姜 慧，邢 政，何榮海*，黃六容，馬海樂

（1 江蘇大學(xué)食品物理加工研究院 江蘇鎮(zhèn)江 212013 2 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212013）

大蒜素是在蒜氨酸酶（Alliinase）的作用下生成的[1]。當(dāng)大蒜破碎時(shí)，蒜氨酸酶會(huì)和蒜氨酸相遇發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸、氨以及包括大蒜素在內(nèi)的8 種硫代亞磺酸酯[2]。大蒜素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定[3-5]。馬海樂等[6]研究表明大蒜素的降解反應(yīng)與溫度、真空度和光照等因素均有密切關(guān)系，在溫度低于80 ℃、真空和避光的條件下大蒜素較穩(wěn)定。李文清等[7]研究發(fā)現(xiàn)溫度升高，會(huì)使大蒜素水溶液的穩(wěn)定性降低。在80 ℃下，大蒜素只需30 min 即可接近完全分解[8]，而對(duì)于新切大蒜，大蒜素的半衰期僅為2.5 d[9]。

大蒜素的不穩(wěn)定性大大降低了其利用價(jià)值。大蒜素的穩(wěn)定性技術(shù)主要有制備大蒜素微膠囊、大蒜素脂質(zhì)體以及大蒜素二硫鍵結(jié)合物等。陳建清等[10]利用β-環(huán)糊精包結(jié)絡(luò)合法制備大蒜素微膠囊，產(chǎn)品性能良好，而β-環(huán)糊精原料價(jià)格較高。何榮海等[11-12]利用超聲輔助提取大蒜辣素，提取率明顯提高，且利用噴霧干燥法制備的大蒜素微膠囊，有效防止了大蒜素的破壞和損失，然而微膠囊中的大蒜素含量較低。大蒜素脂質(zhì)體具有靶向性，能延長(zhǎng)大蒜素的作用時(shí)間，而脂質(zhì)體膜是動(dòng)態(tài)膜，脂質(zhì)體顆粒易自發(fā)聚集、沉淀，造成脂質(zhì)體形態(tài)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[13]。Jiang 等[14]制備大蒜素與乳清分離蛋白的二硫鍵結(jié)合物，在不同溫度下貯藏后的結(jié)合物的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于大蒜素。目前市場(chǎng)上大多數(shù)的蒜素產(chǎn)品的有效活性成分主要為大蒜素的降解產(chǎn)物[15]，服用這些大蒜素產(chǎn)品后，血液和排泄物中也檢測(cè)不到大蒜素。關(guān)于大蒜素在人體內(nèi)的消化利用情況的報(bào)道較少，主要原因是大蒜素易揮發(fā)和降解，其降解產(chǎn)物有幾十種，很難對(duì)其進(jìn)行定量分析。目前大蒜素與蛋白的結(jié)合物在胃腸中的消化情況還未見報(bào)道。通過研究結(jié)合物的消化特性，可為更好探究及發(fā)揮其生理活性奠定基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)意義。

體外模擬消化模型與簡(jiǎn)單利用消化酶酶解相比，可以較好地模擬真實(shí)的胃腸道消化環(huán)境，預(yù)測(cè)結(jié)合物的消化特性，更好地檢測(cè)樣品在消化過程中發(fā)生的物理、化學(xué)變化[16]。本文利用體外模擬消化模型來探究消化過程中大蒜素的降解成分及含量的變化情況，以及大蒜素是否影響蛋白被水解程度、消化率等，以探究結(jié)合物的消化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胃蛋白酶10 000 U/g（來源于豬胃）、胰蛋白酶250 U/g（來源于豬胰腺），上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

2，4，6-三硝基苯磺酸，美國Sigma 公司；其它化學(xué)試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C 氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司；Waters 600 高效液相色譜，美國沃特世科技公司；UDK149 凱氏定氮儀，意大利VELP 有限公司；Lite Sizer 500 激光粒度儀，奧地利Anton-Paar 公司；LYOQUEST-8 凍干機(jī)，日本Telstar公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜素的提取及乳清分離蛋白溶液的制備 新鮮大蒜去皮后用高速組織搗碎機(jī)搗碎，在25℃下酶解反應(yīng)10 min。將蒸餾水與酶解液以1∶4（V/V）混合均勻，在35 ℃下提取1 h 后，于4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液。將上清液抽濾得到大蒜素水提取液[17]。

