楊 瑞, 鄧勝松, 喻明軍, 姚日生

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230000)

以天然產(chǎn)物的母體結(jié)構(gòu)作為基本骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化是新藥或先導(dǎo)化合物的重要來源之一[1]。查爾酮是一類廣泛存在于甘草、明日葉等藥用植物中的多酚類黃酮物質(zhì)[2],其母體結(jié)構(gòu)是由α,β-不飽和酮連接兩個(gè)芳環(huán)而成[3](Chart 1),具有較大的柔性,能與多種受體結(jié)合,表現(xiàn)出廣泛的生物活性,如抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]等。此外,查爾酮還具有結(jié)構(gòu)簡單、易于合成等優(yōu)點(diǎn)[7]。然而,活性低和細(xì)胞選擇性差等缺點(diǎn)限制了其作為藥物應(yīng)用[8-11]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)用各種氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)取代查爾酮的芳環(huán),能夠有效的提高查爾酮的抗腫瘤活性[12]。例如,Mirzaei[13]等用吲哚基取代查爾酮的芳環(huán)結(jié)構(gòu)獲得了一系列吲哚查爾酮衍生物,其中化合物1(Chart 1)對癌細(xì)胞株A549具有很強(qiáng)的抑制活性(IC50=4.3 μg/mL)。Kim[14]等用吡啶取代查爾酮的芳環(huán)結(jié)構(gòu)獲得了一系列吡啶查爾酮衍生物,其中化合物2(Chart 1)對癌細(xì)胞Huh7和293T具有很強(qiáng)的抑制活性(IC50分別為8.4 μmol·L-1和8.2 μmol·L-1)。Yin等[15]用哌嗪環(huán)取代查爾酮的芳環(huán)結(jié)構(gòu)獲得了一系列哌嗪查爾酮衍生物,其中化合物3(Chart 1)對癌細(xì)胞株MCF-7、A549和B16-F10具有很強(qiáng)的抑制活性(IC50分別為0.32 μg/mL、 0.54 μg/mL和0.44 μg/mL)。但是,迄今為止仍未有查爾酮類衍生物進(jìn)入臨床研究。

氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)因其環(huán)上的氮原子可以參與生物體中氫鍵的形成, 增加藥物與受體的親和力和選擇性,近年來常被用于新型藥物的研發(fā)[16-17]。其中,苯并氮雜(Chart 2)也就是俗稱的苯并氮雜七元環(huán),它是由一個(gè)苯環(huán)和含氮的七元環(huán)稠合在一起形成的母體結(jié)構(gòu)[18],如常見的苯并[b]氮雜,1,5-苯并二氮雜等。由于其具有特殊的結(jié)構(gòu)類型和電子云分布,使得苯并氮雜結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤[19]、抗高血壓[20]、抗炎[21]等藥物的設(shè)計(jì)中,目前其骨架已被評定為藥物化學(xué)領(lǐng)域的特權(quán)結(jié)構(gòu)[22],特別是在抗腫瘤領(lǐng)域,苯并氮雜常被作為與腫瘤密切相關(guān)激酶(如PLKI、 VEGF-R2、 CDKs、 Cyclins等)抑制劑的骨架結(jié)構(gòu)(Chart 2),用于抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)[23-24]。

