(xì)胞分析儀，美國BIO-RAD 公司；FV3000 激光共聚焦顯微鏡，美國Thorlabs 公司；DHP-9402 CO2恒溫培養(yǎng)箱，杭州俊升科學(xué)器材有限公司；EVOS M7000 倒置顯微鏡和電泳儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機(jī)，江蘇天翎儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TG18K-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海趙迪生物科技有限公司；JC-1086C Pro 全自動酶標(biāo)分析儀，青島聚創(chuàng)環(huán)保儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BA 制備 采用超聲輔助提取法提取BA。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取2 kg 藍(lán)莓，將其打漿凍干成果粉，提取工藝參數(shù)設(shè)置為：超聲功率350 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間25 min，提取溫度50 ℃，料液比1∶30 g/mL。在此條件下進(jìn)行提取，BA 提取率86.15%，將提取液真空抽濾凍干，制得BA 粉末，備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549 細(xì)胞接種于DMEM 培養(yǎng)基（10% FBS 和1%雙抗）中，然后將其置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底70%～80%時，將細(xì)胞進(jìn)行傳代，本研究均采用對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷模型的建立按照6×103個/孔的細(xì)胞密度將對數(shù)期A549 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁時，棄去上清，加入用DMEM 培養(yǎng)基配制的不同濃度（0，50，100，200，400，800，1 600 μmol/L）H2O2溶液，分別處理3，6，9，12，24，48 h，每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔，隨后棄上清，用PBS 洗滌2 次，然后每孔加入200 μL DMEM 和20 μL（5 mg/mL）MTT，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔再加入150 μL DMSO，振蕩15 min，使藍(lán)色結(jié)晶溶解，置于酶標(biāo)儀中在490 nm 處測定其吸光值。依據(jù)式（1）計算細(xì)胞存活率[21]。

式中：A0——空白組的平均吸光度；A1——不同濃度H2O2處理組的平均吸光度。

1.3.4 BA 劑量的篩選 細(xì)胞培養(yǎng)操作同1.3.3節(jié)，僅將加入的不同濃度H2O2，換成用DMEM 培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度（0，30，60，90，180，360 mg/mL）BA，依據(jù)式（1）計算細(xì)胞存活率。

1.3.5 BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞存活率的影響采用MTT 方法測定細(xì)胞存活率。將對數(shù)期A549細(xì)胞（6×103個/孔）接種于96 孔板中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，然后每孔加入400 μmol/L H2O2溶液處理24 h，隨后每孔加入用DMEM 培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度 （0，30，60，90 mg/mL）BA干預(yù)24 h，后續(xù)操作同1.3.3 節(jié)，依據(jù)式（1）計算細(xì)胞存活率。

1.3.6 BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響利用DCFH-DA 熒光探針檢測BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響。按照細(xì)胞密度5×104個/孔將對數(shù)期A549 細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)12 h，每孔加入400 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，然后每孔用不同質(zhì)量濃度 （0，30，60，90 mg/mL）BA 干預(yù)24 h，最后每孔加入終濃度5 μmol/L DCFHDA 熒光探針，在4 ℃條件下，避光反應(yīng)20 min，吸取探針，細(xì)胞用PBS 洗滌2 次，隨后利用胰蛋白酶將其消化，離心棄上清液，PBS 重懸，并采用流式細(xì)胞分析儀測定每孔樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3.7 BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞MDA 水平的影響 利用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的MDA 水平的影響。選取對數(shù)期A549 細(xì)胞（5×104個/孔）接種于6 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，隨后每孔加入400 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，然后每孔用不同質(zhì)量濃度（0，30，60，90 mg/mL）BA 干預(yù)24 h，最后每孔加入100 μL 細(xì)胞裂解液，在4 ℃、1 600 g 離心15 min，取上清液作為樣本，利用試劑盒檢測樣品中MDA 含量。

