李明亮，姜 放，魏 穎*，張瑞雪，張海欣，蔡木易，谷瑞增

（1 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京 100015 2 華狐生物科技（中國）有限公司 沈陽 110000）

具有特殊生理活性的小肽可以通過影響消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等對人體機能產(chǎn)生積極影響[1]。低分子質(zhì)量的肽比蛋白質(zhì)或游離氨基酸更具生物利用度，通常表現(xiàn)出比母體蛋白更高的生物活性[1-2]。

食源性低聚肽主要來源于海洋生物和陸地動植物，其中海洋生物是結(jié)構(gòu)多樣的生物活性物質(zhì)的儲存庫，包括蛋白質(zhì)和多肽[3]，且海洋生物蛋白的氨基酸組成和排列順序也不同于陸地生物。牡蠣是世界上范圍最大的養(yǎng)殖貝類，已進入我國原衛(wèi)生部公布的藥食同源清單。牡蠣富含蛋白質(zhì)，氨基酸組成完整，尤其富含?；撬醄4]，多項研究表明牡蠣肽具有抗氧化、抗疲勞、增強免疫、保護肝臟和增強性功能等活性[5]。然而，海洋來源的生物活性肽一般具有帶疏水性側(cè)鏈的殘基，有明顯的苦味[3]。紫蘇是我國原衛(wèi)生部公布的第1 批藥食同源作物[6]，紫蘇籽蛋白濕重含量為20%～23%[7]，且氨基酸種類齊全，組成均衡[8]，可作為優(yōu)質(zhì)的活性肽來源。目前對紫蘇肽的研究多集中在抗氧化特性上，已開發(fā)的紫蘇肽功能較單一。

男性性功能障礙是一種常見病，發(fā)病率約占成年男性的10%[9]。血清中雄激素水平降低，腎臟或睪丸的病理狀態(tài)都可嚴重損傷男性生育能力或引起性功能障礙。精氨酸對男性生殖有著重要作用，可以參與精子生成，促進精子運動，合成信號分子NO，延緩精子細胞膜脂質(zhì)過氧化等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，補充精氨酸或富含精氨酸的蛋白質(zhì)和多肽可以改善機體的生殖損傷狀況，提高男性生育能力和性功能。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣肽和紫蘇籽肽中富含精氨酸和其它多種功能性氨基酸，推測它們可能會對男性生殖和性功能產(chǎn)生積極影響。由于動物氮源比植物氮源更易被機體吸收和利用，因此本試驗同時探究二者復配是否協(xié)同增效。

為了開發(fā)具有改善性功能損傷作用的低聚肽，本試驗首先制備牡蠣肽和紫蘇籽肽，通過氨基酸自動分析儀和高效液相色譜檢測兩種肽的氨基酸組成及相對分子質(zhì)量。通過對雄性大鼠注射環(huán)磷酰胺造成大鼠的性功能損傷，對該模型大鼠灌胃牡蠣肽和紫蘇籽肽及兩者的復配物，探究兩種肽及復配物對大鼠性功能損傷的改善作用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽和紫蘇籽肽為實驗室制備；L-精氨酸、西地那非，北京索萊寶科技有限公司；環(huán)磷酰胺，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；大鼠睪酮（T）ELISA 試劑盒、大鼠游離睪酮（FT）ELISA 試劑盒，南京森貝伽生物科技；Rodent FSH Elisa test kit、Rodent luteinizing hormone （LH） Elisa test kit，美國Endocrine Tech 公司；大鼠白蛋白（ALB）ELISA 試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；丙二醛（MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra MR 多功能酶標儀，美國Dynex 公司；A300 氨基酸自動分析儀，德國membrapureGmbH公司；UDK-159 全自動凱氏定氮儀，意大利VELP公司；LC-20AD 型高效液相色譜儀，日本SHIMADZU 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牡蠣肽和紫蘇籽肽的制備及檢測

牡蠣肽：牡蠣肉打漿→定容，調(diào)節(jié)pH 值→離心→酶解→離心→滅酶→陶瓷膜過濾，濃縮→過濾→滅菌→噴霧干燥→牡蠣肽

獲得的牡蠣肽和紫蘇籽肽參考GB 5009.5-2016 利用全自動凱氏定氮儀對樣品中蛋白質(zhì)含量進行測定；參考GB/T 22729-2008 對樣品中酸溶蛋白含量進行測定，利用高效液相色譜儀對樣品相對分子質(zhì)量進行測定；參考GB 5009.124-2016 利用氨基酸自動分析儀對樣品中氨基酸組成進行測定。

