張延鎮(zhèn)，彭舒悅，王 琪，郭前婉，趙 萌*，方亞鵬

（1 湖北工業(yè)大學 湖北省食品膠體國際科技合作基地 武漢 430068 2 上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院 上海 200240）

復合凝聚，又稱結合型相分離，是基于兩種帶相反電荷的聚電解質(zhì)在同一溶劑中，因靜電吸引發(fā)生去溶劑化，而形成的兩相體系，即富含聚電解質(zhì)的凝聚相和與之對應的貧瘠相，兩相在平衡狀態(tài)下均含有兩種聚電解質(zhì)，只是凝聚相濃度高于貧瘠相[1]。參與凝聚過程的物質(zhì)可以是膠體、表面活性劑或聚合物[2-4]。其中，蛋白-多糖體系是食品中典型的復合凝聚體系，廣泛存在于自然界和食品中[5]，目前已應用于食品質(zhì)構的設計與控制[6-7]、功能因子遞送[1，8]、蛋白或多糖純化[9-10]、可食性膜制備[11]等方面。

與傳統(tǒng)的蛋白/多糖復合凝聚體系不同，兩種荷電蛋白間的復合凝聚可顯示獨特的凝膠、乳化、配體結合等功能特性[12]，使其在生物活性分子荷載、食品精細結構設計等領域具有獨特的優(yōu)勢。本文綜述了異蛋白復合凝聚的特點、典型體系、影響因素及其在食品中的應用，并展望異蛋白復合凝聚的發(fā)展方向和食品中的應用。

1 異蛋白復合凝聚概述

1.1 異蛋白復合凝聚的定義及特點

異蛋白復合凝聚發(fā)生于兩種帶相反電荷的蛋白間。調(diào)節(jié)體系pH 值至兩種蛋白等電點之間，使兩種蛋白分別帶正電和負電，即可誘導異蛋白間發(fā)生復合凝聚。此外，蛋白表面電荷分布具有非均一性，帶相同電荷的異蛋白間有時也可發(fā)生復合凝聚。根據(jù)蛋白等電點（pI），將蛋白劃分為酸性蛋白、堿性蛋白兩類，其中pI 大于7 的蛋白質(zhì)為堿性蛋白，反之為酸性蛋白[13]。一般來說，異蛋白復合凝聚研究大都選擇一種酸性蛋白和一種堿性蛋白，這是為了在較大的pH 值范圍發(fā)生穩(wěn)定的復合凝聚，有利于研究復合凝聚發(fā)生機制和復合物特性，同時可展開相關應用研究。

通過調(diào)控pH 值、離子濃度、蛋白濃度、混合比例等條件，可使異蛋白發(fā)生復合凝聚，形成凝聚體或凝聚微球。與蛋白/多糖體系相比，異蛋白復合凝聚體系有以下特點：1） 只有在較窄的pH 值、離子濃度、蛋白濃度、混合比例等條件下才能觀察到復合凝聚物；2）對pH 值、離子濃度變化極其敏感，驅(qū)動力除靜電相互作用外，還有偶極吸引和疏水相互作用[14]；3）異蛋白復合凝聚自組裝遵循電荷和尺寸補償原理[15]。目前，由于蛋白結構和種類的復雜性，異蛋白復合凝聚還沒有普適的作用模型和作用力分析。需要說明的是：本文僅對等電點相差較大的酸性、堿性蛋白進行歸納總結，其等電點相距較近的蛋白間的復合凝聚不在本文討論范圍。

1.2 典型異蛋白復合凝聚體系

異蛋白復合凝聚研究一般涉及兩種蛋白：酸性蛋白和堿性蛋白。食品中常見的酸性蛋白主要有：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等。而堿性蛋白種類相對較少，主要有乳鐵蛋白（LF）、溶菌酶（LYS）和A 型明膠（GEA）。本文歸納總結了以乳鐵蛋白、溶菌酶和A 型明膠3 種堿性蛋白為基礎的異蛋白復合凝聚體系。

