周金旭，王盛南，胡子文，余云登，仇雪梅，王秀利

（大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023）

紅鰭東方鲀Takifugu rubripes 作為一種海洋洄游性魚類，雖然其內(nèi)臟器官中含有地球上最致命的河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）[1]，但其魚肉卻作為一種昂貴的美食被許多地方的人們所喜愛。紅鰭東方鲀的許多器官中都含有TTX，其在肝臟和卵巢中含量最高，其次是腸道，但在皮膚、睪丸、肌肉中卻幾乎不存在TTX。由于紅鰭東方鲀的養(yǎng)殖和食用逐漸開放，紅鰭東方鲀也慢慢成為中國(guó)的餐桌美食和出口創(chuàng)匯的主要海產(chǎn)品?；诩t鰭東方鲀?nèi)斯し庇夹g(shù)取得了成功[2]，且在已有研究中發(fā)現(xiàn)了養(yǎng)殖紅鰭東方鲀的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)要優(yōu)于野生的紅鰭東方鲀[3]，所以提高養(yǎng)殖紅鰭東方鲀對(duì)餌料的利用效率也成為新的研究目標(biāo)，而對(duì)腸和胃的研究則是餌料研究的基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是一種特殊測(cè)序技術(shù)，既能揭示給定時(shí)刻生物樣品中RNA 的表達(dá)量，也能揭示基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制[4]。由于轉(zhuǎn)錄組能夠從整體水平上研究基因的功能和基因的結(jié)構(gòu)，并能揭示某些特定的生物學(xué)過程和分子機(jī)理，所以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于植物、動(dòng)物、微生物的研究中[5-6]。由于紅鰭東方鲀的基因組非常小，使其成為繼人類基因組公開發(fā)布后的第一個(gè)脊椎動(dòng)物基因組，雖然其基因組僅為人類基因組大小的八分之一，但它含有與人類基因組相似的基因庫[7]，所以對(duì)紅鰭東方鲀的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究具體重要意義。

目前，已有一些對(duì)紅鰭東方鲀生長(zhǎng)、攝食、消化生理等不同方面的研究[8-10]，但對(duì)紅鰭東方鲀消化組織轉(zhuǎn)錄組方面的研究較少，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)一齡的紅鰭東方鲀的腸和胃進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)差異基因分析，簡(jiǎn)單探究紅鰭東方鲀腸和胃之間的功能差異，同時(shí)也為其他生物腸道基因的研究提供參考，此外對(duì)紅鰭東方鲀腸和胃進(jìn)行研究也可為今后養(yǎng)殖紅鰭東方鲀餌料選擇和提高其餌料系數(shù)提供思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅鰭東方鲀的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在大連天正公司的大黑石養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)先將1 齡90 尾紅鰭東方鲀分為3組，每組30 尾，在溶氧7～8 mg·L-1，pH 7～8，溫度17～18 ℃的條件下飼養(yǎng)7 d，每天上午8 點(diǎn)和下午2 點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)投喂，在采樣前一天停止投喂。在正式實(shí)驗(yàn)中，從每組紅鰭東方鲀中隨機(jī)選取10 尾，將每尾紅鰭東方鲀的腸和胃全部取出，使用PBS 緩沖液將其中內(nèi)容物清洗干凈，取1 cm 的腸和胃，按分組置于6 個(gè)不同的10 mL 無酶離心管，每組織間的3 個(gè)混合樣本作為3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。胃混合樣本分別標(biāo)號(hào)SA1、SA2和SA3，腸的混合樣本分別標(biāo)號(hào)IA1、IA2 和IA3。每個(gè)離心管中均加入超過樣品5 倍體積的RNAlater 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 的提取、cDNA 文庫的構(gòu)建與測(cè)序