稱取乳清分離蛋白粉，配制10 mg/mL 的乳清分離蛋白溶液，室溫磁力攪拌2 h，于4 ℃下水合，備用[18-19]。

1.3.2 大蒜素與乳清分離蛋白結(jié)合物的制備 由于蛋白中的巰基能與大蒜素發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，因此蛋白的巰基剩余率可以表征蛋白與大蒜素的結(jié)合程度，巰基剩余率越小，結(jié)合率越高。結(jié)合物的制備參照J(rèn)iang 等[14]的方法，將蛋白進(jìn)行超聲預(yù)處理，提高其巰基含量，增強(qiáng)與大蒜素的結(jié)合能力，超聲后的蛋白立即與新鮮提取的大蒜反應(yīng)。測(cè)定反應(yīng)結(jié)束后的剩余巰基含量，大蒜素與乳清分離蛋白（TS-WPI）結(jié)合物的結(jié)合率按照公式（1）、（2）計(jì)算。

式中：C0——反應(yīng)前的蛋白巰基含量，μmol/g；C1——反應(yīng)后的蛋白巰基含量，μmol/g；P——蛋白的巰基剩余率，%；R——反應(yīng)的結(jié)合率，%。

1.3.3 WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外模擬消化樣品的制備

1） 模擬口腔消化 參照Minekus 等[20]的方法，在此基礎(chǔ)上加以修改。取20 mL 100 mg/mL WPI 及TS-WPI 結(jié)合物溶液置于消化杯中，37 ℃保溫10 min 后加入相同體積的模擬口腔消化液（Simulated Salivary Fluid，SSF），其中包含口腔濃縮液16 mL，0.1 mL 0.3 mol/L 氯化鈣溶液和3.9 mL 超純水，然后調(diào)至pH 7.0，37 ℃，100 r/min 攪拌5 min 后進(jìn)入胃消化階段。

2） 模擬胃消化[21-22]先加入相同體積的模擬胃消化液（Simulated Gastric Fluid，SGF），其中包含25.6 mL 模擬胃濃縮液，0.02 mL 0.3 mol/L 氯化鈣溶液，25 000 U/mL 胃蛋白酶溶液6.4 mL，2.38 mL 超純水，用5.6 mL HCl 溶液調(diào)pH 值至3.0，于37 ℃、100 r/min 磁力攪拌下消化2 h，立即使用液氮滅酶，終止消化。收集上清液，冷凍干燥后備用。

3） 模擬腸消化[21-22]加入相同體積的模擬腸消化液（Simulated Intestinal Fluid，SIF），其中包含44 mL 模擬腸濃縮液，10 mL 160 mmol/L 豬膽鹽溶液，0.16 mL 0.3 mol/L 氯化鈣溶液，20 mL 800 U/mL 胰酶溶液，5.54 mL 超純水，用0.3 mL NaOH 溶液將pH 值調(diào)至7.0，于37 ℃、100 r/min磁力攪拌下消化2 h，分別在不同消化時(shí)間（0，10，20，30，60，120 min）取出消化產(chǎn)物，立即使用液氮滅酶，終止消化。收集上清液，冷凍干燥后備用。

1.3.4 大蒜素提取液及結(jié)合物的體外消化產(chǎn)物測(cè)定

1） 固相微萃取條件[23]取5 mL 胃蛋白酶、胰蛋白酶消化120 min 的WPI 及TS-WPI 結(jié)合物的消化樣品于萃取瓶中，于50 ℃、330 r/min 平衡5 min，調(diào)節(jié)固定桿位置，使萃取頭距離樣品液面上方0.5～1 cm，萃取20 min。萃取結(jié)束后先收萃取頭，再取出萃取針。

2） 氣相色譜條件 參照潘璨等[24]的方法，GC-MS 檢測(cè)采用DB-wax 極性色譜柱，柱長(zhǎng)60 m，內(nèi)徑0.25 mm，厚度0.25 μm，高純氦氣流量1.0 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫：40℃保持1 min，以5 ℃/min 的速率升至150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，保持5 min。

3） 質(zhì)譜條件[24-25]電離方式EI+，電子能量70 eV，電子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描質(zhì)量數(shù)范圍50～450 amu。數(shù)據(jù)收集用HP 化學(xué)工作站軟件對(duì)照NIST08.L 庫進(jìn)行，成分先由譜庫初步鑒定，再結(jié)合化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜、實(shí)際成分等定性。定量采用面積歸一化法相對(duì)定量。