為了提高查爾酮的抗腫瘤活性和細(xì)胞選擇性,本文基于分子雜交的策略[25]將苯并[b]氮雜結(jié)構(gòu)引入查爾酮的母體結(jié)構(gòu)中獲得了新型的骨架結(jié)構(gòu)(Chart 3),并對新骨架結(jié)構(gòu)的B環(huán)及B環(huán)上的取代基(R)進(jìn)行修飾,用氮雜環(huán)吡啶替換B環(huán),探究氮雜環(huán)的引入對化合物生物活性的影響；B環(huán)上引入吸電子基團(tuán)[4-Cl、 4-N(CH3)2等]和供電子基團(tuán)(4-OCH3、 4-CH3等),探究電子云密度對化合物生物活性的影響,設(shè)計(jì)了12個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的苯并[b]氮雜-查爾酮雜合物(7a～7l)。以苯胺為原料,經(jīng)N-烷基化、羰基化、水解、環(huán)化和Claisen-Schmidt縮合反應(yīng)合成了這12個(gè)目標(biāo)化合物(Scheme1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR,13CNMR 和 HR-MS(ESI)表征。在化學(xué)工作的基礎(chǔ)上,采用MTT法初步評價(jià)了目標(biāo)化合物7a～7l對三種選定的人癌細(xì)胞(HGC-27, HepG2和A549)和一株人正常細(xì)胞(GES-1)的體外抗增殖活性,并進(jìn)一步探究了活性最優(yōu)化合物的抗腫瘤機(jī)制,以期獲得一種高效、低毒的新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物。

Chart 1

Scheme 1

Chart 2

Scheme 2

Chart 3

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WRX-4型顯微熔點(diǎn)儀；Bruker 600 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6,TMS為內(nèi)標(biāo))；AB SCIEX Triple TOFTM 5600型質(zhì)譜儀；Epoch型連續(xù)波長酶標(biāo)儀。

苯胺,4-溴丁酸乙酯,氯甲酸甲酯,無水三氯化鋁和氯化亞砜,國藥集團(tuán)；人胃癌細(xì)胞(HGC-27)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1),美國細(xì)胞保存中心(ATCC)；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 4-(苯基氨基)丁酸乙酯(2)的合成

將苯胺10.24 g(0.11 mol)、三乙胺45.80 mL(0.33 mol)和甲苯(33 mL)加入250 mL三口燒瓶中,加熱至100 ℃,將4-溴丁酸乙酯20.46 mL(0.143 mol)溶于甲苯(30 mL),緩慢滴加入燒瓶,滴畢(60 min),于100 ℃下攪拌6 h(TLC監(jiān)測)。反應(yīng)液過濾、減壓濃縮除溶劑得淡紅色油狀物。冰水靜置結(jié)晶,過濾,石油醚洗滌,干燥的淡紅色片狀結(jié)晶28.42 g,收率82.3%;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.24(t,J=7.2 Hz, 2H), 6.74(d,J=7.7 Hz, 2H), 6.69(t,J=6.8 Hz, 1H),5.73(s, 1H), 4.24(q,J=6.5 Hz, 2H), 3.20(d,J=6.1 Hz, 2H), 2.57(t,J=7.1 Hz, 2H), 2.02～1.95(m, 2H), 1.38～1.33(m, 3H)。

(2) 4-(N-甲氧羰基苯胺基)丁酸(4)的合成

將中間體28.42 g(0.041 mol)、碳酸鈉(Na2CO3) 5.194 g(0.049 mol)和甲苯(80 mL)加入250 mL三口燒瓶中,冷卻至0 ℃,緩慢滴加氯甲酸甲酯 4.5 mL(0.058 mol),滴畢(5min),反應(yīng)液在0 ℃下攪拌1 h(TLC監(jiān)測)。反應(yīng)完成后加水(2×100 mL)萃取,有機(jī)層減壓濃縮得棕黃色油狀液體3,加水(60 mL)、甲醇(40 mL)和氫氧化鈉(NaOH) 3.28 g(0.082 mol),在65 ℃下攪拌2.5 h(TLC監(jiān)測)。反應(yīng)液減壓濃縮除甲醇并用乙酸乙酯(2×50 mL)萃取,水層維持溫度在20 ℃以下,用5%的稀鹽酸調(diào)pH至1～2,用二氯甲烷(DCM)(2×100 mL)萃取,有機(jī)層用無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥和減壓濃縮得油狀液體,經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚)/V(二氯甲烷)=1/10]純化得黃色油狀液體45.75 g,收率68.3%;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.36(t,J=7.8 Hz, 2H), 7.27～7.21(m, 3H), 3.65(t,J=7.3 Hz, 2H), 3.55(s, 3H), 2.23(t,J=7.4 Hz, 2H), 1.73～1.64(m, 2H)。