將每組紅鰭東方鲀的腸和胃組織分別置于液氮中進(jìn)行研磨，研磨后的樣品使用Trizol 試劑（寶生物公司）進(jìn)行總RNA 提取，利用1%瓊脂凝膠電泳分析RNA 完整性和RNA 是否存在DNA 的污染，再使用HAgilent 2100 儀器對(duì)樣品的RNA 純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè)。在紅鰭東方鲀的樣本質(zhì)檢合格后委托諾禾致源公司進(jìn)行測(cè)序。按照NEB 普通建庫方式進(jìn)行cDNA 文庫構(gòu)建，建庫試劑盒為Illumina 的NEBNextUltraTM RNA Library Prep Kit[11]。先通過磁珠富集帶有polyA 尾的mRNA，其在逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成單鏈cDNA，再合成雙鏈，雙鏈cDNA 經(jīng)過末端修復(fù)和加polyA 尾，用AMPure XP beads 篩選250～300 bp 左右的cDNA，最終獲得文庫。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用高通量測(cè)序儀將測(cè)序片段轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)（reads）。為了使序列數(shù)據(jù)分析具有較高的質(zhì)量及更高的可靠性，實(shí)驗(yàn)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾標(biāo)準(zhǔn)：1 去除帶接頭（adapter）的reads；2 去除含N（N 表示無法確定堿基信息）的reads；3 去除低質(zhì)量reads（Qphred＜=20 的堿基數(shù)占整個(gè)read 長(zhǎng)度的50%以上的reads）。使后續(xù)分析均是基于過濾數(shù)據(jù)的高質(zhì)量分析。此外還對(duì)過濾數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的Q20、Q30 和GC 含量計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用HISAT2v2.0.5 注釋和構(gòu)建參考基因組的索引，將過濾數(shù)據(jù)與紅鰭東方鲀參照基因組進(jìn)行比對(duì)[12]。再利用DESeq2 對(duì)原始的read count 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和檢驗(yàn)校正，得到一個(gè)FDR 值，以padj＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)差異基因進(jìn)行篩選[13-14]。將篩選出的差異基因通過clusterProfiler（3.4.4）軟件與GO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，再利用clusterProfiler（3.4.4）軟件分析KEGG 通路中差異表達(dá)基因的富集情況。

1.5 RT-qPCR 驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇以β-actin 為內(nèi)參基因[15]，篩選具有代表性的6 個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)生物重復(fù)，并進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。采用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表（表1）。使用ABI 公司的StepOne plus 定量?jī)x進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL,2×TransStart PCR SuperMix 10 μL，DyeⅠ0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，RNase free H2O 7.8 μL。最后相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 RT-qPCR 引物信息Tab.1 RT-qPCR primer information

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

本研究對(duì)紅鰭東方鲀腸和胃進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序片段經(jīng)CASAVA 堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)（reads），后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并進(jìn)行相應(yīng)的Q20、Q30 和GC 含量計(jì)算（表2）。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，每個(gè)樣本序列數(shù)據(jù)在4.89×107～6.37×107bp 之間，過濾后的序列數(shù)據(jù)（clean reads）在4.82×107～6.28×107bp 之間，所測(cè)數(shù)據(jù)的堿基長(zhǎng)度在7.23～9.42 G 之間，Q20 在97.55%～97.21%之間，Q30 在92.55%～93.24%之間，GC 含量在49.86%～51.06%之間。以上數(shù)據(jù)表明測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，且具有優(yōu)質(zhì)的建庫質(zhì)量，數(shù)據(jù)可用于之后的分析。

表2 紅鰭東方鲀腸和胃測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量Tab.2 Quality of T.rubripes intestine and stomach sequencing data