1.3.8 BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的影響 采用試劑盒檢測BA 對H2O2誘導(dǎo)A549細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的影響。將對數(shù)期A549 細(xì)胞（5×104個/孔）接種于6 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，在每孔中加入400 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，然后加入不同質(zhì)量濃度（0，30，60，90 mg/mL）BA 干預(yù)24 h，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌2 次，刮下細(xì)胞置于1.5 mL 離心管中，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，在4 ℃、12 000 g 離心15 min，取上清液作為樣本。利用試劑盒檢測上清液中GSH-Px、SOD 和CAT 活性。

1.3.9 BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的影響取對數(shù)期A549 細(xì)胞 （2.5×105個/孔） 接種于60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，在每個皿中加入400 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，然后加入不同質(zhì)量濃度（0，30，60，90 mg/mL）BA 干預(yù)24 h，棄去培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用PBS 洗2 次，采用Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記染色法流式檢測細(xì)胞凋亡。同時利用Hoechst 33342 對細(xì)胞核進(jìn)行染色，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.3.10 RT-PCR 法檢測BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞 內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT、Bcl-2、Bax、Cytochrome c 和Caspase-3/9 mRNA 表達(dá)水平的影響 按照細(xì)胞密度為5×104個/孔將對數(shù)期A549 細(xì)胞接種于6 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，隨后每孔加入400 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，然后每孔用不同質(zhì)量濃度 （0，30，60，90 mg/mL）BA 干預(yù)24 h。利用TRIZOL 試劑提取每組細(xì)胞的RNA。根據(jù)Primer 5.0 設(shè)計引物序列，引物序列如下表所示。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后RT-PCR 檢測GSH-Px、SOD、CAT、Bcl-2、Bax、Cytochrome c 和Caspase-3/9 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。選取GAPDH 作為內(nèi)參，以GSH-Px、SOD、CAT、Bcl-2、Bax、Cytochrome c 和Caspase-3/9 與GAPDH 的mRNA 表達(dá)含量比值作為待測基因相對mRNA 表達(dá)水平。反轉(zhuǎn)錄程序如下：95 ℃保持5 min；94 ℃保持15 s；55 ℃保持20 s；72 ℃保持20 s，40 個循環(huán)；設(shè)定收集熒光，每個處理重復(fù)3 次，2ΔΔct法計算待測基因的相對含量。

1.3.11 BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)量的影響 采用蛋白印跡法測定BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)量的影響。將對數(shù)期A549 細(xì)胞接種于60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿（2.5×105個/孔），在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，每皿中加入400 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，然后加入不同質(zhì)量濃度 （0，30，60，90 mg/mL）BA 干預(yù)24 h，隨后加入100 μL RIPA 細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA 試劑盒測定總蛋白含量。蛋白測定后，取20 μL 蛋白樣品上樣于5%～10%SDS-PAGE 凝膠，電泳分離，冰浴下將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉25 ℃搖床封閉1 h，加入對應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜。次日換為HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，通過凝膠成像檢測Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3/9 和GADPH 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果利用Image Lab 軟件對相應(yīng)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 內(nèi)參及目的基因引物序列Table 1 Primer sequence of target genes involved

1.3.12 數(shù)據(jù)處理 每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Statistix8.0 軟件對每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）；采用SAS8.0 軟件分析結(jié)果的顯著差異；Origin9.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2 濃度和處理時間的確定

采用H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞建立氧化損傷模型，其結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在不同處理時間下，不同濃度的H2O2均對A549 細(xì)胞的生長產(chǎn)生一定的抑制作用，且細(xì)胞的存活率均隨H2O2濃度增加和處理時間的延長而降低。與空白對照相比，不同濃度H2O2和處理時間均顯著抑制A549 細(xì)胞存活率（P＜0.05）。當(dāng)H2O2濃度和處理時間分別在400 μmol/L 和24 h 時，細(xì)胞存活率達(dá)到（50.86±3.06）%。H2O2濃度過高和處理時間過長時，A549 細(xì)胞損傷越嚴(yán)重；但當(dāng)H2O2濃度過低和處理時間較短時，A549 細(xì)胞損傷不明顯。熊存全等[22]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率約為50%時，對應(yīng)的H2O2濃度及處理時間作為氧化損傷模型的最適條件。因此，本研究選擇H2O2濃度和處理時間分別為400 μmol/L 和24 h 來構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，并用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 H2O2 濃度（a）和處理時間（b）對A549 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of H2O2 concentration （a） and treatment time （b） on the survival rate of A549 cells