(3) 1-甲氧羰基-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(6)的合成

將中間體45.75 g(0.024 mol)、無水DCM(50 mL)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(2 mL)加入100 mL三口燒瓶中,冷卻到0 ℃,控制溫度在0 ℃緩慢滴加二氯亞砜2.55 mL(0.036 mol),滴畢(5 min),反應(yīng)液溫度上升至10 ℃下攪拌1.5 h(TLC監(jiān)測)。反應(yīng)液減壓濃縮得油狀液體5,用DCM(25 mL)溶解,直接用于下一步反應(yīng)。

將無水DCM(120 mL)和無水三氯化鋁(AlCl3)12.79 g(0.096 mol)加入到250 mL的三口燒瓶中,加熱至35 ℃,將上一步含酰氯的DCM溶液,緩慢滴加到三口燒瓶中,滴畢(30 min),在35 ℃下攪拌3 h(TLC監(jiān)測)。冷卻至10 ℃,滴加預(yù)冷的5%稀鹽酸(80 mL),滴畢,繼續(xù)攪拌15 min,之后靜置30 min,有機(jī)層分離、無水Na2SO4干燥并減壓濃縮得粗產(chǎn)品,經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚)/V(二氯甲烷)=1/20] 純化得棕黃色液體63.09 g,收率53.8%;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.43～7.31(m, 2H), 7.27～7.22(m, 2H), 3.67～3.61(m, 2H), 3.55(d,J=6.3 Hz, 3H), 2.31(t,J=7.4 Hz, 1H), 2.22(t,J=7.4 Hz, 1H), 1.74～1.60(m, 2H)。

(4)7a～7l的合成通法

將中間體60.219g(1 mmol)、不同取代的苯甲醛(1.2 mmol)、乙醇(6 mL)和氫氧化鉀(KOH)0.11 g(2 mmol)加入50 mL單口燒瓶中,室溫下攪拌6 h(TLC監(jiān)測)。直接過濾得固體粗品,并將固體粗品用[V(石油醚)/V(二氯甲烷)=1/20]重結(jié)晶得純化的目標(biāo)化合物(7a～7l)。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-氯亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7a)： 白色固體,收率52.3%, m.p.175～177 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.70～7.64(m, 3H), 7.61～7.58(m, 2H), 7.56～7.50(m, 3H), 7.39(d,J=7.8 Hz, 1H), 3.95(s, 2H), 3.53(d,J=37.0 Hz, 3H), 2.71(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.46, 155.56, 136.79, 136.38, 133.83, 133.55, 133.47, 131.36, 129.35, 129.18, 128.94, 128.39, 52.89, 47.19, 26.02; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H16NO3Cl{[M+H]+}342.0891, found 342.0886。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-甲氧基亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7b)： 類白色固體,收率57.4%, m.p.173～175 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.68～7.62(m, 3H), 7.57(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.50(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.37(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.05(d,J=8.4 Hz, 2H), 3.96(s, 2H), 3.81(s, 3H), 3.48(s, 3H), 2.75(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.67, 160.25, 155.64, 147.33, 138.03, 136.88, 133.23, 133.07, 131.78, 129.36, 129.11, 128.38, 126.97, 114.54, 55.37, 52.90, 47.35, 39.52, 26.17; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C20H19NO4{[M+H]+}338.1387, found 338.1396。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-(叔丁基)亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7c)： 白色固體,收率53.2%, m.p.156～158 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.69～7.64(m, 3H), 7.54～7.49(m, 5H), 7.38(d,J=7.8 Hz, 1H), 3.97(s, 2H), 3.49(s, 3H), 2.74(s, 2H), 1.31(s, 9H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.62, 155.57, 152.11, 138.05, 136.67, 134.65, 133.31, 131.82, 129.61, 129.35, 129.13, 128.36, 125.78, 52.86, 47.32, 39.52, 34.57, 30.94, 26.15; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H25NO3{[M+H]+}364.1907, found 364.1912。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-(二甲氨基)亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7d)：黃色固體,收率58.6%, m.p.158～160 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.61(dd,J=18.2, 10.8 Hz, 3H), 7.49(t,J=9.5 Hz, 3H), 7.34(d,J=7.6Hz, 1H), 6.78(d,J=8.4 Hz, 2H), 3.96(s, 2H), 3.47(s, 3H), 2.99(s, 6H), 2.77(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.42, 155.62, 151.03, 138.94, 137.45, 132.79, 132.01, 129.73, 129.28, 128.94, 128.23, 121.53, 111.98, 52.81, 46.09, 39.66, 39.52, 26.39; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H22N2O3{[M+H]+}351.1703, found 351.1707。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-(甲基磺?；?亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7e)： 白色固體,收率52.7%, m.p.204～206 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.02(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.80(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.69(ddd,J=9.1, 8.4,4.8 Hz, 3H), 7.53(td,J=7.6, 0.7 Hz, 1H), 7.40(d,J=7.7 Hz, 1H), 3.96(s, 2H), 3.50(s, 3H), 3.27(s, 3H), 2.72(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.43, 155.58, 140.70, 139.88, 138.08, 136.32, 136.15, 133.70, 130.23, 129.43, 129.31, 128.48, 127.46, 127.08, 52.97, 47.19, 43.45, 39.52, 26.06; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C20H19NO5S{[M+H]+}386.1057, found 386.1692。

