嚴俊麗，張廣明，吳 彪，孫秀俊，石 英，李學麗，王 強，劉建勝，孔垂民

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院動物科技學院，山東濰坊 261000；2.濰坊海洋科技職業(yè)學院海洋生物學院，山東濰坊 261000；3.濰坊科技學院招生就業(yè)處，山東濰坊 261000；4.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點試驗室，中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071）

蝦夷扇貝Mizuhopecten yessoensis 隸屬于軟體動物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、翼形亞綱Pterimorphia、珍珠貝目Pterioida、扇貝科Pectinidae、蝦夷扇貝屬Mizuhopecten[1]。原產(chǎn)于俄羅斯千島群島南部、日本北海道和本州北部以及朝鮮半島東部海域，屬于冷水性雙殼貝類[2]。其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值高，受到廣大養(yǎng)殖戶和消費者一致好評[3]。自20 世紀80 年代從日本引入我國開展人工育苗和增養(yǎng)殖以來，蝦夷扇貝迅速在我國黃海北部和山東半島北部部分沿海形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模[4]。近年來，蝦夷扇貝夏季高溫死亡給養(yǎng)殖戶帶來巨大經(jīng)濟損失的同時，一定程度上制約了我國扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[5]。探討蝦夷扇貝的高溫應激機理，旨為解決高溫死亡問題打下堅實的基礎。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSPs）是高度保守的應激蛋白，在生物體應對高溫、缺氧、有機物污染和病原體侵染等環(huán)境脅迫時發(fā)生作用[6]。正常生理狀態(tài)下，HSPs 作為分子伴侶和不同的多肽鏈非特異性結合催化介導蛋白質特定構象的形成，表達量較少；出現(xiàn)環(huán)境脅迫時，其表達量激增幫助生物體免受傷害[7]。HSPs 家族種類較多，根據(jù)分子量大小分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小分子熱休克蛋白等類型[8]。

HSP90 作為HSPs 家族中重要的成員之一，在多種生物體內均有表達，除了行使分子伴侶的功能外，還參與機體信號傳導、細胞周期及免疫調節(jié)，對于維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用[9]。目前，HSP90 已成為細胞免疫、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、信號轉導及腫瘤研究的前沿課題。關于軟體動物HSP90 的研究主要有：魁蚶Scapharca broughtonii[10]、三角帆蚌Hyriopsis cumingii[11]、獨角雪冰魚Chionodraco hamatus 和伯氏肩孔南極魚Trematomus bernacchii[12]、近江牡蠣Craassostrea hongkongensis[13]、厚殼貽貝Mytilus edulis[14]、海灣扇貝Argopecten irradians[15]。然而，關于蝦夷扇貝HSP90 基因（命名為MYHSP90）的相關研究未見報道。

本試驗從蝦夷扇貝轉錄組文庫中鑒定出HSP90 基因的UniGene 序列，利用RACE 技術克隆了該基因的cDNA 全長序列；分析其核酸、氨基酸序列及蛋白結構；利用qRT-PCR 技術檢測分析其組織分布特點，以期為蝦夷扇貝的免疫研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

試驗用蝦夷扇貝（殼長70 mm 左右）取自青島市膠南海區(qū)，試驗室條件下暫養(yǎng)充氣海水中1 周（20 ℃），每日換水2 次，期間投喂硅藻，試驗前2 天停止投喂。

1.2 MYHSP90 基因全長cDNA 的獲得

1.2.1 RNA 提取和cDNA 合成異硫氰酸胍法提取總RNA，詳細方法參照文獻[16]。1.2%瓊脂糖檢測總RNA 完整性，核酸分析儀BioPhotometer D30（Eppendorf）檢測RNA 的純度與濃度。

1.2.1.1 RACE 模板的制備

根據(jù)SMARTerTMRACE cDNAAmplication Kit 說明書分別合成5’-RACE-Ready cDNA 和3’-RACEReady cDNA。

1.2.1.2 cDNA 克隆測序及序列分析

根據(jù)本實驗室建立EST 轉錄組文庫，利用Primer primer 5.0 及Oligo 6.0 軟件設計RACE 特異性引物MYHSP90-F/R。RACE 擴增體系為30 μL：cDNA 模板1 μL，dNTP Mixture（each 2.5 mmol·L-1）4 μL，MYHSP90-F 1 μL，MYHSP90-R 1 μL，10×LA PCR bufferⅡ（Mg2+Plus）3 μL，TaKaRa LA Taq（5 U·μL-1）0.3 μL，滅菌ddH2O 19.7 μL。擴增反應條件：94 ℃，1 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，2 min，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃保存。巢式PCR 利用NUP 和巢式引物進行擴增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）回收，膠回收產(chǎn)物與pMD18-T 連接，亞克隆至Escherich coli Top10 感受態(tài)細胞，并挑陽性克隆進行測序。

