熊發(fā)前劉 菁陽(yáng)太億蔣 菁賀梁瓊唐秀梅韓柱強(qiáng)鐘瑞春吳海寧黃志鵬唐榮華劉俊仙

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,廣西 南寧 530007;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,廣西 南寧 530007)

在形態(tài)、品質(zhì)、抗性等表型上,栽培種花生存在著較豐富變異,但起源及育種栽培中的定向選擇導(dǎo)致栽培種花生遺傳基礎(chǔ)非常狹窄,雖然利用常規(guī)分子標(biāo)記技術(shù)能檢測(cè)到栽培種花生中一定量的DNA多態(tài)性,但這些技術(shù)存在著重復(fù)性差、操作復(fù)雜、成本高和多態(tài)性不高等缺點(diǎn),研究表明SSR 標(biāo)記在花生栽培種間存在較豐富的多態(tài)性,使其成為當(dāng)前檢測(cè)栽培種花生DNA 多態(tài)性的主要分子標(biāo)記,但能在任意兩個(gè)栽培種花生品種間檢測(cè)出DNA 多態(tài)性的SSR標(biāo)記引物仍然比較匱乏[1-2]。 雖然近年來(lái)也不斷有研究者利用高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)開發(fā)栽培種花生SNP標(biāo)記,但SNP標(biāo)記的檢測(cè)對(duì)設(shè)備要求高,且很難在不同實(shí)驗(yàn)室之間通用。 因此,有必要在花生上開發(fā)新的分子標(biāo)記技術(shù),往栽培種花生上引入更多簡(jiǎn)單實(shí)用的高效分子標(biāo)記。

長(zhǎng)末端重復(fù)(long terminal repeat,LTR)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是高等植物基因組中最為豐富的一大類轉(zhuǎn)座元件,其具有的高拷貝、高度異質(zhì)性和插入多態(tài)性等特點(diǎn)非常適合開發(fā)成分子標(biāo)記,開發(fā)出來(lái)的分子標(biāo)記可作為SSR 標(biāo)記和SNP標(biāo)記的有效補(bǔ)充。 但到目前為止,在栽培種花生上尚未見到基于LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子開發(fā)分子標(biāo)記的研究報(bào)道。

分離和鑒定LTR 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是基于LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記開發(fā)利用的前提。 而有關(guān)花生LTR 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分離研究卻鮮見報(bào)道,Nielen等先后分離獲得了花生Ty3-gypsy和Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子FIDEL和Matita的全長(zhǎng)序列并對(duì)它們的拷貝數(shù)、染色體分布及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了研究[3-4]。 除此之外,筆者曾系統(tǒng)闡述了花生LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted repeat transposable element,MITE)的分離及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[5],也對(duì)四倍體野生種花生(A.monticola)的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行了克隆與序列分析[6],但尚未見有對(duì)栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列克隆及序列分析的報(bào)道。

本研究擬克隆栽培種花生品種桂花1026的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列,并進(jìn)行序列特征分析,調(diào)查了該類反轉(zhuǎn)錄酶序列的組成和變異模式及與其他物種植物之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,以期為開發(fā)栽培種花生基于Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用栽培種花生品種為桂花1026,是廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育出來(lái)的廣西第一個(gè)通過(guò)國(guó)家審定的花生品種[7]。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 的提取

采用筆者先前建立的改良CTAB 法對(duì)花生高質(zhì)量基因組DNA 進(jìn)行提取[8]。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR 擴(kuò)增

參照Kumar等[8]設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,上游引物為RTp1:5’-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3’, 下游引物為RTp2:5’-ARCATRTCRTCNACRTA-3’,其中N=A/T/C/G,R=A/G,Y=C/T。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的體系和程序及產(chǎn)物檢測(cè)分離參考報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的回收、克隆、轉(zhuǎn)化及測(cè)序