2.2 轉(zhuǎn)錄組與參考基因組的比對(duì)分析

將質(zhì)控后的過濾數(shù)據(jù)與紅鰭東方鲀的參考基因組（fTakRub1.2（GCF 901000725.2））進(jìn)行比對(duì)（表3）。結(jié)果表明6 個(gè)樣本的過濾數(shù)據(jù)與參考基因組的mapping 率在94.24%～86.17%，單一位置的mapping 率為90.1%～78.82%，多位置mapping 率都小于7.35%。實(shí)驗(yàn)中各樣本mapping 率的比對(duì)效率都相對(duì)較高，這說明參考基因組的組裝較好。樣本與參考基因組的親緣關(guān)系近，樣本的外源污染較少、樣本整體測(cè)序質(zhì)量較好。

表3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與基因組比對(duì)Tab.3 Comparison of transcriptome data with genome

2.3 差異基因分析

實(shí)驗(yàn)將1 齡紅鰭東方鲀腸和胃（SA13vsIA13）的表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì),再使用DESeq2 軟件，以|log2（FoldChange）|＞0 或padj＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，如果差異基因在胃表達(dá)量高于腸表達(dá)量（即log2（FoldChange）＞0）則為上調(diào)，反之則為下調(diào)（圖1）。本研究在比較分析中共獲得3 564 個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括個(gè)2 167 上調(diào)表達(dá)的差異基因，1 397 個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異基因。由此分析可以看出腸和胃（SA13vsIA13）的差異基因多數(shù)呈上調(diào)表達(dá)，少數(shù)呈下調(diào)表達(dá)。此外經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了許多與有意義的差異基因，其中包括回腸型脂肪酸結(jié)合蛋白基因（fabp6）表達(dá)差異最大（log2FC=-14.14262182），fabp6 在胃中幾乎不表達(dá)，但在腸中卻大量表達(dá)，脂肪酸轉(zhuǎn)位酶基因（cd36）差異最顯著（FDR=1.60×10-42），cd36 在胃中表達(dá)較低，但在腸中卻大量表達(dá)。此外還有膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（soat2 或acat2）、載脂蛋白（apoA-IV2）也呈下調(diào)表達(dá)。反之則篩選到了緊密連接蛋白（cldn3a）和鈣黏著蛋白（cdh2）在腸和胃（SA13vsIA13）比較中呈上調(diào)表達(dá)。

圖1 紅鰭東方鲀腸和胃差異基因Fig.1 Differential genes of intestine and stomach of T.rubripes

2.4 GO 功能富集分析

實(shí)驗(yàn)將紅鰭東方鲀腸和胃（SA13vsIA13）比較中篩選到差異基因注釋到GO（gene ontology，基因本體論）上，通過注釋將這些差異基因分為3 類包括：（1）生物過程（biological processes BP）、（2）細(xì)胞組成（cell composition CC）、（3）分子功能（Molecule Function MF）（圖2）。GO 富集結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)將1652 差異基因注釋到915 個(gè)GO 術(shù)語上，其中發(fā)現(xiàn)18 個(gè)具顯著富集（padj＜0.05）的GO 術(shù)語，在生物過程有5 個(gè)GO 術(shù)語（term），細(xì)胞組成有1 個(gè)GO 術(shù)語，分子功能有12 個(gè)GO 術(shù)語。在顯著富集的GO 術(shù)語中：在細(xì)胞組成中胞膜外區(qū)（extracellular region）注釋到了最多的差異基因共77 個(gè)。此外在分子功能中酶調(diào)節(jié)活動(dòng)（enzyme regulator activity）注釋到45 個(gè)差異基因；細(xì)胞骨架結(jié)合（cytoskeletal protein binding）注釋到44 個(gè)差異基因；跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（active transmembrane transporter activity）注釋到37 個(gè)差異基因等。

圖2 紅鰭東方鲀腸和胃GO 富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of intestine and stomach of T.rubripes

