呂智超，李 旭，武 斌，徐日福，張?jiān)朴?

1.吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130033；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118

本實(shí)驗(yàn)以150日齡的海蘭褐蛋雞為試驗(yàn)材料，采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)海蘭褐蛋雞不同等級(jí)卵泡發(fā)育時(shí)期Lats1基因的mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出Lats1基因存在于海蘭褐蛋雞卵泡發(fā)育各個(gè)時(shí)期，并呈現(xiàn)一定表達(dá)規(guī)律，說(shuō)明Lats1基因參與家禽開(kāi)產(chǎn)時(shí)卵泡發(fā)育的調(diào)控，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究Hippo信號(hào)通路在雞卵泡不同發(fā)育時(shí)期控制細(xì)胞增殖時(shí)空表達(dá)模式打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇150日齡海藍(lán)褐蛋雞40只，在相同的環(huán)境下飼養(yǎng)。在4 ℃低溫條件下，快速分離直徑為1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm和F6-F1的卵泡組織，放于液氮中速凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

微量RNA提取試劑盒(W6221)購(gòu)自上海華舜公司，TU-1901紫外分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中的雞Lats1基因mRNA序列（XM_419666.3）和GAPDH基因mRNA序列(K01458)的mRNA為模板，設(shè)計(jì)半定量實(shí)驗(yàn)的引物如表1。所有引物運(yùn)用Premier 5.0和Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

表1 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 RNA抽提

取新鮮組織100 mg加1 mL TotalRNAExtractor充分研磨，將所得到的RNA溶液一部分用于后續(xù)試驗(yàn)，一部分置于-70 ℃保存。

2.2 反轉(zhuǎn)錄成cDNA

在0.2 mLPCR管中加4 μL Rnase-free ddH20,1 μL Random Primer p(dN)6（0.2 μg/ μL），70 ℃溫浴5 min，冰浴10 sec。利用離心機(jī)離心，然后加入下列試劑：1.0 μL Rnase inhibitor（20 U/ μL），2.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L），4.0 μL 5×Reaction Buffer，2.0 μL AMV Reverse Transcriptase（10 U/μL）。37 ℃溫浴5 min，42 ℃溫浴60 min，70 ℃溫浴10 min，-20 ℃保存。

2.3 半定量RT-PCR反應(yīng)步驟

半定量RT-PCR反應(yīng)體系（25 μL）：RNasefree Water11 μL，2×Tag MasterMix12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA0.5 μL。半定量PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s（35個(gè)循環(huán)），終延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

2.4 半定量RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

Lats1基因與GAPDH基因用2%的瓊脂糖凝膠按1:1的比例，130 V恒壓電泳30 min。然后利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳后的凝膠拍照，凝膠圖片會(huì)顯示Lats1基因與GAPDH基因的灰度值，通過(guò)ImageJ2x、BandScan5.0軟件進(jìn)行灰度分析，測(cè)三次，求平均值。Lats1基因與GAPDH基因灰度值的比值即Lats1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。再通過(guò)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和單因素方差（SPSS 18.0軟件）對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

3 半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 電泳檢測(cè)結(jié)果

用游標(biāo)卡尺將海藍(lán)褐蛋雞的卵巢按直徑大小分為間質(zhì)、等級(jí)前卵泡（1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm）和F1～F6等級(jí)卵泡。提取150 d海藍(lán)褐卵巢的12個(gè)組織的總RNA，根據(jù)目的基因片段的大小配置1.5%濃度的瓊脂糖凝膠，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與微量溴酚藍(lán)混合，1×TAE電泳緩沖液下，在含有溴化乙啶的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并通過(guò)凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照，經(jīng)觀(guān)察，能夠清楚的看見(jiàn)28 S、18 S和5 S三條帶，其中28 S的亮度是18 S的兩倍，而5 S是最不亮的。表明提取的總RNA降解少，完整性高。通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定，OD260/OD280值（吸光度值）在1.8～2.2之間，表明此RNA的純度較高。

3.2 Lats1在海藍(lán)褐組織中的表達(dá)情況

定性PCR檢測(cè)了基因Lats1在海藍(lán)褐蛋雞肺、卵巢、腎、肝、脾、心、腦和胸腺組織中的表達(dá)情況?；蚓斜磉_(dá)且表達(dá)特異，無(wú)引物二聚體和拖尾現(xiàn)象，基因引物特異性強(qiáng)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3.3 Lats1基因mRNA在海蘭褐蛋雞不同等級(jí)卵泡中的半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

以GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因，Lats1基因?yàn)槟康幕?。利用半定量RT-PCR檢測(cè)基因在150日齡海蘭褐蛋雞卵巢間質(zhì)、1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm、F6、F5、F4、F3、F2和F1共12個(gè)卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量，如表2所示。

從表2看出，在150日齡的海藍(lán)褐蛋雞各等級(jí)卵泡內(nèi)均檢測(cè)有Lats1基因表達(dá)，但在不同直徑大小卵泡中的表達(dá)豐度有一定的差異。5～5.9 mm卵泡組織中的表達(dá)豐度最高，為0.1970；在6～6.9 mm、F5、4～4.9 mm、F3、7～8 mm和間質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量次之；在F6的表達(dá)水平最低，為0.1045。5～5.9 mm與1～3.9 mm、F4、F6、F1、F2之間差異顯著（p＜0.05），6～6.9 mm與1～3.9 mm、F6、F4之間差異顯著（p＜0.05），其余的卵泡之間相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（p＞0.05）。Lats1基因mRNA在海藍(lán)褐蛋雞各個(gè)等級(jí)卵泡中，表達(dá)量各不相同，在前等級(jí)卵泡中的表達(dá)量整體高于等級(jí)卵泡的表達(dá)量，前等級(jí)卵泡中表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在5～6 mm處表達(dá)量最高，在等級(jí)卵泡中F5表達(dá)量最高，F(xiàn)3次之，但整體呈現(xiàn)基本平穩(wěn)的狀態(tài)。

表 2 Lats1基因相對(duì)表達(dá)量

4 討論

RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是一種常規(guī)的、常見(jiàn)的檢測(cè)基因的方法，它具有較高的靈敏度和特異性。定量PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和樣本處理的要求都比較高，所以結(jié)果相對(duì)半定量而言會(huì)更加精準(zhǔn)[1]。但是熒光定量PCR相對(duì)成本高，對(duì)于一些條件設(shè)施不完善的工作平臺(tái)，選擇一種方法，能夠替代熒光定量PCR，且結(jié)果一致，是有實(shí)際利益的。

研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號(hào)通路是通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，將細(xì)胞信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡進(jìn)行一個(gè)整體調(diào)控，而且，Hippo信號(hào)通路還參與器官大小和組織再生的調(diào)控，并在胚胎發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)選取的基因Lats1是Hippo信號(hào)通路主要基因在家禽的同源基因，為了驗(yàn)證它們是否是家禽體內(nèi)Hippo信號(hào)通路的作用基因，首先我們采用定性PCR方法，驗(yàn)證選取的基因是否存在家禽組織內(nèi)，再采用半定量RT-PCR方法對(duì)基因定量。分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Lats1在蛋雞卵巢組織及各個(gè)等級(jí)卵泡中均有表達(dá)，說(shuō)明Lats1基因參與了卵泡從開(kāi)產(chǎn)到產(chǎn)蛋高峰的整個(gè)過(guò)程，前等級(jí)卵泡的整體表達(dá)水平略高于等級(jí)卵泡的表達(dá)水平，在前等級(jí)卵泡中表達(dá)量先升高后降低，在等級(jí)卵泡中，表達(dá)量基本穩(wěn)定，說(shuō)明Lats1基因參與家禽開(kāi)產(chǎn)時(shí)卵泡發(fā)育的調(diào)控，也有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

5 小結(jié)

本文根據(jù)目的基因Lats1和內(nèi)參基因在Genebank上已知序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)基因進(jìn)行體系優(yōu)化及程序優(yōu)化。主要結(jié)果如下：通過(guò)定性PCR實(shí)驗(yàn)得出：Lats1在海藍(lán)褐蛋雞肺、卵巢、腎、肝、脾、心、腦和胸腺組織中均有表達(dá)且表達(dá)特異，無(wú)引物二聚體和拖尾現(xiàn)象。基因的引物特異性強(qiáng)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。說(shuō)明Lats1基因存在于家禽中大部分的組織器官。

通過(guò)半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)得出：Lats1在海藍(lán)褐蛋雞的卵巢間質(zhì)及各個(gè)等級(jí)卵泡中均有表達(dá)，表達(dá)量存在一定規(guī)律，前等級(jí)卵泡的表達(dá)量均大于等級(jí)卵泡中的表達(dá)量。說(shuō)明Lats1基因參與家禽開(kāi)產(chǎn)時(shí)卵泡發(fā)育的調(diào)控，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。