具體參考報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄酶序列分析

序列相似性檢索、序列統(tǒng)計(jì)分析、序列圖及Logo圖生成、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)統(tǒng)計(jì)、保守基序預(yù)測(cè)等參考報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行[6]。 運(yùn)用MEGA6.0軟件的鄰接法(No.of differences模型)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,自展值設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

圖1 可見,本研究所用簡(jiǎn)并引物對(duì)在桂花1026中擴(kuò)增得到了一條260 bp左右大小的目的條帶,對(duì)目的片段進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序,共獲得了46條序列。 利用DNAMAN 軟件等去除46條序列中的重復(fù)序列,利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)46條序列進(jìn)行相似性分析,去除非反轉(zhuǎn)錄酶序列,最后共獲得了34條非重復(fù)的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列,將單條序列按照Ah RT1-X的形式進(jìn)行命名,并提交每條反轉(zhuǎn)錄酶序列到GenBank,對(duì)34條反轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖2),為了展示堿基在每個(gè)位置上的保守性,也生成了序列比對(duì)logo圖 (圖3)。

圖1 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from cultivated peanut

圖2 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons amplified from cultivated peanut

圖3 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列比對(duì)logoFig.3 The alignment logo of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons amplified from cultivated peanut

2.2 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的相似性與異質(zhì)性分析

從栽培種花生品種桂花1026基因組中克隆獲得的34條反轉(zhuǎn)錄酶序列長(zhǎng)度變化范圍為256～267 bp,其中,AhRT1-49和AhRT1-59的序列最長(zhǎng),為267 bp,AhRT1-20的序列最短,為256 bp,絕大多數(shù)序列長(zhǎng)度為266 bp,擁有266 bp長(zhǎng)度的序列占總序列數(shù)的76.47%,本研究中栽培種花生的反轉(zhuǎn)錄酶序列長(zhǎng)度都小于Voytas等[10]報(bào)道的273 bp,都存在不同程度的缺失(6～17 bp)。 通過(guò)對(duì)這34條序列堿基進(jìn)行分析,A、T、C、G 數(shù)量變化范圍分別為57～95、75～93、29～71和43～68,AT所占比例范圍為51.36%～67.79%,AT 與GC比例為1.06～2.10,最高達(dá)2.10。 核苷酸序列間相似性范圍為44.9%～98.5%,表明存在較高異質(zhì)性,其中,Ah RT1-16與Ah RT1-61之間的相似性最高,達(dá)98.5%,Ah RT1-11 與AhRT1-20 之間的相似性最低,為44.9%(表1)。

表1 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的基本信息Table 1 The basic information of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from cultivated peanut

2.3 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列聚類分析

根據(jù)遺傳進(jìn)化樹的分支長(zhǎng)度可將這34條序列分為3個(gè)家族(圖4)。 其中家族Ⅰ包含19條序列,家族Ⅱ包含12條序列,剩下的3條序列(AhRT1-20、AhRT1-24和AhRT1-64)與其他序列差異較大單獨(dú)聚為家族Ⅲ,這個(gè)家族與其他家族遺傳距離最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。 家族Ⅰ和家族Ⅱ分別占到了總序列數(shù)的55.88%和35.29%,表明這2個(gè)家族是構(gòu)成栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的主要成分,也表明栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列有非常高的保守性與相似性。

圖4 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from cultivated peanut

2.4 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列分析

34條反轉(zhuǎn)錄酶序列間相似性范圍11.4%～98.9%,呈高度異質(zhì)性,其中AhRT1-20與AhRT1-59的相似性最低(11.4%),但這兩條核苷酸序列間相似性為54.7%,并不是最低的;Ah RT1-29 與Ah RT1-61的相似性最高(98.9%),但這兩條核苷酸序列間相似性為97.7%,也并不是最高的。