1.2.1 乳鐵蛋白 乳鐵蛋白是一種啞鈴狀鐵結合的糖蛋白，由41%的α-螺旋和24%的β-折疊組成，由17 個二硫鍵穩(wěn)定其三級結構，其分子質(zhì)量約為83 ku，pI 值為8.68.9；脫鐵后LF 柔韌性變好，更易于熱變形和酶促降解[16]。如表1所示，LF可與β-乳球蛋白（BLG）、酪蛋白（CN）等形成異蛋白復合凝聚物。此外，牛奶中的LF 和骨橋蛋白間存在相互作用，可協(xié)同提高機體免疫[17-18]。

1.2.2 溶菌酶 溶菌酶是一種球狀蛋白，可水解細菌細胞壁多糖，具有抑菌功效。結構中包含129個氨基酸，由39%的α-螺旋和11%的β-折疊組成，分子質(zhì)量為14.3 ku，pI 值為10.7[19]。如表1所示，LYS 和α-乳白蛋白（α-LA）之間的復合凝聚是文獻報道最多的體系?，F(xiàn)有研究探討了LYS-α-LA 復合凝聚對pH 值、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度、溫度和蛋白質(zhì)柔韌性的依賴性及其凝聚機制[14，36-43]。此外，也報道了LYS 與BLG、牛血清蛋白（BSA）、卵白蛋白（OVA）等蛋白間的復合凝聚[15，33，35-36，44-59]。

表1 典型異蛋白復合凝聚體系Table 1 Typical coacervated heteroprotein systems

1.2.3 A 型明膠 明膠是膠原蛋白水解物，可分為A 型明膠（GEA）和B 型明膠（GEB）兩類，其分子質(zhì)量自15～250 ku（千道爾頓）不等，隨水解程度的不同而變化[20]。GEA通過酸水解膠原蛋白處理得到，pI 值為8～9，也是一種典型的堿性蛋白。目前，關于GEA參與的復合凝聚體系相對較少。Zhao 等[21]利用GEA-Cas 復合凝聚微球成功包埋益生菌，有效提升了益生菌在貯藏、消化及加熱過程中的存活率。Tiwari 等[22]將GEA-GEB復合凝聚體應用于沙丁胺醇（Salbutamol）的包封。

2 影響異蛋白復合凝聚的因素

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，兩種物質(zhì)帶相反電荷時即發(fā)生靜電相互作用。pH 值、離子濃度、溫度、混合比及蛋白濃度等因素影響其復合凝聚過程。

2.1 pH 值

異蛋白復合凝聚主要驅(qū)動力來源于靜電相互作用，通過調(diào)節(jié)pH 值可對蛋白側(cè)鏈基團的解離度進行調(diào)控，從而改變蛋白所帶荷電性與電荷量。pH 值對異蛋白復合凝聚過程至關重要。目前，有文獻報道了pH 值對LF-BLG、LYS-BSA、LYSOVT、GEA-Cas 等異蛋白復合凝聚體系的影響。

對于LF-BLG 體系，BLG 在其等電點附近會自聚集，從而干擾或掩蓋LF-BLG 復合凝聚。Yan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，LF-BLG 復合物在pH 5.7～6.2 范圍形成，最佳pH 值為6.0；在pH 值低于6.0 時，BLG 自聚集與LF-BLG 復合物競爭，形成較大的無定型聚集體，導致溶液中游離的BLG 降低，LFBLG 凝聚體消失。Anema 等[24]利用濁度滴定法證實LF-BLG 可在5.3＜pH＜7.3 時發(fā)生復合凝聚。Tavares 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，LF-BLG 在5.50＜pH＜6.00時形成復合凝聚微球，而在5.00＜pH＜5.25 時形成不規(guī)則復合凝聚體。上述研究中，LF-BLG 的復合凝聚pH 值范圍有一定差異，這是由于選取的蛋白濃度和BLG 樣品來源不同所致。

LYS-BSA 復合凝聚體系深受pH 值影響，以BSA∶LYS=1∶2 為例，其復合凝聚過程可分為4 個區(qū)域：當2.0＜pH＜4.0 時，體系呈凈正電荷，蛋白質(zhì)分子間相互排斥，濁度不變；當4.0＜pH＜7.5 時，可溶性復合物形成且以低密度存在于體系中，濁度呈現(xiàn)緩慢增加趨勢；當7.5＜pH＜11.0 時，濁度顯著增加，標志著不溶性復合物的形成；當11.0＜pH＜12.0 時，在靜電排斥力的作用下復合物解離，濁度降低[58]。類似地，LYS-OVT 復合凝聚過程也被劃分為4 個區(qū)域[57]。Zhao 等[21]固 定GEA∶Cas=1∶1，在pH 5.0 時體系形成復合凝聚物沉淀；pH 5.5 時形成液態(tài)復合凝聚微球；pH=6.0 和pH=6.5 時形成可溶性復合物。以上研究表明，pH 值除影響蛋白電荷量外，還決定復合凝聚物的穩(wěn)定范圍及最佳形成條件。