序列分析DNAStar 軟件對cDNA 序列的開放閱讀框進行搜索、氨基酸預測；ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）預測HSP90 蛋白的分子量（Mw）及等電點pI；SignalIP 4.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測HSP90 蛋白N 端信號肽;SMART（http://www.expasy.ch/SMART）預測分析HSP90 蛋白功能域；BLASTp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在線對HSP90 核苷酸序列進行同源檢索分析；MEGA 5.0 構建基于不同物種HSP90 氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 MYHSP90 組織分布

1.3.1 組織取樣

隨機取3 個個體，活體解剖取上外套膜、下外套膜、肝胰腺、大閉殼肌、小閉殼肌、斧足、鰓、性腺，立即置于液氮中，將同一組織混合研磨提取RNA。

1.3.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

根據(jù)定量引物設計原則,Primer Premier 5.0 設計定量引物Q-F/R，選取β-actin 基因作為內參基因[16]。qRT-PCR 擴增（ABI 7500 PCR 儀）體系為：SYBRPremix EX Taq TM Ⅱ10 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，Q-F/R 0.8 μL，cDNA 2 μL，滅菌ddH2O 6 μL。反應條件為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，40個循環(huán)。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

得到的數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法[17]進行分析，獲得基因的相對表達量。采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，當P＜0.05 為存在顯著性差異，P＜0.01 為存在極顯著性差異。

表1 MYHSP90 擴增所用引物序列Tab.1 The primers used in the cloning of MYHSP90

2 結果

2.1 MYHSP90 基因的cDNA 序列分析

將擴增并測序的5’-RACE、3’-RACE 序列及已知序列拼接后得到蝦夷扇貝的HSP90 基因的cDNA全長序列，命名為MYHSP90（GenBankAccssion No.MW175520）。MYHSP90 基因的cDNA 全長2 524 bp：開放閱讀框（ORF）2 181 bp，5’-非編碼區(qū)（5’-UTR）67 bp，3’-非編碼區(qū)（3’-UTR）325bp。該基因編碼一個由726 個氨基酸組成的蛋白質，預測蛋白分子量為83.21 kDa，理論等電點pI 為4.81，具有5 個保守的HSP90 蛋白功能域家族序列標簽：FLRELISNASSDALDKIR（260-311），LGTIAKSGT（450-475），IGQFGVGFYSAYLVAD（522-567），IKLYVRRVFI（1 203-1 229），GVVDSEDLPLNISRE（1 278-1 322）。結構特征分析結果表明：該氨基酸序列無信號肽，也非線粒體靶向肽，無明顯的跨膜區(qū)域；該蛋白具有多個功能化位點，第233 位有表皮生長因子受體磷酸化位點；第242 位有丙氨酸脫氫酶磷酸化位點；第393 位有絲氨酸蛋白酶磷酸化位點；第1 160 位有DNA 裂解酶鐵-硫結合結構域磷酸化位點。C 末端存在保守的MEEVD多肽結構。圖1 為MYHSP90 的預測三級結構，圖2 為核苷酸序列和相對應的氨基酸序列。

圖1 MYHSP90 預測的三級結構Fig.1 The modeled tertiary structures of MYHSP90

圖2 MYHSP90 核苷酸序列及相對應的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of MYHSP90

2.2 MYHSP90 同源性分析

在線BLASTp 同源性分析結果如圖3 所示，MYHSP90 編碼的氨基酸序列與其它物種編碼的氨基酸序列同源性很大。與櫛孔扇貝C.farreri 相似性最高，為92.3%，海灣扇貝A.irradiaas 為86.5%，縊蟶S.constricta 為81.9%，近江牡蠣C.hongkongensis 為79.9%，魁蚶S.broughtonii 為79.1%。

DNAman 8.0 對15 個物種的HSP90 的氨基酸序列進行比對，HSP90 的氨基酸序列高度保守，HSP90家族的5 個簽名序列和C 端的MEEVD 短肽序列也極其保守。

Mega 5.0 軟件以鄰位相接法（Neighbor-joining 法），構建了HSP90 氨基酸的進化樹，結構如圖4 所示，在HSP90 分子進化樹中可以看到脊椎動物和無脊椎動物分為2 支，在無脊椎動物中，MYHSP90 雙殼類HSP90 分子聚類后再與斧足類HSP90 聚在一起。

圖4 HSP90 的Neighbour-Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of HSP90s

2.3 MYHSP90 基因的組織表達

qRT-PCR 檢測的組織分布結果顯示（圖5），MYHSP90 分布于蝦夷扇貝外套膜、肝胰腺、斧足、鰓、性腺中。性腺和肝胰腺中的基因表達量差異極顯著，且在各組織中表達量差異極顯著，其中在性腺中表達量最高，在性腺中表達量次之。

