李志海，楊勤珍，木崇仙

阿爾茲海默病是一種臨床較為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病隱蔽、進(jìn)行性發(fā)展的特點(diǎn)[1-2]。阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素、頭部外傷、甲狀腺疾病史、免疫系統(tǒng)疾病史等因素有關(guān)，但是目前臨床醫(yī)學(xué)尚未將阿爾茲海默病癥狀的發(fā)病機(jī)制研究透徹[3]。目前臨床常使用抗精神疾病癥狀以及改善認(rèn)知功能的藥物對(duì)阿爾茲海默病病人進(jìn)行治療，但是臨床療效并不理想。因此，有學(xué)者開(kāi)始致力于使用中醫(yī)藥對(duì)阿爾茲海默病進(jìn)行干預(yù)的研究。丹參酮是一種自丹參中提取出來(lái)的脂溶性成分，具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖分裂的作用，有學(xué)者在研究中對(duì)丹參酮提取物藥理作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等諸多藥理作用[4]，但是關(guān)于使用丹參酮對(duì)阿爾茲海默病進(jìn)行干預(yù)的研究還鮮有報(bào)道。本研究探討丹參酮提取物對(duì)阿爾茲海默病模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 研究動(dòng)物：選取40只SD健康雄性大鼠，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，月齡7～9個(gè)月，體質(zhì)量220～238 g。在相對(duì)濕度30%～35%、溫度(23.8±1.5)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠1周，光照12 h/d。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：小鼠抗大鼠hs-CRP抗體(Selleck公司)；兔抗大鼠TNF-α抗體(Sigma公司)；小鼠抗大鼠IL-4抗體(BD公司)；兔抗大鼠Bcl-2、Bax抗體(Dako公司)；小鼠抗大鼠caspase3抗體(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 隨機(jī)選取30只大鼠建立阿爾茲海默病模型：使用45 mg/kg亞硝酸鈉以及120 mg/kg D-半乳糖對(duì)大鼠進(jìn)行頸背部皮下注射，每天1次，連續(xù)干預(yù)至大鼠表現(xiàn)為癡呆狀態(tài)。大鼠抓耳撓腮等自主活動(dòng)增多、出現(xiàn)癡呆表現(xiàn)視為建模成功，30只大鼠全部建模成功。將30只阿爾茲海默病模型大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、高劑量組各10只，其余10只為正常組。參照仇淑君等[5]研究中干預(yù)方法，并作出適當(dāng)改動(dòng)，使用不同劑量丹參酮提取物溶液對(duì)阿爾茲海默病大鼠進(jìn)行干預(yù)：低劑量組、高劑量組大鼠分別使用10 g/L、30 g/L丹參酮提取物溶液進(jìn)行灌胃，正常組、模型組大鼠使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃。

1.2.2 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 建造圓形水池，直徑設(shè)置為1.5 m、高為0.5 m，水深設(shè)置為0.25 m，池中水溫控制在27 ℃左右。水池中間放置直徑0.1 m，高0.3 m平臺(tái)，并于池壁之上設(shè)置4個(gè)入水點(diǎn)位，水池外環(huán)境保持不變。將已設(shè)置的4個(gè)點(diǎn)位作為入水區(qū)，統(tǒng)計(jì)大鼠自此游至所設(shè)平臺(tái)時(shí)間，120 s內(nèi)未游至平臺(tái)則將其引至平臺(tái)，潛伏期記為120 s。于平臺(tái)之上留置0.5 min，再次將其自不同入水點(diǎn)放入水中測(cè)試。所有大鼠均進(jìn)行4 d測(cè)試，于第5天撤除平臺(tái)，自入水區(qū)將大鼠放入水中，統(tǒng)計(jì)60 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)。

1.2.3 HE染色 對(duì)各組大鼠進(jìn)行全麻處理，采用斷頭法處死，取大鼠海馬區(qū)腦組織，液氮冷凍后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，間距5 mm做連續(xù)切片。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入100%、95%、80%、75%濃度的乙醇中各復(fù)水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸乙醇分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用乙醇脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IL-4、hs-CRP、TNF-α水平 取50 mm碳酸鹽包緩沖液對(duì)抗原進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑵浼尤刖郾揭蚁┑姆磻?yīng)孔中，加蓋處理后，在溫度4 ℃的條件下放置24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液(pH值為7.4，0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測(cè)標(biāo)本0.1 mL，并加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照標(biāo)本，在溫度為42 ℃的條件下放置60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入IL-4、hs-CRP、TNF-α抗體0.1 mL，再次放置60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L Na2HPO4，0.05 mol/L枸櫞酸)混勻，且加入0.1 mL鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 mL放置各孔內(nèi)，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值，分析IL-4、hs-CRP、TNF-α水平。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡 將待測(cè)標(biāo)本接種于6孔板上，每濃度設(shè)置3復(fù)孔，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后使用不同濃度丹參酮提取物溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，2 d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗后使用胰蛋白酶進(jìn)行消化，2 000 r/min離心機(jī)離心處理5 min后進(jìn)行清洗，添加Annexin-V、PI染色，60 min之內(nèi)檢測(cè)。