2.2 離子濃度

離子濃度（I）對高分子間的作用力具有較強的調(diào)節(jié)作用，該作用力主要由短程吸引、遠程排斥協(xié)同支配。高離子濃度條件下，短程吸引及遠程排斥均被減弱或屏蔽；低離子濃度條件下，遠程排斥被屏蔽而短程吸引不受影響，有利于復合物的形成[60]。

不同的異蛋白復合凝聚物對離子濃度的響應不同。LF-BLG 體系的臨界解離離子濃度為20～100 mmol/L[23-24]。LYS-BSA、LYS-OVA 復合凝聚物對離子濃度更為敏感，臨界解離離子濃度為10～20 mmol/L[15，58]；LYS-CN 復合凝聚物能夠抵抗相對較高的離子強度（80～100 mmol/L），其中，LYS-β-CN 復合物在離子濃度高于500 mmol/L 時被明顯抑制[33，35，49]。

提高蛋白濃度可適度改善復合凝聚體系對離子濃度的敏感性。LF-β-CN 體系在總蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.1%時復合物在I＞25 mmol/L 時解離，溶液變澄清[32]；當總蛋白質(zhì)量分數(shù)為1%時，LF-β-CN復合物在I=400 mmol/L 時依然存在[31]。另外，當總蛋白質(zhì)量濃度分別為1 g/L 和10 g/L 時，相同物質(zhì)的量的LYS-琥珀?；疞YS 復合凝聚物的臨界解離離子濃度分別為20 mmol/L 和800 mmol/L[56]。

離子類型對復合凝聚物的影響存在差異。Nigen 等[41]對LYS-α-LA 體系研究時發(fā)現(xiàn)：1）I＜100 mmol/L（Na+）時，LYS-α-LA 可自組裝形成微球；2）復合凝聚微球具有較好穩(wěn)定性，I＞250 mmol/L（Na+）時，仍能保持結構的完整性；3）與Mg2+、Na+相比，Ca2+更易破壞所形成的微球結構。

2.3 溫度

異蛋白復合物粒徑大小及多分散性系數(shù)（PDI）分布表現(xiàn)出溫度、時間依賴性。Monteiro 等[37]發(fā)現(xiàn)，LYS-α-LA 復合物粒徑及PDI 隨溫度升高（25～75 ℃）而降低，在溫度高于50 ℃時，復合物粒徑及PDI 隨加熱時間的延長而增大。Pan 等[50]將LYS-β-CN 復合物溶液進行高溫熱處理（80 ℃、30 min）后得到單分散的納米顆粒，其粒徑及PDI 較未熱處理時的復合物均有所降低。此外，溫度變化可導致復合物呈現(xiàn)不同的超分子結構。LYS-α-LA在pH 7.5，5 ℃條件下形成不規(guī)則聚集體，而在45℃條件下形成微球型復合物[43]，且不規(guī)則聚集體在溫度提高后能夠重組為凝聚微球[38，40]。