2.2 BA 濃度的篩選

不同質(zhì)量濃度（0，30，60，90，180，360 mg/mL）BA 作用A549 細(xì)胞24 h 后，由圖2a 觀察可知，當(dāng)BA 質(zhì)量濃度在0～90 mg/mL 時，細(xì)胞完全貼壁，緊密相連，且細(xì)胞數(shù)目無顯著變化。由圖2b 可知，在此濃度范圍內(nèi)，隨BA 濃度增加A549 細(xì)胞存活率無顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果表明BA 質(zhì)量濃度在0～90 mg/mL 時對A549 細(xì)胞無毒性作用。當(dāng)BA質(zhì)量濃度在180～360 mg/mL 范圍內(nèi)，隨BA 濃度增加A549 細(xì)胞數(shù)目顯著降低，漂浮細(xì)胞增多，同時細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。由此說明高濃度BA 對A549 細(xì)胞具有毒性作用。故選擇BA 質(zhì)量濃度為30，60，90 mg/mL 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同濃度BA 對A549 細(xì)胞形態(tài)（a）和存活率（b）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of BA on morphology （a） and survival rate （b） of A549 cells

2.3 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率能直觀反映外界環(huán)境對細(xì)胞損傷程度的影響。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加，對A549 細(xì)胞造成氧化損傷，進(jìn)一步誘導(dǎo)其凋亡[23]。因此，細(xì)胞存活率的降低是成功建立氧化損傷模型的重要標(biāo)志之一。H2O2性質(zhì)穩(wěn)定，是一種重要的活性氧分子，通常用于建立體外氧化損傷模型。因此，本研究利用H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞建立體外氧化損傷模型，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，與空白對照相比，H2O2誘導(dǎo)組A549 細(xì)胞存活率顯著降低 （P＜0.05）。結(jié)果表明H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞建立氧化損傷模型成功。與模型組相比，低劑量（30 mg/mL）BA 對細(xì)胞存活率無顯著影響（P＞0.05），中劑量（60 mg/mL）和高劑量（90 mg/mL）BA 均能顯著提高細(xì)胞存活率（H2O2＜0.05）。結(jié)果表明BA 對A549 細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，能緩解H2O2對A549 細(xì)胞的氧化損傷。

圖3 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of BA on the survival rate of A549 cells induced by H2O2

2.4 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響

活性氧（ROS）包含羥自由基、單線態(tài)氧和超氧陰離子等，在正常生理狀態(tài)下，ROS 的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡過程，適量ROS 能提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和機(jī)體的免疫能力[24-25]。但在外界刺激時，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，過量的ROS 對細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。利用DCFH-DA 熒光探針檢測BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響，其平均熒光強(qiáng)度大小直觀反映ROS 水平。由圖4可知，與正常對照組相比，模型組ROS 水平顯著增加（P＜0.05）。進(jìn)一步表明H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的氧化損傷模型建立成功。與模型組相比，BA 低、中和高劑量組均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平（P＜0.05），且呈劑量效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明BA 能有效抑制H2O2引起A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高，降低ROS對細(xì)胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)的氧化損傷，進(jìn)一步發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。

圖4 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.4 Effect of BA on ROS levels in A549 cells induced by H2O2