1.3.2 動物飼養(yǎng)及處理 100 只6 周齡SPF 級SD 雄性大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重（260±20） g，動物飼養(yǎng)在無菌環(huán)境，溫度（20±2）℃。試驗期間動物自由進食和飲水。以西地那非和精氨酸為陽性對照，大鼠隨機分為10組，每組10 只，分別為空白組、模型組、西地那非組、精氨酸組、牡蠣肽低、高劑量組，紫蘇籽肽低、高劑量組，復配低、高劑量組，除空白組外，其余各組每天腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg，連續(xù)5 d，建立生殖損傷模型，空白組注射等體積生理鹽水；西地那非灌胃劑量為5 mg/（kg·bw），精氨酸灌胃劑量為0.3 g/（kg·bw），各低劑量組灌胃劑量為0.3 g/（kg·bw），各高劑量組灌胃劑量為0.6 g/（kg·bw），復配比例為牡蠣肽∶紫蘇籽肽=1∶1，連續(xù)灌胃6 周。

大鼠末次灌胃后禁食12 h，眼眶取血，血液于4 ℃下放置過夜，離心后收集血清于-80 ℃保存?zhèn)溆?；大鼠麻醉后處死，收集大鼠腎臟和睪丸，稱重后切取小部分組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，用于HE染色分析，剩余腎臟和睪丸組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 大鼠體重測定 灌胃前1 周至末次灌胃后1 周，各組大鼠每周稱重并記錄。

1.3.4 大鼠腎臟和睪丸指數(shù)測定 腎臟和睪丸組織稱重并計算臟器指數(shù)，計算公式為：臟器指數(shù)（mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.3.5 血清指標的檢測 根據(jù)試劑盒說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清中睪酮（T）、游離睪酮（FT）、促黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、血清白蛋白（ALB）水平。

1.3.6 腎臟和睪丸抗氧化檢測 將冷凍的腎臟和睪丸組織用預冷的生理鹽水制成10%勻漿，按照試劑盒說明，檢測超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px） 活力以及丙二醛（MDA）含量。

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1.3.7 睪丸HE 染色 適當大小的腎臟和睪丸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟，蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Prism 8.0 軟件對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理及繪圖，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比較（multiple comparisons），試驗結(jié)果以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05 具有顯著性差異，P＜0.01 具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 牡蠣肽和紫蘇籽肽的檢測結(jié)果

組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20 種，包括8 種必需氨基酸和其它具有特殊功能的功能性氨基酸。精氨酸可以促進部分激素分泌，維持骨骼肌功能，以及作為生成信號分子NO 的底物[11]，此外還可以參與精子生成[10]；半胱氨酸可以通過代謝產(chǎn)生谷胱甘肽參與自由基消除反應；脯氨酸通過其代謝產(chǎn)物5-吡咯啉羧酸進而調(diào)控細胞增殖和DNA 合成以及影響促進精子生成的多胺類物質(zhì)的合成；谷氨酸可以作為核苷酸合成的能量底物[10]；賴氨酸可以促進礦物吸收和骨骼生長[12]；天冬氨酸可以參與核苷酸代謝，促進細胞周期進程[13]；亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸還具有促進蛋白合成，清除自由基，保護線粒體等作用[14]。氨基酸組成檢測結(jié)果如表1所示：牡蠣肽和紫蘇籽肽都含有多種功能性氨基酸，尤其富含天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸，其中紫蘇籽肽的谷氨酸和精氨酸含量顯著高于牡蠣肽，牡蠣肽的賴氨酸含量顯著高于紫蘇籽肽。高效液相色譜分析結(jié)果見表2，牡蠣肽的平均相對分子質(zhì)量顯著低于紫蘇籽肽，分子質(zhì)量低于1 000 的肽段所占比例也比紫蘇籽肽顯著提高，二者的蛋白質(zhì)含量和酸溶蛋白含量則無顯著差異。

表2 牡蠣肽和紫蘇籽肽的蛋白含量與分子質(zhì)量Table 2 Protein content and molecular weight of oyster peptide and perilla seed peptide