2.4 混合比例

混合比例決定異蛋白復合凝聚的程度，這一過程與pH 值緊密相關，不同的混合比例所對應的復合凝聚最適pH 值不同，最終可導致復合物的組成存在差異[1]。Anema 等[24]在探究LF-BLG 復合凝聚過程時發(fā)現(xiàn)，隨著體系中LF/（LF+BLG）比例增加，最適復合凝聚所需pH 值升高，其在最適復合凝聚條件下形成的復合凝聚物的組成固定，即LF-BLG 物質(zhì)的量比約為1∶3。Yan 等[23]通過固定體系pH 值為6.0，發(fā)現(xiàn)凝聚物中LF-BLG 物質(zhì)的量比隨體系中LF-BLG 質(zhì)量比的降低而降低，在質(zhì)量比為1∶1 時，體系獲得最大凝聚效率，所對應的LF-BLG 物質(zhì)的量比約為1∶4。類似的，Tavares 等[25]在pH 5.5 條件下發(fā)現(xiàn)，隨初始溶液中LF-BLG 物質(zhì)的量比的降低，凝聚物中LF-BLG 物質(zhì)的量比在1∶4 至1∶8 間變化。此外，Nigen 等[43]研究了LYS/α-LA 物質(zhì)的量比例對凝聚物中α-LA 回收率的影響：當LYS/α-LA 物質(zhì)的量比＜1.0時，凝聚體中α-LA 回收率與物質(zhì)的量比呈線性增加趨勢；當物質(zhì)的量比為1.0 時，凝聚體中最大α-LA 回收率達70%；進一步增加比例，α-LA 的回收率幾乎不變。

2.5 蛋白濃度

蛋白濃度也是復合凝聚物形成的影響因素。Yan 等[23]在pH 6.0 條件下對不同濃度的LF-BLG體系進行離心，結果發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為40 g/L 時體系獲得最大凝聚效率，高于此質(zhì)量濃度，BLG 自聚集與LF-BLG 復合物競爭導致復合凝聚效率降低；總蛋白質(zhì)量濃度低于10 g/L 時，無法觀察到復合凝聚物，這一結果與Tavares 等[25]的研究基本一致。

3 異蛋白復合凝聚在食品中的應用

3.1 小分子活性成分的荷載

維生素是機體維持正常生理功能的一類微量有機物質(zhì)，在人體的生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，而在生產(chǎn)加工過程中，維生素因極端pH 值、光照、加熱等條件而降解，導致生物利用率低[61]。基于異蛋白復合凝聚，Chapeau 等[28]制備了含VB9的LF-BLG 復合物，其荷載量高達6～16 mg/g（VB9/蛋白）。在穩(wěn)定性試驗中[29]，未經(jīng)凝聚體包封的VB9，在模擬紫外照射48 h 后含量降低了90%，而在復合物包封下的VB9含量僅降低了50%。通過H2O2加速氧化降解18 h，包封與未包封的VB9分別降低20%，75%；另外，含VB9的LF-BLG 復合物可應用于規(guī)模化生產(chǎn)[30]。類似地，Diarrassouba 等[54-55]利用LYS-BLG 復合凝聚微球成功包封VD3，且通過大鼠喂食試驗證實體系包封下的VD3生物利用度提高。

巖藻黃質(zhì)（fucoxanthin，F(xiàn)X）是存在于可食性棕褐色海草中的類胡蘿卜素，結構中含有烯鍵、環(huán)氧基團和多烯鏈共軛羰基，具有抗炎作用、抗氧化等功效[62-63]，與維生素類似，對光照、加熱等條件敏感。研究表明，F(xiàn)X 可通過非共價相互作用與WPI自發(fā)形成納米復合物，隨后與LYS 凝聚，荷載率達（82.36±3.85）%；對WPI-FX、WPI-FX-LYS 兩組樣品分別進行加熱、儲藏穩(wěn)定性試驗，結果表明經(jīng)WPI-LYS 包封的FX 穩(wěn)定性最佳，其在兩項試驗中分別保留了74.4%，63.4%；而WPI-FX 僅保留20.9%，27.8%[59]。

沙丁胺醇（Salbutamol）是一種選擇性的腎上腺素受體激動劑，可緩解哮喘、慢性氣道疾病引起的支氣管痙攣[64]。Tiwari 等[22]通過pH 誘導GEAGEB相互作用形成復合凝聚體，用于封裝沙丁胺醇，結果表明：在GEA-GEB濁度開始上升之前，將沙丁胺醇添加至體系中，具有更高的包封率及釋放率；在模擬胃液消化試驗中，發(fā)現(xiàn)藥物的體外釋放動力學具有雙相性，在開始的10 h 內(nèi)，沙丁胺醇釋放速度迅速上升至最大值 （10 h 內(nèi)釋放約10%），隨后40 h 以最大釋放速度在體外釋放。以上研究證實異蛋白復合凝聚體系在小分子活性成分荷載方面具有良好的應用前景。