2.5 KEGG 功能富集分析

實(shí)驗(yàn)將紅鰭東方鲀腸和胃（SA13vsIA13）比較中篩選到差異基因注釋到KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes），京都基因與基因組百科全書）上，以此系統(tǒng)分析這些差異基因的關(guān)聯(lián)性（圖3）。KEGG 富集結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)將989 個(gè)差異基因，富集到151 條通路上，其中有15 條通路顯著富集（padj＜0.05），這些顯著富集的通路中花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）為差異最顯著的通路且富集到21 個(gè)差異基因。按富集到差異基因數(shù)量由高到低進(jìn)行通路排序前三個(gè)通路是粘著連接（focal adhesion）共富集到61 個(gè)基因，其次是緊密連接（tight junction）富集到了56 個(gè)基因，最后是細(xì)胞粘附分子（cell adhesion molecules，CAMs）富集到了50 個(gè)基因。此外還富集到大量與代謝有關(guān)的通路存在顯著富集：甘油酯代謝（glycerolipid metabolism）、鞘脂代謝（sphingolipid metabolism）、膽固醇代謝（cholesterol metabolism）等通路。

圖3 紅鰭東方鲀腸和胃KEGG 富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of intestine and stomach of T.rubripes

2.6 RT-qPCR 驗(yàn)證結(jié)果

采用染料法（SYBR 法）對(duì)篩選到的6 個(gè)基因：回腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（fabp6）、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（cd36）、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（soat2）、載脂蛋白（apoA-IV2）、緊密連接蛋白（cldn3a）、鈣黏著蛋白（cdh2）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：雖然轉(zhuǎn)錄組與RT-qPCR 在表達(dá)量和差異倍數(shù)存在一些差異，但各基因所表達(dá)的趨勢(shì)是一致的，這進(jìn)一步的表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是較準(zhǔn)確可靠的。

圖4 紅鰭東方鲀6 個(gè)基因的RT-qPCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 RT-qPCR validation results of six genes of T.rubripes

3 討論

消化系統(tǒng)是生物食物消化和生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，對(duì)于魚類來說消化系統(tǒng)不僅具有消化吸收的功能，同時(shí)也具有免疫的功能，能防止有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)。研究消化系統(tǒng)的基因表達(dá)是了解魚類的營(yíng)養(yǎng)需求和提高餌料系數(shù)的基礎(chǔ)。腸和胃既是消化系統(tǒng)中重要的組成部分，也是魚體中主要食物的消化和吸收?qǐng)鏊?。關(guān)于紅鰭東方鲀有無胃的問題一直存在爭(zhēng)論，有研究有認(rèn)為紅鰭東方?jīng)]有胃,理由是其沒有胃腺的存在[16]。另外也有研究認(rèn)為紅鰭東方鲀有胃，理由是其存在明顯的分隔[17]。本研究的紅鰭東方鲀胃組織中沒有發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶原的表達(dá)，這與黑川等[18]的研究一致。由以上研究分析發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀具有胃的結(jié)構(gòu)，但缺少部分胃的功能。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法分析腸和胃中的差異基因，發(fā)現(xiàn)了許多與代謝和消化相關(guān)的基因如回腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（fabp6）、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（cd36）、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（soat2 或acat2）、載脂蛋白（apoA-IV2）、緊密連接蛋白（cldn3a）、鈣黏著蛋白（cdh2）。fabp6 是一種脂肪酸載體蛋白，與脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝密切相關(guān)。此外還有研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白與肌肉的生長(zhǎng)密切相關(guān)[19]。在已有研究中發(fā)現(xiàn)綠河鲀Tetraodon nigroviridis 的fabp6 在腸中高表達(dá)[20]；在小鼠的腸道中可以檢測(cè)到fabp6 的表達(dá)，在胃中檢測(cè)不到[21]，這與本研究結(jié)果相一致。fabp6 在腸中高表達(dá)可能是因?yàn)槟懼幸恍┏煞挚梢哉{(diào)控腸上皮細(xì)胞中fabp6 基因的表達(dá)，參與腸中膽汁鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)和類固醇激素的代謝[22]；在胃中表達(dá)量很低可能是因?yàn)榧t鰭東方鲀具有胃的結(jié)構(gòu)但是缺少胃的功能，缺少可以調(diào)控fabp6 基因表達(dá)的物質(zhì)。cd36 是一種在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的完整膜蛋白，其參與了脂肪酸代謝[23]和腸道中的脂肪加工[24]。soat2 通過參與小腸膽固醇的吸收和肝臟中脂蛋白的分泌來調(diào)節(jié)膽固醇的代謝[25]。apoA-IV2 可以結(jié)合和運(yùn)輸血脂到機(jī)體各組織進(jìn)行代謝和利用，對(duì)于維持體內(nèi)平衡起重要作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)以上的基因均在腸和胃（SA13vsIA13）比較中也均呈下調(diào)表達(dá)，這表明了在紅鰭東方鲀腸中這些基因的表達(dá)量更高，發(fā)揮了更多的作用，所以推測(cè)其腸代謝和消化的功能更強(qiáng)。但在斑馬魚消化功能研究中則發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的前腸（胃）、中腸的消化功能更強(qiáng)[27]，這樣消化功能的不同可能與兩種魚的食性不同有關(guān)。cldn3a 是保護(hù)腸道的屏障、防止有害大分子物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)[28]。cdh2 通過介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附，以此促進(jìn)粘附結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定[29]。cldn3a 和cdh2 在本研究中均呈上調(diào)表達(dá)。根據(jù)以上研究推測(cè)紅鰭東方鲀胃的免疫和保護(hù)功能更發(fā)達(dá)。