圖5可見,34條序列中有14條發(fā)生了1～7個(gè)無(wú)義突變。 其中,AhRT1-59的無(wú)義突變最多,有7個(gè)無(wú)義突變,分別在第18、65、66、71、75、76、77個(gè)氨基酸處;AhRT1-26和AhRT1-49各有5個(gè)無(wú)義突變,AhRT1-26在第30、32、60、74、76個(gè)氨基酸處發(fā)生了突變,AhRT1-49在第21、51、58、74、77個(gè)氨基酸處發(fā)生了突變;AhRT1-21有4個(gè)無(wú)義突變,分別在第32、39、82、85個(gè)氨基酸處;AhRT1-1和AhRT1-20各有3個(gè)無(wú)義突變,AhRT1-1的終止密碼子連續(xù)出現(xiàn)在第75、76、77個(gè)氨基酸處,AhRT1-20的終止密碼子出現(xiàn)在第50、62、82個(gè)氨基酸處;AhRT1-3(第16、18個(gè)氨基酸處)、Ah RT1-11(第16、46 個(gè)氨基酸處)、Ah RT1-43(第46、52 個(gè)氨基酸處) 和Ah RT1-56(第46、71個(gè)氨基酸處)各有2個(gè)無(wú)義突變;剩余的Ah RT1-9(第44 個(gè)氨基酸處)、Ah RT1-12(第26個(gè)氨基酸處)、Ah RT1-22(第21個(gè)氨基酸處)和AhRT1-57(第46個(gè)氨基酸處)均只有1個(gè)無(wú)義突變。

圖5 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.5 Multiple alignment of amino acid sequences of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from cultivated peanut

根據(jù)核苷酸聚類結(jié)果,選擇每個(gè)家族中的代表序列,利用在線程序Phyre2預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(表2;圖6),代表序列蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)匹配覆蓋度最高的模板為d1hara,置信度均為61.5～73.1,屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族。 二級(jí)結(jié)構(gòu)包含2個(gè)α-螺旋和4～5個(gè)β-折疊,圖6A 為家族Ⅰ中代表序列Ah RT1-14的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);三級(jí)結(jié)構(gòu)包含5～6個(gè)轉(zhuǎn)角和30個(gè)氫鍵,還有1個(gè)明顯的螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)不明顯的折疊結(jié)構(gòu)(紅色為N 端,藍(lán)色為C 端),圖6B 為家族I中代表序列AhRT1-14的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖6 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)與三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)Fig.6 The protein secondary(A)and tertiary(B)structure of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from cultivated peanut

表2 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息Table 2 The protein structure information of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from cultivated peanut

2.5 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶保守基序預(yù)測(cè)

34條序列共存在10種保守基序,其中同時(shí)包含motif 1、motif 2和motif 3這3種保守基序的序列共有26條,占全部序列數(shù)的76.47%,即上游保守序列motif 1為第1位至第50位的5’-TAFFHGDLDKEIYMEQPEGFVVKGKEDFVCKL KKSLYGLKQAPRQWYYKKF-3’,中游保守序列motif 3為第52位至59位的5’-SVMGKHGY-3’及下游保守序列motif 2 的5’-RKTTSDHCVFVQKFSDDDFIILLLYVDDM-3’,表明這3 種保守基序是栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶的主要基序。 另外8條序列中包含7種不同的保守基序,在所克隆序列中出現(xiàn)的頻率較低而且長(zhǎng)度較短,估計(jì)可能是進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生突變所致,這8條中的7條序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹中也是單獨(dú)聚為Ⅴ類和Ⅶ類的,也從側(cè)面驗(yàn)證了這7條序列含有不同保守基序的準(zhǔn)確性 (圖7)。

圖7 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶保守基序預(yù)測(cè)Fig.7 The conservative motifs prediction of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from cultivated peanut