2.5 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞MDA 水平的影響

機(jī)體自身存在抗氧化調(diào)控系統(tǒng)，在一定程度上能抵抗外界氧化應(yīng)激導(dǎo)致的機(jī)體損傷[27]。但當(dāng)機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，且抗氧化體系無法修復(fù)機(jī)體損傷時，則首先引起細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，其主要的代謝產(chǎn)物為MDA。因此，MDA 水平的高低直接反映細(xì)胞膜受到自由基氧化損傷的嚴(yán)重程度[28]。本研究利用試劑盒檢測BA對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞MDA 水平的影響，其結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，與正常組相比，模型組中MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，BA 低、中、高劑量組均能顯著降低MDA 水平（P＜0.05），且呈劑量效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明H2O2導(dǎo)致A549 細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的氧化損傷，而BA 能顯著緩解活性氧對細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化損傷的影響，同時能抑制自由基對機(jī)體的氧化損傷。

圖5 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的MDA 水平的影響Fig.5 Effect of BA on MDA level of A549 cells induced by H2O2

2.6 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的影響

機(jī)體自身存在兩大抗氧化體系（酶抗氧化體系和非酶抗氧化體系） 來共同抵御外界氧化應(yīng)激原[29]。其中GSH-Px、SOD 和CAT 是抗氧化酶的重要組成部分。SOD 和CAT 是抵御外界氧化應(yīng)激刺激的第一道防線；GSH-Px 在機(jī)體內(nèi)作為一種重要的過氧化物分解酶，能催化GSH 和過氧化物還原成無毒的羥基化合物和GSSG，從而有效抑制過氧化物的損傷。機(jī)體抗氧化物酶系在發(fā)揮機(jī)體抗氧化和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激動態(tài)平衡中起到至關(guān)重要的作用，抗氧化酶活力的高低直接反映出機(jī)體對外界氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控能力。為探究BA 是否通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性來降低H2O2誘導(dǎo)A549細(xì)胞氧化損傷，本研究利用抗氧化酶試劑盒測定BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD 和CAT 活性的影響，其結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，與空白對照組相比，模型組中GSH-Px、SOD和CAT 活性均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，BA 低、中和高劑量組均能顯著提高GSH-Px、SOD和CAT 活性（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明H2O2破壞A549 細(xì)胞的氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)，降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力，使得A549 細(xì)胞內(nèi)氧化動態(tài)被打破和胞內(nèi)MDA 水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的氧化損傷，進(jìn)一步說明H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建成功。而經(jīng)過BA 干預(yù)后，能有效抑制H2O2造成的胞內(nèi)抗氧化酶活性的降低，并降低胞內(nèi)MDA 水平，對氧化損傷具有較好的保護(hù)作用，同時能提高機(jī)體對外界氧化應(yīng)激的調(diào)控能力。該結(jié)果與BA 能緩解H2O2所引起的細(xì)胞存活力降低和ROS 水平增加的結(jié)果一致。

圖6 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px（a）、SOD（b）和CAT（c）活性的影響Fig.6 Effect of BA on GSH-Px （a），SOD （b）and CAT （c） activities in A549 cells induced by H2O2

2.7 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系mRNA 表達(dá)量的影響

通過2.6 節(jié)研究發(fā)現(xiàn)BA 能顯著抑制H2O2所導(dǎo)致A549 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD 和CAT 活性降低。為從基因?qū)用嫔线M(jìn)一步探究BA 是否能提高A549 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD 和CAT 活性，來抵御H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷。本研究通過RTPCR 技術(shù)檢測GSH-Px、SOD 和CAT 相對mRNA表達(dá)量，其結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，與空白對照組相比，經(jīng)H2O2處理A549 細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD 和CAT 相對mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與H2O2處理組相比，BA 試驗(yàn)組均能顯著提高GSH-Px、SOD 和CAT 相對mRNA 表達(dá)量（P＜0.05），且呈濃度依賴性。該試驗(yàn)結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果一致。進(jìn)一步證明BA 是通過提高胞內(nèi)抗氧化酶活性，抵御H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷。