表1 模擬消化液原液的制備Table 1 Preparation of simulated digestive stock solution

1.3.5 模擬消化過程中自由氨基產(chǎn)量的測(cè)定 參照Adler-Nissen 等[26]的方法測(cè)定消化產(chǎn)物的自由氨基產(chǎn)量，并稍作修改。配制0～2 mmol/L L-亮氨酸溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，自由氨基的量根據(jù)L-亮氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 （y=128.9x-0.0011，R2=0.9997）來確定。

1.3.6 模擬消化過程中消化率的測(cè)定 體外消化率可用氮的釋放量表示。采用TCA-NSI 法測(cè)定氮釋放量。取15 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液加入不同消化時(shí)間的WPI 及TS-WPI 結(jié)合物的消化樣品中，10 000 r/min 離心15 min 得到上清液，采用凱氏定氮法測(cè)定TCA 可溶性氮的含量[27]。消化過程氮釋放量（NR）的計(jì)算公式：

式中，NR——氮的釋放量，%；Nt——消化t（min）時(shí)的TCA 可溶性氮，mg；N0——蛋白樣品中的TCA 可溶性氮，mg。

1.3.7 模擬消化過程中粒徑的測(cè)定 配制1 mg/mL WPI 及TS-WPI 結(jié)合物的體外消化產(chǎn)物溶液，采用激光粒度儀測(cè)量消化產(chǎn)物的粒徑[28]。

1.3.8 體外消化樣品分子質(zhì)量分布 參照Yang等[29]的方法測(cè)定消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量。分別取胃蛋白酶、胰蛋白酶消化120 min 的WPI 及TS-WPI結(jié)合物的消化樣品，0.22 μm 有機(jī)膜過濾，得到濾液，色譜柱：TSKgel 3000 SWXL 300×7.8 mm，流動(dòng)相組成為乙腈∶超純水∶三氟乙酸 （45∶55∶0.1，體積比），等梯度洗脫流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的平均洗脫量制備分子質(zhì)量校準(zhǔn)曲線：細(xì)胞色素C（12 500 u），抑酶肽（6 500 u），維生素B12（1 355 u），氧化型谷胱甘肽（612 u）和糖基甘氨酰甘氨酸（189 u）。以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值lg （MW）為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間t 為橫坐標(biāo)，得到校準(zhǔn)曲線，來計(jì)算WPI 及TS-WPI 結(jié)合物消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SPSS 17.0（美國IBM 公司）進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平P 設(shè)定值為0.05，使用Origin 8.6（美國OriginLab 公司）繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素提取液的體外模擬消化產(chǎn)物分析

大蒜素提取液的模擬消化產(chǎn)物的總離子流圖見圖1。鑒定出的各組分成分及相對(duì)含量見表2。保留時(shí)間0.00～37.00 min 內(nèi)，從未消化的大蒜素提取液中共檢測(cè)出9 種揮發(fā)性成分，其中，含硫化物有3 種，分別為1，3-二噻烷、二烯丙基二硫和3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯，占揮發(fā)性化合物總含量的40.09%。這3 種為大蒜素的降解產(chǎn)物，其中3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯為主要成分，占含硫化合物的92.72%。其余揮發(fā)性組分為正棕櫚酸、冠醚類和鄰苯二甲酸二異丁酯等。

表2 大蒜素提取液體外消化產(chǎn)物的揮發(fā)性成分Table 2 Allicin extracts volatile constituents of digested products outside the liquid

圖1 大蒜素提取液的體外消化產(chǎn)物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of in vitro digestion products of allicin extraction solution

大蒜素提取液經(jīng)模擬胃消化后，1，3-二噻烷和二烯丙基二硫含量均提高，3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯含量降低不明顯，仍為含量最高的化合物，3 種含硫化合物共占揮發(fā)性總含量的38.06%，較未消化前含量降低。腸消化終點(diǎn)，揮發(fā)性成分的種類和含量發(fā)生變化，含硫化合物的含量降低，占揮發(fā)性成分總含量的31.55%，二烯丙基二硫醚含量增加 （P＜0.05），占含硫化合物的72.14%，說明經(jīng)腸消化，大蒜素降解產(chǎn)物的主要成分由3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯變?yōu)槎┍蛎选Ｕ貦八岷袜彵蕉姿岫惗□ズ慷急憩F(xiàn)為下降。