2.6 栽培種花生Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從系統(tǒng)進(jìn)化樹上可看出,所有反轉(zhuǎn)錄酶序列可分為7類(表3,圖8)。 其中,Ⅰ類包含16條栽培種花生和8條其他物種植物的反轉(zhuǎn)錄酶序列,除歐洲云杉(Picea abies,O49918)為裸子植物外,其余均為雙子葉植物,說(shuō)明栽培種花生的16條反轉(zhuǎn)錄酶序列與葡萄(Vitis vinifera) 的CAN72446.1、 辣 椒 (Capsicumannuum) 的AFS89513.1、 馬鈴薯(Solanumtuberosum) 的CAA13065.1、 野茶樹(Camelliasinensis) 的CAJ09751.1、 煙 草 (Nicotaniatabacum) 的AAA03507.1和番茄(Lycopersicon esculentum)的AF072638.1之間具有很高相似性,且在Ⅰ類當(dāng)中,栽培種花生的Ah RT1-57與馬鈴薯(Solanum tuberosum)的CAA13065.1具有較高相似性,親緣關(guān)系最近;Ⅱ類包含栽培種花生的11條反轉(zhuǎn)錄酶序列和大豆(Glycine max)的E47759、甜菜(Beta vulgaris)的T14589、楊樹(Populus ciliata)的AAT73704.1 和 橙 (Citrus sinensis) 的CAJ41389.1,它們之間相似性較高;Ⅰ類和Ⅱ類分別包含16 條和11 條栽培種花生反轉(zhuǎn)錄酶序列,表明栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列具有相當(dāng)高的保守性與相似性;其他物種植物中的綠豆(Vigna radiata,AAT90494.1)單獨(dú)聚為Ⅲ類;玉米(Zea mays)的AAK84853.1與擬南芥(Arabidopsis thaliana)的S71291聚為Ⅳ類;Ⅴ類包含2條栽培種花生的反轉(zhuǎn)錄酶序列以及草莓(Fragaria x ananassa)的ACZ81628.1和鐵皮石斛 (Dendrobiumofficinale) 的AIL54325.1 序列,表明它們之間具有較高相似性,但與其他類遺傳距離較遠(yuǎn);來(lái)源于向日葵(Helianthus annuus)的AAA33373.1、栽培稻(Oryza sativa)的T03671和燕麥(Avena sativa)的I47759聚為Ⅵ類;剩余的5條栽培種花生的反轉(zhuǎn)錄酶序列單獨(dú)聚為Ⅶ類,它們之間相似性較高,但與其他類遺傳距離最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。 Ⅴ類和Ⅶ類分別包含2條和5條花生反轉(zhuǎn)錄酶序列,也說(shuō)明栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列具有較高異質(zhì)性與遺傳變異率。

圖8 栽培種花生與部分其他物種植物Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of amino acid sequences of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from cultivated peanut and some other plant species

表3 部分其他物種植物的Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列信息Table 3 The amino acid sequences information of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons from other plant species

3 討 論

本研究首次對(duì)栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,從中擴(kuò)增出260 bp左右的目的片段,與Voytas等[10]的研究結(jié)果一致,對(duì)目的片段進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序,經(jīng)去除非反轉(zhuǎn)錄酶序列和重復(fù)序列,共獲得34條反轉(zhuǎn)錄酶序列,說(shuō)明該類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子廣泛存在于栽培種花生中,且具有相當(dāng)高的保守性,同時(shí)也證實(shí)了Kumar等[8]提出的利用簡(jiǎn)并引物來(lái)分離克隆栽培種花生基因組中的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的方法是切實(shí)可行的。