2.2 牡蠣肽和紫蘇籽肽對大鼠體重的影響

圖1為在灌胃處理前1 周到末次灌胃后1 周大鼠體重隨時間變化，圖2為末次灌胃1 周后大鼠體重與初始體重相比的增加量?？梢钥闯?，灌胃開始前各組大鼠的體重沒有顯著差別，在第7 周時，復配低、高劑量組、精氨酸組和模型組大鼠體重高于空白組，紫蘇籽肽低、高劑量組和牡蠣肽低、高劑量組以及西地那非組大鼠體重低于空白組，但是各組與空白組之間沒有顯著性差異。在第7 周時，除模型組，復配高劑量組，牡蠣肽低、高劑量組外，其余各組大鼠體重都出現(xiàn)了一定程度的下降，其原因需要進一步研究討論。

圖1 7 周干預期內(nèi)大鼠體重變化Fig.1 Changes in rat body weight during the seven-week intervention period

圖2 7 周后大鼠體重增長量Fig.2 Weight gain after seven weeks

2.3 牡蠣肽和紫蘇籽肽對大鼠臟器指數(shù)的影響

由表3大鼠腎臟和睪丸的臟器指數(shù)測定結(jié)果可知，各組的腎臟指數(shù)與模型組相比并無顯著差異，但是模型組睪丸指數(shù)相比于空白組顯著下降（P＜0.05），是空白組的77.95%，兩個陽性對照組的睪丸指數(shù)相比于模型組有顯著提高，各處理組睪丸指數(shù)相比于模型組也顯著提高，其中牡蠣肽低、高劑量組分別是空白組的93.83%和99.69%，紫蘇籽肽低、高劑量組分別是空白組的95.51%和96.76%，復配低、高劑量組分別是空白組的97.39%和100.84%，可以看出牡蠣肽和紫蘇籽肽都可顯著提高模型大鼠的睪丸指數(shù)，且二者的復配作用效果略強于單獨的牡蠣肽或紫蘇籽肽。

表3 大鼠腎臟與睪丸的臟器指數(shù)Table 3 Organ index of rat kidney and testis

2.4 牡蠣肽和紫蘇籽肽對大鼠血清指標的影響

睪酮（T）是主要的雄激素，血液中的游離睪酮（FT）通過循環(huán)到達目標細胞后，結(jié)合和激活雄激素受體進而發(fā)揮作用，是精子發(fā)生和男性生殖所必需的，成人睪酮缺乏會增加身體脂肪和疲勞，降低肌肉質(zhì)量、骨密度、認知功能和免疫反應[15]。促性腺激素包括卵泡刺激素 （FSH） 和黃體生成素（LH）[16]，在睪丸中，F(xiàn)SH 與支持細胞膜上的受體結(jié)合可促進精子發(fā)生[17]，LH 與間質(zhì)細胞膜上的受體結(jié)合可促進睪酮合成[18]，它們協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)睪丸功能，促進睪酮合成，維持正常的精子發(fā)生，精子的健康和密度。

如圖3所示，模型組T 水平相比于空白組顯著降低（P＜0.05），是空白組的77.63%，兩個陽性對照組T 水平相比于模型組均有不同程度提高，牡蠣肽低、高劑量組T 水平相比于模型組都顯著升高，分別是模型組的1.33 和1.29 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組T 水平分別是模型組的1.17 和1.24 倍，復配低、高劑量組分別是模型組的1.28 和1.26倍；模型組FT 水平相比于空白組有所下降，是空白組的90.00%，兩個陽性對照組FT 水平相比于模型組均有不同程度提高，牡蠣肽低、高劑量組FT 水平分別是模型組的1.49 和1.52 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組FT 水平分別是模型組的1.29 和1.14 倍，復配低、高劑量組FT 水平分別是模型組的1.37 和1.32 倍；模型組FSH 水平相比于空白組有所下降，是空白組的86.50%，兩個陽性對照組FSH 水平相比于模型組沒有顯著差別，牡蠣肽低、高劑量組FSH 水平分別是模型組的1.49 和1.01 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組FSH 水平分別是模型組的1.23 倍和1.00 倍，復配低、高劑量組FSH 水平分別是模型組的1.20 和1.28 倍；模型組LH 水平相比于空白組極顯著下降（P＜0.01），是空白組的28.89%，陽性對照組中精氨酸組LH 水平相比于模型組顯著提高，牡蠣肽低、高劑量組LH水平分別是模型組的4.21 和3.56 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組LH 水平分別是模型組的3.51 倍和3.92 倍，復配低、高劑量組LH 水平分別是模型組的3.46 和3.39 倍?？梢钥闯?，牡蠣肽和紫蘇籽肽都可提高模型大鼠血清中雄激素和促性腺激素水平，牡蠣肽的作用效果強于紫蘇籽肽，復配組的作用效果強于同等劑量的紫蘇籽肽。