2.2 TS-WPI 結(jié)合物的體外模擬消化產(chǎn)物的分析

TS-WPI 結(jié)合物的模擬胃、腸消化產(chǎn)物的總離子流圖如圖2所示。鑒定出的各組分成分及相對(duì)含量見表3。在保留時(shí)間0.00～37.00 min 內(nèi)，從未消化結(jié)合物中共檢測(cè)出11 種揮發(fā)性成分，其中，含硫化合物共5 種，分別為亞丙基硫2.49%、1，3-二噻烷1.16%、二烯丙基二硫19.77%、戊烷-3-硫醇14.84%和3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯23.02%，占揮發(fā)性化合物總含量的61.28%。其中3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯為主要成分，與大蒜素提取液中相同，而二烯丙基二硫醚含量比大蒜素提取液中含量高。結(jié)合物經(jīng)模擬胃消化后，二烯丙基二硫、3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯含量有所降低，出現(xiàn)戊酸異丙酯類物質(zhì)。3 種含硫化合物共占總揮發(fā)性含量的43.81%。腸消化終點(diǎn)，含硫化合物含量降低，占揮發(fā)性化合物總含量的42.77%，而二烯丙基二硫醚含量（35.88%）增加（P＜0.05），為含硫化合物的主要成分，并出現(xiàn)環(huán)十二烷、鄰苯二甲酸二異丁酯等物質(zhì)。

表3 超聲預(yù)處理的TS-WPI 結(jié)合物（61%結(jié)合率）體外消化產(chǎn)物的揮發(fā)性成分Table 3 Ultrasonic pretreated TS-WPI conjugate （61% binding rate） volatile components of in vitro digestion products

圖2 超聲預(yù)處理的TS-WPI 結(jié)合物（61%結(jié)合率）體外消化產(chǎn)物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of ultrasonically pretreated TS-WPI conjugate （61% binding rate） in vitro digestion products

綜上，模擬消化試驗(yàn)表明，大蒜素提取液與結(jié)合物在胃、腸消化后揮發(fā)性成分中的含硫化合物含量均降低，在腸消化階段消化產(chǎn)物的揮發(fā)性成分更為復(fù)雜。大蒜素與蛋白結(jié)合后，胃、腸消化產(chǎn)物的含硫化合物組分與大蒜素提取液的消化產(chǎn)物相同，3-乙烯基-1，2-二硫環(huán)己-4-烯主要在模擬胃消化階段被釋放，而二烯丙基二硫醚主要在模擬腸消化時(shí)被釋放。由此可知大蒜素與蛋白結(jié)合后不會(huì)影響大蒜素消化產(chǎn)物的生理活性的發(fā)揮。

2.3 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化過程中自由氨基產(chǎn)量的影響

結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物消化過程中自由氨基產(chǎn)量的影響如圖3所示。在胃消化階段，所有樣品的自由氨基的量都呈緩慢上升趨勢(shì)。在胃消化終點(diǎn)，自由氨基物質(zhì)的量在0.08～0.10 mol，自由氨基的釋放量可以體現(xiàn)蛋白質(zhì)的水解情況，因此WPI 及TS-WPI 結(jié)合物在胃消化階段的水解度都很低。王娟等[30]分別用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解乳清蛋白，測(cè)得其水解度分別為8.00%和61.02%。這是由于乳清蛋白中含有β-乳球蛋白（β-Lg），β-Lg 中β-折疊結(jié)構(gòu)會(huì)埋藏氨基酸殘基間的靶肽鍵，導(dǎo)致胃蛋白酶不易與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使β-Lg 在胃酸性環(huán)境中對(duì)胃蛋白酶具有抗性，從而降低了胃蛋白酶的水解度。WPI 與TS-WPI 結(jié)合物的水解度無顯著性差異，表明大蒜素結(jié)合蛋白后沒有改變其在胃消化時(shí)的水解情況。

圖3 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化過程中自由氨基含量的影響Fig.3 Effect of binding rate on free amino content of WPI and TS-WPI conjugates during in vitro digestion