(E)-1-甲氧羰基-4-(3-氯亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7f)： 淡灰色固體,收率58.4%, m.p.132～135 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.72～7.65(m, 2H), 7.63(s, 1H), 7.57(s, 1H), 7.54～7.47(m, 4H), 7.39(d,J=7.8 Hz, 1H), 3.92(s, 2H), 3.50(s, 3H), 2.70(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.47, 155.61, 136.98, 136.64, 136.29, 133.63, 133.57, 130.80, 129.40, 129.28, 129.15, 128.94, 128.48, 127.79, 52.97, 47.21, 39.52, 26.07; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H16ClNO3{[M+H]+}342.0891, found 342.0864。

(E)-1-甲氧羰基-4-(吡啶-2-亞甲基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7g)： 類白色固體,收率56.5%, m.p.153～155 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.73(d,J=4.1 Hz, 1H), 7.89(td,J=7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.74～7.64(m,3H), 7.52(dd,J=13.9, 6.4 Hz, 2H), 7.43～7.34(m, 2H), 3.97(s, 2H), 3.46(s, 3H), 3.35～3.12(m, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ:195.35, 155.55, 153.91, 149.83, 138.89, 137.17, 136.10, 134.66, 133.49,129.49, 129.24, 128.27, 128.04, 123.81, 52.77, 47.05, 39.52, 26.16; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C18H16N2O3{[M+H]+}309.1234, found 309.1208。