用同一簡(jiǎn)并引物從同一栽培種花生種質(zhì)中PCR擴(kuò)增出單一條帶的前提下,克隆獲得的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸和氨基酸序列在序列長(zhǎng)度、序列組成及序列相似性等方面存在較大差異和多態(tài)性,表明同一栽培種花生種質(zhì)內(nèi)同一類群反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子存在較高異質(zhì)性,這些異質(zhì)性主要來(lái)源于缺失突變及無(wú)義突變。34條序列長(zhǎng)度變化范圍為256～267 bp,相差11 bp,但都小于Voytas等[10]報(bào)道的273 bp,存在不同程度的缺失突變;34條序列均富含AT 堿基,AT 所占比例范圍為51.36%～67.79%,AT 與GC比例為1.06～2.10,最高達(dá)2.10,導(dǎo)致較高異質(zhì)性;核苷酸序列間相似性范圍為44.9%～98.5%,呈現(xiàn)較高異質(zhì)性;翻譯成氨基酸后,34條序列中的14條發(fā)生了無(wú)義突變,無(wú)義突變導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子失去轉(zhuǎn)錄活性,無(wú)義突變可能是導(dǎo)致花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表現(xiàn)出較高異質(zhì)性和多拷貝的主要原因;氨基酸序列間相似性范圍為11.4%～98.9%,呈現(xiàn)高度異質(zhì)性;各序列間保守基序也存在較大差異,呈較高異質(zhì)性。 異質(zhì)性產(chǎn)生的原因?yàn)?①反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座過(guò)程中易發(fā)生高頻突變;②核苷酸自然突變(胞嘧啶到胸腺嘧啶)和同源重組增加了序列變異幾率;③宿主的防御機(jī)制促使反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子發(fā)生變異;④反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的縱向傳遞和橫向傳遞。

遺傳進(jìn)化樹顯示34條反轉(zhuǎn)錄酶序列被分為3個(gè)家族,其中,家族Ⅰ和家族Ⅱ是主要成分,含序列數(shù)愈多的家族歷史愈久遠(yuǎn)。 各家族內(nèi)部成員越復(fù)雜,序列相似性越高,存在有轉(zhuǎn)錄活性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的可能性也越大,其轉(zhuǎn)座發(fā)生的時(shí)間可能越近。 家族Ⅰ和家族Ⅱ中分別有11條和7條反轉(zhuǎn)錄酶序列未發(fā)生無(wú)義突變,推測(cè)這兩個(gè)家族很有可能是存在具有轉(zhuǎn)錄活性的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的家族,存在的歷史也更為久遠(yuǎn)。

各家族中代表序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本類似,但在β-折疊數(shù)和轉(zhuǎn)角數(shù)上存在著細(xì)微差別,家族Ⅲ中AhRT1-64的β-折疊數(shù)要少于其他代表序列,其轉(zhuǎn)角數(shù)要多于其他代表序列,這也表明栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子存在較高異質(zhì)性和多態(tài)性,推測(cè)這些細(xì)微差別可能會(huì)影響到Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性、轉(zhuǎn)座效率及拷貝數(shù)等。

從系統(tǒng)進(jìn)化樹上可看出,Ⅰ類中的16條栽培種花生反轉(zhuǎn)錄酶序列與來(lái)自葡萄、馬鈴薯、辣椒、野茶樹、煙草和番茄的序列間相似性較高;Ⅱ類中的11條栽培種花生反轉(zhuǎn)錄酶序列與來(lái)自大豆、甜菜、楊樹和橙的序列間具有較高相似性;Ⅴ類中的2條栽培種花生反轉(zhuǎn)錄酶序列與來(lái)自草莓、鐵皮石斛的序列間具有較高相似性,故而推測(cè)栽培種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可能與這些物種間發(fā)生過(guò)橫向傳遞。 Ⅶ類包含5條栽培種花生的反轉(zhuǎn)錄酶序列,表明它們之間相似性較高,但與其他物種植物的反轉(zhuǎn)錄酶序列遺傳距離最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn),說(shuō)明這兩條序列在起源和進(jìn)化上可能較為古老,特異性比較強(qiáng),可能為栽培種花生所特有。 在核苷酸水平上,AhRT1-20和AhRT1-24聚為一小類,這一小類再與AhRT1-64聚為一大類(Ⅲ),但在氨基酸水平上,AhRT1-24 是和AhRT1-64 聚為一小類的,AhRT1-20是在另外一大類的,但這3條序列都與其他栽培種花生的反轉(zhuǎn)錄酶序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本研究從栽培種花生中成功分離出Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列,將為下一步分離其全長(zhǎng)序列、研究其轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性和功能提供序列基礎(chǔ),也對(duì)栽培種花生基于LTR 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記開發(fā)及花生分子育種具有重要意義。