3.2 益生菌的包埋保護

益生菌在維持腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)血糖平衡，改善腸易激綜合癥等方面效果顯著[65]，被廣泛應用于食品、藥品等行業(yè)。益生菌對環(huán)境敏感、容易死亡，微囊化是改善這一問題的有效手段[66]。Zhao等[21，67]采用異蛋白復合凝聚和蛋白/多糖復合凝聚兩種形式，構建含益生菌的GEA-Cas 和GEA-GA（阿拉伯膠）復合凝聚體系，結果表明：GEA-Cas 微囊中的益生菌在模擬胃腸液、常溫貯藏和熱處理過程中存活率顯著提升，與構建的GEA-GA 微囊相比，益生菌在模擬胃液、腸液、熱處理條件下存活率分別提高了2.06，0.47，1.58 lg（CFU/g）。與蛋白/多糖復合凝聚體系相比，異蛋白復合凝聚體系可降低微囊的吸濕性和潤濕性，減緩益生菌微囊在胃腸液中的崩解速率。綜上，作為一種新的益生菌包埋體系，異蛋白復合凝聚體系保護效果顯著。

3.3 蛋白的分離純化

復合凝聚過程中蛋白質(zhì)間相互作用具有選擇性，可通過調(diào)節(jié)理化參數(shù)來分離目的蛋白。BLG 存在兩個亞型：BLGA和BLGB，兩者間僅存在兩個氨基酸的差異，其等電點分別為5.1，5.2。Tavares 等[25]對LF-BLGA、LF-BLGB、LF-（BLGA+BLGB相同物質(zhì)的量）3 種復合凝聚體進行定量分析，結果發(fā)現(xiàn)：在pH 5.5 條件下凝聚體中LF 的回收率范圍分別為：75%～82%，2%～6%，45%～55%，可通過LF 的選擇凝聚作用分離凝聚相中的BLGA和貧瘠相中的BLGB。此外，Pathak 等[68]研究表明，當GEBBSA-BLG 以質(zhì)量比1∶1∶0.75 的比例存在于溶液中，調(diào)控體系pH 值至其共同的等電點（pH 5.0±0.02），因蛋白表面電荷的不均一性，故GEB可選擇性地與BSA 分子發(fā)生復合凝聚。這使得GEBBSA 復合凝聚體富集于凝聚相中，而貧瘠相中主要含有BLG 分子，最后用體積分數(shù)35%的乙醇分離凝聚體中BSA 分子，所得回收率為40%。這些研究對異蛋白復合凝聚體系應用于蛋白分離純化提供了新的思路。

3.4 乳液穩(wěn)定

基于復合凝聚，異蛋白間可自組裝成納米顆粒，其可應用于皮克林乳液的穩(wěn)定。Wei 等[57]在OVT/LYS=8、pH 9.3 條件下制備單分散、潤濕性適中的納米顆粒，其在含量2%條件下可穩(wěn)定高內(nèi)相乳液（油相分數(shù)為0.75），該乳液在室溫儲藏30 d后，乳液無明顯分層現(xiàn)象。在模擬胃腸液試驗中，皮克林乳液具有較大的界面面積，與空白樣品相比，該乳液的脂解程度由32.1%提至71.5%。此外，懸浮于乳液內(nèi)相中的姜黃素生物利用率由16.1%提至38.3%。該研究在乳液穩(wěn)定方面提供了一種新的思路，也提供了一種疏水性活性成分輸送壁材。

4 結語

蛋白作為關鍵的食品組分，常常多種蛋白混合共存于蛋制品、乳制品、肉制品、蛋白飲料等各類食品中，發(fā)揮穩(wěn)定、增稠、乳化、發(fā)泡、凝膠化、調(diào)節(jié)冰晶生長等功能，同時賦予產(chǎn)品特定的質(zhì)構、風味、營養(yǎng)特征。深入了解異蛋白復合凝聚，對食品質(zhì)構調(diào)控、食品功能因子荷載、食品配料復合等領域具有重要意義。目前，異蛋白復合凝聚研究處于起步階段，其復合凝聚熱力學、動力學、結合模型等機制需進一步研究。另外，異蛋白復合凝聚在食品中的應用需進一步挖掘，如改善起泡性、膜特性、凝膠特性等食品功能，荷載遞送更多功能因子或風味成分。