圖5 蝦夷扇貝MYHP90 的組織表達Fig.5 The tissue expression of MYHP90

3 討論

本文以蝦夷扇貝轉錄組文庫中注釋得到的Uni-Gene 為基礎，克隆得到HSP90 基因全長序列，并分析其氨基酸序列。MYHSP90 基因全長2 524 bp，ORF 為2 181 bp，編碼了726 個氨基酸?？繱.broughtonii 的HSP90 基因全長2 707 bp，ORF 為2 187 bp，編碼了728 個氨基酸[16]。大黃魚HSP90 基因全長2 715 bp，ORF為2 178 bp，編碼了725 個氨基酸[18]。獨角雪冰魚C.hamatus ORF 為2 184 bp，編碼了728 個氨基酸，尼羅羅非魚O.niloticus ORF 為2 175 bp，編碼了725 個氨基酸[12]。這表明海洋生物HSP90 基因大小相當，氨基酸數(shù)量相差不大，氨基酸序列的保守性推測可能具有高等動物HSP90 相同的功能和活性。

HSP90 作為真核生物體內重要的分子伴侶，廣泛介導了脅迫信號的傳遞，在細胞免疫、信號轉導以及抗腫瘤研究較多[19]。同時因其高度保守性，被廣泛應用于分子進化和分子系統(tǒng)學研究[20-21]，在極端的溫度適應中也發(fā)揮著重要的作用[22-23]。溫度脅迫時，HSP90 表達量有明顯變化[24-25]。低溫（0.5 ℃）和高溫（25 ℃）分別脅迫中國大鯢A.davidianus，發(fā)現(xiàn)低溫時在腸道、胰腺和胃中HSP90 表達量下調，高溫時上調[26]。溫度脅迫刺參A.japonicus，HSP90 的表達量在不同組織中也呈現(xiàn)顯著性差異[27]。正常生理狀態(tài)下的蝦夷扇貝，HSP90 基因的表達具有組織特異性，在性腺、肝胰腺和鰓中表達量較高，且在性腺中的表達量明顯高于其它組織，這一結果和近江牡蠣C.hongkongensis 中的表達量相似[28]，推測產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是HSP90 有阻斷凋亡酶激活因子Apaf-1寡聚糖化，阻斷凋亡體形成的作用[29]，而性腺中可溶性蛋白、多肽的種類較其他組織更為豐富[30-33]，推測在蝦夷扇貝體內，性腺承擔了重要免疫器官的作用，可能參與了蛋白質和酶類分子的合成、應激反應等過程。當溫度脅迫三角帆蚌H.cumingii 時，HSP90 表達量最高的器官分別是肝胰腺和性腺，得到了類似的結果[11]。分析HSPs家族的其它基因在蝦夷扇貝的表達情況，正常溫度下HSP60 在肝胰腺和腎臟中表達量最高，升溫后在腎臟中表達量極顯著，而HSP70 在鰓組織中的表達量明顯高于閉殼肌和外套膜中[34]。關于HSPs 家族的成員在蝦夷扇貝的不同組織中呈差異性表達的原因，將在接下來的工作中進一步研究。

熱脅迫對生物體的影響較大。日本三角渦蟲Freshwater planarian dugesia japonica 由18 ℃升高至30 ℃，熱處理48 h，HSP70 表達量是對照組的2 倍[35]。溫度的一次效應、二次效應對馬氏珠母貝鰓HSP70 基因表達量影響顯著[36]。熱脅迫下，機體的消化功能、免疫功能、生長、行為、神經(jīng)內分泌等方面受影響明顯，主要原因在于熱脅迫影響細胞內自由基的穩(wěn)定性，導致細胞內線粒體氧化損傷，從而引起脂肪、蛋白質、糖類資源的重新整合[37]。高溫脅迫菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum，鰓中HSP90 基因表達量在6 h 達到最高表達量[38]。37 ℃熱激厚殼貽貝，肝胰腺和鰓中HSP70 基因表達量在2 h 即達到對照組的30 倍[14]。試驗結果可為研究蝦夷扇貝HSP90 基因上調表達，維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，以及探討因地理分布和異地增養(yǎng)殖的功能適應提供理論依據(jù)。

4 結論

本研究采用RACE 技術克隆獲得蝦夷扇貝熱休克蛋白90（HSP90）基因cDNA 全長序列。并分析了核苷酸、氨基酸序列，蛋白結構域特點，并做了同源性分析和系統(tǒng)進化研究。qRT-PCR 結果表明，MYHSP90基因在蝦夷扇貝8 種組織中均有表達，性腺中表達量最高，而閉殼肌中表達量最低。