在腸消化的前20 min，自由氨基的釋放量顯著提高，表明樣品剛進(jìn)入腸道后水解度急劇增加。隨著消化時(shí)間的增加，自由氨基的量逐漸趨于穩(wěn)定。在腸消化終點(diǎn)，不同結(jié)合率的結(jié)合物的自由氨基的量沒有顯著性差異，都小于超聲預(yù)處理的蛋白的自由氨基的量，表明超聲使蛋白在模擬腸消化時(shí)的水解度增加，而蛋白結(jié)合大蒜素后的水解度并無顯著性變化。綜上，結(jié)合物都在胃蛋白酶階段不易水解，在胰蛋白酶階段更易水解，大蒜素不影響蛋白在模擬胃腸消化時(shí)的水解度。

2.4 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化率的影響

結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 體外消化率的影響如圖4所示。WPI 及TS-WPI 結(jié)合物的在胃、腸階段的體外消化率都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在胃消化階段，超聲后的蛋白消化率較高，與結(jié)合物相比具有顯著性差異，原因可能是超聲產(chǎn)生的空化作用使WPI 的結(jié)構(gòu)伸展，從而與消化酶的結(jié)合位點(diǎn)增多，使消化率得到提高。所有樣品的消化率在16.00%～22.28%范圍內(nèi)，消化率偏低，且大蒜素不會(huì)影響WPI 在模擬胃消化時(shí)的消化率。Mahé 等[31]研究證明，在人胃中檢測(cè)到的大部分乳清蛋白仍為完整蛋白質(zhì)，這也說明乳清蛋白在胃中較不容易被消化。

圖4 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化率的影響Fig.4 Effect of binding rate on in vitro digestibility of WPI and TS-WPI conjugates

在腸消化階段，消化率大小依次為超聲的WPI（超聲）＞W(wǎng)PI（未超聲）＞61%結(jié)合率的結(jié)合物＞38%結(jié)合率結(jié)合物（超聲）＞61%結(jié)合率結(jié)合物（超聲），所有樣品的消化率都在40%以上。其原因是樣品消化率與水解度有關(guān)，樣品水解為一種預(yù)消化的肽段形式，更容易被機(jī)體消化利用。蛋白超聲后變得更易被消化，而TS-WPI 結(jié)合物的消化率較WPI 低（P＜0.05），不同結(jié)合率的結(jié)合物的消化率沒有顯著性差異。原因一方面可能是蛋白與大蒜素結(jié)合后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶與底物的活性位點(diǎn)改變；另一方面可能與樣品的溶解度有關(guān)，大蒜素結(jié)合蛋白后溶解度降低，消化率略微降低[32]。總體來說，結(jié)合物與蛋白相比變得較不易被消化，結(jié)合物在模擬腸消化階段更易被消化。

2.5 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化產(chǎn)物粒徑的影響

WPI 及TS-WPI 結(jié)合物在模擬胃、腸消化過程中的粒徑大小如圖5所示。消化前，超聲后的蛋白平均粒徑最小，為1 302 nm。結(jié)合物的平均粒徑均大于蛋白，61%結(jié)合率的結(jié)合物的平均粒徑最大為2 510 nm，平均粒徑的大小可間接反映溶液中粒子間的相互作用情況，大蒜素結(jié)合蛋白后，粒子間的相互作用較強(qiáng)烈。隨著消化時(shí)間的增加，樣品的粒徑均為下降趨勢(shì)，在腸消化階段粒徑的減小更明顯。在腸消化終點(diǎn)，WPI、超聲的WPI、61%結(jié)合率的結(jié)合物、38%和61%結(jié)合率的結(jié)合物（超聲） 的腸消化產(chǎn)物平均粒徑為400.29，448.29，690.30，478.74，687.90 nm。大蒜素結(jié)合蛋白后，結(jié)合物的消化產(chǎn)物的平均粒徑均比蛋白消化產(chǎn)物的平均粒徑大（P＜0.05）。這可能是結(jié)合物消化產(chǎn)物表面的親水性基團(tuán)較蛋白少，影響結(jié)合物顆粒的水化膜，使顆粒聚集所致。

圖5 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化產(chǎn)物粒徑的影響Fig.5 Effect of binding rate on particle size of WPI and TS-WPI conjugates in vitro digestion products