圖7 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px（a）、SOD（b）和CAT（c）mRNA 表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of BA on the expression of GSH-Px （a），SOD （b） and CAT （c） mRNA in A549 cells induced by H2O2

2.8 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的影響

在正常情況下，氧化應(yīng)激在機(jī)體內(nèi)是存在的，且是機(jī)體內(nèi)不可避免的一種狀態(tài)。機(jī)體自身的適應(yīng)機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免受不同程度的氧化損傷，外界的各種刺激往往能破壞氧化應(yīng)激的平衡狀態(tài)，促使細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[30]。本研究首先通過Hoechst 33342 染色觀察BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞核熒光強(qiáng)度的影響，其結(jié)果如圖8a所示。由圖8a 可知，未經(jīng)H2O2處理的對照組A549 細(xì)胞核呈淡藍(lán)色；在模型組中，H2O2處理A549 細(xì)胞能增加細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度；而經(jīng)低、中、高劑量的BA 干預(yù)A549 細(xì)胞后，細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度逐漸降低。結(jié)果表明BA 能抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探究BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡率的影響，本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析研究，其結(jié)果如圖8b 和8c 所示。由圖8c 可知，與對照組相比，H2O2處理A549 細(xì)胞使細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；而經(jīng)低、中、高劑量組的BA干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），且呈顯著的劑量關(guān)系。結(jié)果表明H2O2處理顯著增加A549細(xì)胞凋亡率，而BA 能有效抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

圖8 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effect of BA on apoptosis of A549 cells induced by H2O2

2.9 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

由2.8 節(jié)研究結(jié)果可知BA 能顯著抑制H2O2所導(dǎo)致A549 細(xì)胞凋亡，為探究BA 保護(hù)H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷機(jī)制，本研究首先采用RTPCR 技術(shù)探究BA 對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，其結(jié)果如圖9所示。H2O2處理A549 細(xì)胞24 h 后，Bcl-2/Bax 相對mRNA 表達(dá)量顯著低于空白對照組 （P＜0.05），而Cytochrome c、Caspase-9 和Caspase-3 相對mRNA表達(dá)量顯著高于空白對照組 （P＜0.05）。采用高、中、低劑量的BA 干預(yù)H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)BA 顯著增加Bcl-2/Bax 相對mRNA 表達(dá)量和降低Cytochrome c、Caspase-9 和Caspase-3 相對mRNA 表達(dá)量（P＜0.05），呈劑量效應(yīng)。研究結(jié)果表明BA 通過上調(diào)Bcl-2/Bax 相對mRNA 表達(dá)量，下調(diào)Cytochrome c、Caspase-9 和Caspase-3 相對mRNA 表達(dá)量，來抵抗H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷。

圖9 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的Bcl-2/Bax（a）、Cytochrome c（b）、Caspase-9（c）和Caspase-3（d）相對mRNA 表達(dá)量的影響Fig.9 Effect of BA on the expression mRNA levels of Bcl-2/Bax （a），Cytochrome c （b），Caspase-9 （c）and Caspase-3 （d） in A549 cells induced by H2O2