在KEGG 的富集中發(fā)現(xiàn)大量與代謝有關(guān)的通路存在顯著富集：花生四烯酸代謝、甘油酯代謝、膽固醇代謝等，這些代謝通路中大多數(shù)的差異基因在腸中表達(dá)量高于胃呈下調(diào)表達(dá)。但在粘著連接、緊密連接、細(xì)胞粘附分子等通路中大多數(shù)的基因在腸中表達(dá)量低于胃呈上調(diào)表達(dá)。通過KEGG 富集分析了差異基因之間的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步證明本研究推測(cè)的紅鰭東方鲀胃的消化功能可能不太發(fā)達(dá)，其消化和吸收可能主要是在腸道中進(jìn)行。已有的研究表明，pH 影響消化道蛋白酶的活性[30]，且在微顆粒飼料中添加外源性酶對(duì)魚的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用[31]。以此推測(cè)由于胃中pH 偏酸性，腸中pH 偏堿性[32]，而紅鰭東方鲀消化可能主要是在腸中進(jìn)行,選擇在紅鰭東方鲀的飼料中添加適量偏堿性環(huán)境的外源性酶，可能更能提高其飼料的利用率。

本文通過對(duì)紅鰭東方鲀腸和胃的轉(zhuǎn)錄組比較分析，研究2 種組織在基因表達(dá)上的差異性。在腸相對(duì)胃的比較中共獲得3 564 個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 167 個(gè)上調(diào)表達(dá)，1 397 個(gè)下調(diào)表達(dá)。在GO 富集結(jié)果中酶調(diào)節(jié)活動(dòng)、細(xì)胞骨架結(jié)合、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等功能存在顯著富集。在KEGG 的富集分析中發(fā)現(xiàn)大量與代謝有關(guān)的通路存在顯著富集，這些代謝通路中大多數(shù)的差異基因在腸中表達(dá)量高于胃呈下調(diào)表達(dá)。在粘著連接、緊密連接、細(xì)胞粘附分子等通路中也存在顯著富集，其中大多數(shù)的基因在腸中表達(dá)量低于胃呈上調(diào)表達(dá)。通過對(duì)相關(guān)差異基因和信號(hào)通路的研究，為今后養(yǎng)殖紅鰭東方鲀餌料選擇和提高餌料系數(shù)奠定了基礎(chǔ)。