結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 體外消化產(chǎn)物多分散指數(shù)的影響見表4。多分散指數(shù)（PDI）可以反映粒子粒徑的均一性。PDI＜0.05 為單分散體系，PDI＜0.08 為近單分散體系，PDI 在0.08～0.7 范圍屬于適中分散度的體系。PDI＞0.7 是尺寸分布非常寬的體系。由表4可知，胃、腸消化產(chǎn)物為適中分散度的體系，隨著消化時(shí)間的增加，PDI 值逐漸減小。胃、腸消化后PDI 值分別在0.25～0.36 和0.19～0.27 之間，表明腸消化時(shí)顆粒分布更為集中，更加均勻。結(jié)合率越高，TS-WPI 結(jié)合物的PDI 值越大（P＜0.05），顆粒分布范圍越廣。

表4 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化產(chǎn)物多分散指數(shù)的影響Table 4 Effect of binding rate on polydispersity intelligence index of in vitro digestion products of WPI and TS-WPI conjugates

2.6 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布影響

溶液顆粒粒徑的大小易受分子結(jié)構(gòu)舒展?fàn)顟B(tài)、粒子間相互作用及聚集狀態(tài)等因素的影響。為更好地研究結(jié)合物在體內(nèi)被消化程度，測(cè)定結(jié)合物的分子質(zhì)量。WPI 及不同結(jié)合率的TS-WPI 結(jié)合物的模擬消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量色譜圖見圖6，分子質(zhì)量分布情況見表5。由表5可知，經(jīng)胃消化后，樣品的分子質(zhì)量范圍主要分布在20～100 ku之間，這部分的峰面積占總面積的70%左右。對(duì)于分子質(zhì)量大于100 ku 的組分，胃消化產(chǎn)物含量與消化前相比明顯減少，蛋白由1.97%降到0.04%。61%結(jié)合率的結(jié)合物（超聲）由0.23%降到0。結(jié)合物分子質(zhì)量大于100 ku 的組分都比蛋白或超聲后的蛋白低，并有顯著性差異（P＜0.05）。對(duì)于小于20 ku 的組分，WPI、超聲后WPI 和超聲預(yù)處理后的結(jié)合物經(jīng)模擬胃消化后，在此分子質(zhì)量范圍的含量分別增加27.06%，22.53%，18.22%，結(jié)合物比蛋白的含量高（P＜0.05），表明大蒜素與蛋白的結(jié)合物的小分子質(zhì)量組分更多。

圖6 WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量色譜圖Fig.6 Molecular weight chromatogram of in vitro digestion products of WPI and TS-WPI conjugates

表5 結(jié)合率對(duì)WPI 及TS-WPI 結(jié)合物體外消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的影響Table 5 Effect of binding rate on molecular weight distribution of in vitro digestion products of WPI and TS-WPI conjugates

在腸消化終點(diǎn)，分子質(zhì)量分布范圍向小分子質(zhì)量靠近。分子質(zhì)量大于50 ku 的組分最高，僅占0.78%，10 ku 以下的組分占80%左右，大于5 ku的組分含量比WPI 少，小于5 ku 的組分含量都比WPI 多（P＜0.05），不同結(jié)合率的結(jié)合物的分子質(zhì)量分布沒有顯著性差異。經(jīng)模擬胃腸消化后蛋白和大分子多肽被分解為分子質(zhì)量更小的多肽，TSWPI 結(jié)合物在胃、腸消化時(shí)小分子質(zhì)量組分更多，更易被吸收利用。

3 結(jié)論

體外模擬胃、腸消化試驗(yàn)表明，大蒜素提取液與結(jié)合物經(jīng)胃、腸消化后，含硫化合物的含量降低，其中在模擬腸消化階段的揮發(fā)性成分更為復(fù)雜。結(jié)合物的消化產(chǎn)物在模擬胃、腸消化時(shí)的含硫化合物的組成成分與大蒜素提取液的消化產(chǎn)物相同，表明大蒜素結(jié)合蛋白后穩(wěn)定性增加的同時(shí)，大蒜素生理活性的發(fā)揮也可能不受影響。乳清蛋白和結(jié)合物都在胰蛋白酶消化階段更容易水解，大蒜素不影響蛋白在模擬胃、腸消化時(shí)的水解度。大蒜素結(jié)合蛋白后，結(jié)合物的消化產(chǎn)物的粒徑分布范圍較廣。蛋白及結(jié)合物經(jīng)模擬胃、消腸化后分子質(zhì)量分布范圍向小分子質(zhì)量靠近，結(jié)合物與蛋白相比更容易被吸收利用。