2.10 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

在真核生物中，線粒體作為能量和代謝的中心，為細(xì)胞的生命活動提供必要的基礎(chǔ)能量，同時參與細(xì)胞的代謝調(diào)控。許多外界因素（死亡受體信號、生長因子抑制劑、抗癌藥物等）會造成線粒體功能損傷，引起細(xì)胞凋亡[31]。線粒體直接決定細(xì)胞的生存與死亡，在各種信號通路中起著關(guān)鍵性作用，其功能作為凋亡途徑上游與天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶、下游死亡執(zhí)行器之間連接[32]。大量研究表明H2O2可以激活“內(nèi)源性凋亡”或線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，或啟動內(nèi)源性凋亡途徑和激活Bcl-2 家族。線粒體通路上的Bcl-2 家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮“主開關(guān)”作用，并且Bcl-2/Bax 的比值大小直觀反映細(xì)胞受到凋亡刺激時的生存狀態(tài)，其中抗凋亡蛋白Bcl-2 可通過抑制Bax 激活，阻止Bax 破壞線粒體外膜完整性并抑制Cytochrome c 的釋放和Caspase 前體激活，最終抑制細(xì)胞的凋亡[33-34]。為進(jìn)一步探究BA對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，本試驗(yàn)在2.9 節(jié)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Western blot檢測BA 對相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)量的影響，其結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，與對照組相比，模型組Bcl-2/Bax的比值顯著下調(diào)（P＜0.05），Cytochrome c、Caspase-9 和Caspase-3 相對蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，BA 低、中、高劑量組均能顯著上調(diào)Bcl-2/Bax 的比值，顯著下調(diào)Cytochrome c、Caspase-9 和Caspase-3 相對蛋白表達(dá)量，且呈劑量效應(yīng)（P＜0.05）。結(jié)果表明H2O2激活線粒體凋亡通路和Caspase-3 凋亡通路，導(dǎo)致A549 細(xì)胞存活率降低，而BA 可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。進(jìn)一步說明BA 可通過協(xié)助細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激對線粒體和DNA 的損傷，降低細(xì)胞氧化損傷和提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激的調(diào)控能力。

圖10 BA 對H2O2 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的Bcl-2/Bax（b）、Cytochrome c（c）、Caspase-9（d）和Caspase-3（e）相對蛋白表達(dá)量的影響Fig.10 Effect of BA on the relative protein expression levels of Bcl-2/Bax （b），cytochrome c （c），caspase-9 （d）and caspase-3 （e） in A549 cells induced by H2O2

綜合以上的研究結(jié)果可知，當(dāng)A549 細(xì)胞受到氧化應(yīng)激原刺激后，首先會引起細(xì)胞內(nèi)的ROS 增加，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量的MDA 產(chǎn)物。為抵抗外界氧化應(yīng)激原刺激和維持細(xì)胞正常的生長，機(jī)體的抗氧化酶系發(fā)揮作用，但當(dāng)外界刺激程度過強(qiáng)時，自身的抗氧化酶系無法彌補(bǔ)外界刺激造成的細(xì)胞損傷，就會導(dǎo)致大量的抗氧化酶消耗和活性降低，氧化動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，并對線粒體和DNA 造成損傷，引起線粒體通路中的Bcl-2/Bax 的比值下調(diào)，Cytochrome c、Caspase-9 和Caspase-3 的mRNA 和蛋白表達(dá)量上調(diào)，誘導(dǎo)其凋亡，最終使細(xì)胞的存活率降低和凋亡率增加。本研究結(jié)果顯示，BA 能提高A549 細(xì)胞存活率，降低MDA 和胞內(nèi)ROS 水平，抑制H2O2所引起的抗氧化酶活力降低和相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)水平。這與Zhang 等[35]、Tang 等[19]和Isaak 等[36]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以BA 為研究對象，以H2O2誘導(dǎo)A549細(xì)胞建立氧化損傷模型，分別從細(xì)胞存活率、凋亡率、MDA 和胞內(nèi)ROS 水平、抗氧化酶活性及其基因表達(dá)、凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量來探討B(tài)A對H2O2誘導(dǎo)A549 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。結(jié)果表明，BA 能顯著抑制H2O2引起的A549 細(xì)胞存活率降低，同時降低細(xì)胞凋亡率、MDA 和胞內(nèi)ROS 水平，提高抗氧化酶系酶活力和抗氧化酶相對mRNA 表達(dá)，并上調(diào)Bcl-2/Bax的比值和下調(diào)Cytochrome c、Caspase-9 和Caspase-3 相對mRNA 和蛋白表達(dá)量。進(jìn)一步說明BA 能通過抑制細(xì)胞凋亡通路蛋白的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗氧化酶活性，清除胞內(nèi)過量ROS，從而達(dá)到緩解H2O2對A549 細(xì)胞造成的損傷。