1.2.6 Western blotting法檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase3相對(duì)表達(dá)量 使用PBS緩沖液對(duì)標(biāo)本沖洗之后裂解30 min，測(cè)定蛋白濃度。取每孔20 μg蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后進(jìn)行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋?zhuān)跤? d，取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對(duì)Bcl-2、Bax、caspase-3相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腦組織HE染色 模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列較為雜亂，細(xì)胞脫落、壞死現(xiàn)象較為嚴(yán)重；低劑量組、高劑量組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞脫落、壞死現(xiàn)象得到明顯緩解，高劑量組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯上升，且排列較整齊(見(jiàn)圖1)。

2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力對(duì)比 模型組逃避潛伏期長(zhǎng)于正常組(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)低于正常組(P<0.01)；高劑量組大鼠逃避潛伏期低于模型組和低劑量組(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)多于模型組和低劑量組(P<0.01和P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.3 各組大鼠hs-CRP、TNF-α、IL-4水平比較 hs-CRP、TNF-α、IL-4水平在4組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，4組之間3個(gè)指標(biāo)的水平由高到低的排序依次均為：模型組、高劑量組、低劑量組和正常組(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠hs-CRP、TNF-α、IL-4水平比較

2.4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較 不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率在4組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在4組之間不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率由高到低的排序依次均為：模型組、低劑量組、高劑量組和正常組(P<0.01)(見(jiàn)表3、圖2)。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較

2.5 各組大鼠Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)比較 Bcl-2、Bax與caspase-3的表達(dá)量在4組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Bcl-2的表達(dá)量在4組之間由高到低的排序依次為：正常組、高劑量組、低劑量組和模型組(P<0.01)；Bax與caspase-3的表達(dá)量在4組之間由高到低的排序依次均為：模型組、低劑量組、高劑量組和正常組(P<0.01)(見(jiàn)表4)。

表4 凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3相對(duì)表達(dá)量對(duì)比

3 討論

阿爾茲海默病癥狀的發(fā)生發(fā)展會(huì)對(duì)機(jī)體記憶能力、認(rèn)知功能造成嚴(yán)重的影響[6]。王穎等[7]在研究中建立阿爾茲海默病大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展會(huì)對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力造成嚴(yán)重的影響。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，阿爾茲海默病模型大鼠逃避潛伏期較長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)較少，說(shuō)明阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力，與上述研究結(jié)論保持一致。使用丹參酮提取物進(jìn)行干預(yù)后，阿爾茲海默病模型大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯上升，說(shuō)明使用丹參酮提取物對(duì)阿爾茲海默病模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠減輕其神經(jīng)功能受損程度，提升學(xué)習(xí)記憶能力。

阿爾茲海默病癥狀的發(fā)生發(fā)展通常伴隨著機(jī)體腦組織炎癥反應(yīng)[8-9]。hs-CRP、TNF-α、IL-4是臨床較為常用的評(píng)價(jià)機(jī)體炎癥反應(yīng)的指標(biāo)。hs-CRP是一種主要由肝臟組織合成的C反應(yīng)蛋白，是一種廣譜的機(jī)體炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物[10-11]；TNF-α一種多功能炎癥細(xì)胞因子，能夠刺激IL-6、IL-8等因子的生成，從而使機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)[12-13]；IL-4能夠刺激肥大細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14-15]。王錫麟等[16]在研究表明，腦組織炎癥反應(yīng)與阿爾茲海默病癥狀的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制炎癥反應(yīng)是治療阿爾茲海默病的關(guān)鍵。本文研究結(jié)果顯示，使用丹參酮提取物對(duì)阿爾茲海默病模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，hs-CRP、TNF-α、IL-4水平出現(xiàn)明顯的下降，說(shuō)明丹參酮提取物能夠下調(diào)炎癥因子hs-CRP、TNF-α、IL-4水平，從而發(fā)揮抑制大鼠腦組織炎癥反應(yīng)的作用，從而發(fā)揮干預(yù)效果。

阿爾茲海默病癥狀的發(fā)生發(fā)展、機(jī)體神經(jīng)功能受損嚴(yán)重程度與腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況具有密切聯(lián)系[17]。田強(qiáng)等[18]在研究中建立阿爾茲海默病大鼠模型，并對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著阿爾茲海默病的發(fā)展，出現(xiàn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況。本研究顯示，阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展伴隨著神經(jīng)細(xì)胞凋亡，使用丹參酮提取物對(duì)阿爾茲海默病模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率明顯下降，說(shuō)明使用丹參酮提取物進(jìn)行干預(yù)能夠抑制海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而起到神經(jīng)元保護(hù)作用。出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是丹參酮提取物對(duì)細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)起到了調(diào)控作用。

Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡情況密切相關(guān)[19-20]。本文研究中對(duì)阿爾茲海默病模型大鼠腦組織Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，使用丹參酮提取物進(jìn)行干預(yù)，Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，Bax、caspase-3表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，說(shuō)明丹參酮提取物能夠通過(guò)調(diào)控凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)而起到抑制阿爾茲海默病模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，使用丹參酮提取物對(duì)阿爾茲海默病模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠提升阿爾茲海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減輕腦組織炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3相對(duì)表達(dá)量，抑制阿爾茲海默病大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，具有一定神經(jīng)元保護(hù)作用，為阿爾茲海默病的臨床治療提供理論依據(jù)。