圖3 血清雄激素和促性腺激素水平Fig.3 Serum androgen and gonadotropin levels

白蛋白（ALB）是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，具有多種生物學功能，例如維持血壓、營養(yǎng)支持、抗氧化、運輸和排毒作用[19-20]，低血清白蛋白水平與多種疾病以及老年人認知障礙有關(guān)[21-22]，在營養(yǎng)不良和炎癥等狀況下，血清白蛋白水平都會下降[23]。

由圖4可以看出，模型組ALB 水平相比于空白組有所下降，是空白組的89.19%，精氨酸組ALB 水平相比于模型組有所提高，但并無顯著性差別，牡蠣肽低、高劑量組ALB 水平分別是模型組的1.44 和2.04 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組分別是模型組的1.08 和1.25 倍，復配低、高劑量組ALB 水平分別是模型組的1.33 和1.61 倍。可以看出，牡蠣肽對大鼠血清中ALB 水平的提升作用最強，復配組的作用效果強于等劑量的紫蘇籽肽。

圖4 血清白蛋白水平Fig.4 Serum albumin levels

2.5 腎臟和睪丸抗氧化檢測結(jié)果

SOD 是重要的抗氧化酶，能將O2-還原為H2O2，GSH-Px 可與H2O2反應，通過氧化還原型谷胱甘肽[24]，達到防止細胞脂質(zhì)過氧化的作用[25]。MDA 是細胞膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可以用來評價細胞脂質(zhì)過氧化程度。

由圖5可以看出，模型組和空白組以及陽性對照組之間SOD 活力并無顯著差異，各處理組之間相比于模型組都有極顯著差異（P＜0.01），其中牡蠣肽低、高劑量組SOD 活力分別是模型組的2.49 和2.31 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組SOD 活力分別是模型組的2.34 和2.56 倍，復配低、高劑量組SOD 活力分別是模型組的2.23 和2.27 倍；模型組MDA 含量相比于空白組顯著升高，是空白組的1.46 倍，精氨酸組MDA 含量相比于模型組有所下降，但無顯著性差異，牡蠣肽高劑量組和紫蘇籽肽低劑量組MDA 含量相比于模型組都顯著降低，分別是模型組的60.13%和67.06%，兩個復配組中MDA 含量也有所下降，且與紫蘇籽肽兩組作用效果沒有顯著差異；模型組GSH-Px 活力低于空白組，是空白組的86.88%，兩個陽性對照組GSH-Px 活力相比于模型組有所提高但無顯著性差異，牡蠣肽低、高劑量組GSH-Px 活力相比于模型組出現(xiàn)了進一步下降，分別是模型組的97.65%和92.98%，紫蘇籽肽低、高劑量組GSH-Px 活力相比于模型組有所提高，分別是模型組的1.26 和1.28 倍；兩個復配組中GSH-Px 活力相比于模型組有所提高，分別是模型組的1.05 倍和1.04 倍，低于紫蘇籽肽組，但相比于牡蠣肽組有所提高?？梢钥闯瞿迪犽暮妥咸K籽肽都可以改善模型大鼠腎臟的氧化應激狀態(tài)，且紫蘇籽肽的綜合效果強于牡蠣肽。

圖5 腎臟抗氧化檢測Fig.5 Detection of renal antioxidant

由圖6可以看出，模型組SOD 活力相比于空白組極顯著下降（P＜0.01），是空白組的69.68%，精氨酸組和各處理組相比于模型組SOD 活力都有所提高但都無顯著性差異，其中牡蠣肽低、高劑量組SOD 活力分別是模型組的1.15 和1.04 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組SOD 活力分別是模型組的1.07 和1.15 倍，復配低、高劑量組SOD 活力分別是模型組的1.13 和1.14 倍；模型組MDA 含量相比于空白組顯著升高（P＜0.05），是空白組的1.42倍，兩個陽性對照組MDA 含量相比于模型組都顯著下降，牡蠣肽低、高劑量組MDA 含量分別是模型組的1.06 倍和95.16%，紫蘇籽肽低、高劑量組MDA 含量分別是模型組的62.39%和80.37%，復配低、高劑量組MDA 含量分別是模型組的91.38%和89.25%；模型組GSH-Px 活力相比于空白組極顯著降低（P＜0.01），是空白組的71.64%，兩個陽性對照組GSH-Px 活力相比于模型組都有所提高，尤其是精氨酸組極顯著提高（P＜0.01），牡蠣肽低、高劑量組GSH-Px 活力分別是模型組的1.25 和1.09 倍，紫蘇籽肽低、高劑量組GSH-Px活力分別是模型組的1.62 和1.61 倍，復配低、高劑量組GSH-Px 活力分別是模型組的1.46 和1.43倍?？梢钥闯瞿迪犽暮妥咸K籽肽都可改善模型大鼠睪丸的氧化應激狀態(tài)，且紫蘇籽肽的作用效果強于牡蠣肽。

圖6 睪丸抗氧化檢測Fig.6 Detection of testis antioxidant

2.6 腎臟和睪丸HE 染色分析

由睪丸HE 染色結(jié)果可見，空白組生精小管基膜完整，生精上皮較厚，生精細胞層次和數(shù)量豐富，大量生精細胞和支持細胞排列緊密有序，形態(tài)規(guī)則正常，管腔形狀規(guī)則，管腔中可見大量精細胞。模型組生精小管的生精上皮變薄，生精細胞數(shù)量銳減，生精細胞和支持細胞排列稀疏，部分生精細胞脫落至管腔中，管腔中形成明顯空腔。各處理組尤其是各高劑量組相比于模型組睪丸形態(tài)出現(xiàn)了明顯改善，生精細胞數(shù)量明顯增加，管腔中空腔情況明顯改善。

圖7 睪丸HE 染色Fig.7 HE staining of testis

如圖8所示，空白組腎小囊腔明顯，血管球形態(tài)正常，基膜完整，腎小管形態(tài)正常；模型組腎小體腫脹增大變形，球內(nèi)細胞增加，腎小囊腔變小，毛細血管間間隙增大；各處理組的腎小體腫大變形狀況得到了一定程度的改善。

圖8 腎臟HE 染色Fig.8 HE staining of kidney

3 結(jié)論

環(huán)磷酰胺的代謝物通過形成共價DNA 加合物顯示細胞抑制作用[26]，與睪丸生化和組織學改變有關(guān)，環(huán)磷酰胺造成的生殖損害主要是因為氧化應激、脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷和谷胱甘肽水平降低[27]，從而造成促性腺激素分泌紊亂、睪丸損傷和血漿睪酮水平降低。本試驗采用環(huán)磷酰胺致雄性大鼠性功能損傷模型，結(jié)果顯示，牡蠣肽和紫蘇籽肽以及二者的復配都可以提高模型大鼠睪丸指數(shù)以及血清中雄激素和促性腺激素水平，提高血清白蛋白水平，改善腎臟和睪丸的氧化應激狀態(tài)和組織結(jié)構(gòu)變化，從而改善模型大鼠的生殖損傷狀況。牡蠣肽對模型大鼠血清雄激素和促性腺激素的影響最突出，紫蘇籽肽對腎臟和睪丸氧化應激狀態(tài)的改善作用強于牡蠣肽，二者的復配可以顯著提高受損傷大鼠的睪丸指數(shù)，作用效果優(yōu)于單一干預組，且對腎臟和睪丸抗氧化能力的提升效果優(yōu)于單獨的牡蠣肽，對血清雄激素和促性腺激素水平的提升效果優(yōu)于單獨的紫蘇籽肽。綜上所述，牡蠣肽、紫蘇籽肽及復配均具有較好的改善雄性大鼠性功能的作用。根據(jù)本課題研究結(jié)果，可為開發(fā)改善男性性功能障礙的功能性食品奠定理論基礎(chǔ)。