(E)-1-甲氧羰基-4-((5-溴吡啶-2-基)亞甲基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7h)： 白色固體,收率49.7%, m.p.200～202 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.85(d,J=2.0 Hz, 1H), 8.16(dd,J=8.3, 2.3 Hz, 1H), 7.68(dd,J=18.6,7.8 Hz, 3H), 7.55～7.48(m, 2H), 7.37(d, J=7.8 Hz, 1H), 3.95(s, 2H), 3.46(s, 3H), 3.20(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 195.23, 152.65, 150.55, 139.77, 139.68, 135.94, 133.60, 133.43, 129.51, 129.46, 129.29, 128.32, 128.32, 120.41, 52.80, 46.86, 39.52, 26.20; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C18H15BrN2O3{[M+H]+}387.0339, found 387.0285。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-溴亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7i)： 白色固體,收率55.3%, m.p.185～187 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.68(t,J=9.1 Hz, 4H), 7.63(s, 1H), 7.51(dd,J=7.4, 4.9 Hz, 3H), 7.39(d,J=7.7 Hz, 1H), 3.94(s, 2H), 3.49(s, 3H), 2.70(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.46, 155.55, 136.89, 136.38, 136.14, 133.90, 133.48, 131.87, 131.59, 131.28, 129.37, 129.19, 128.40, 122.61, 52.90, 47.17, 39.52, 26.01; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H16BrNO3{[M+H]+}386.0386, found 386.0314。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-甲基亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7j)： 白色固體,收率52.2%, m.p.143～146 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.69～7.64(m, 3H), 7.50(ddd,J=22.7, 11.3, 4.4 Hz, 3H), 7.38(d,J=7.7Hz, 1H), 7.30(d,J=7.9 Hz, 2H), 3.95(s, 2H), 3.49(s, 3H), 2.73(s, 2H), 2.35(s, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.56, 155.54, 139.15, 138.16, 136.66, 134.51, 133.26, 131.77, 129.70, 129.53, 129.31, 129.09, 128.32, 52.83, 47.32, 39.52, 26.09, 20.97; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C20H19NO3{[M+H]+}322.1438, found 322.1388。

(E)-1-甲氧羰基-4-(2-甲氧基亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7k)： 白色固體,收率58.2%, m.p.173～175 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ：7.86(s, 1H), 7.67～7.63(m, 2H), 7.53～7.48(m, 1H), 7.44～7.35(m, 3H),7.11(d,J=8.3 Hz, 1H), 7.06(t,J=7.5 Hz, 1H), 3.92(s, 2H), 3.83(s, 3H), 3.50(s, 3H), 2.61(s, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ： 194.44, 157.92, 155.58, 136.94, 134.87, 134.63, 133.23, 130.96, 129.26, 129.02, 128.36, 123.33, 120.53, 111.41, 55.59, 52.88, 47.58, 39.52, 26.18; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C20H19NO4{[M+H]+}338.1387, found 338.1367。

(E)-1-甲氧羰基-4-(4-丙氧基亞芐基)-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(7l)： 類白色固體,收率53.2%, m.p.110～113 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.68～7.62(m, 3H), 7.56(d,J=8.7 Hz, 2H), 7.50(td,J=7.5, 0.7 Hz, 1H), 7.37(d,J=7.7 Hz, 1H), 7.04(d,J=8.7 Hz, 2H), 3.98(t,J=6.5 Hz, 4H), 3.48(s, 3H), 2.75(s, 2H), 1.78～1.70(m, 2H), 0.98(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 194.56, 159.66, 155.57, 137.99, 136.86, 133.13, 132.92, 131.72, 129.30, 129.04, 128.29, 126.77, 114.91, 69.11, 52.81, 47.32, 39.52, 26.14, 21.96, 10.36； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H23NO4{[M+H]+}366.1700, found 366.1676。

1.3 體外抗增殖活性評價(jià)

將待測化合物和陽性對照順鉑(cisplatin)用DMSO溶解并稀釋成所需的5種濃度(100、 20、 4.0、 0.8和0.16μmol·L-1)。取對數(shù)生長期的癌細(xì)胞(HGC-27、 A549和HepG2)和正常細(xì)胞(GES-1)以每孔5000個(gè)接種到96孔板中,孵育12 h。將不同濃度的供試化合物(100、 20、 4.0、 0.8、 0.16、 0 μmol·L-1)添加到每個(gè)孔中,并孵育48 h。將10 μL的MTT(5 mg/mL)添加到每個(gè)孔中,孵育4 h,除去培養(yǎng)基并添加DMSO(200 μL),輕輕的搖晃15 min,用酶標(biāo)儀測定490 nm波長的吸光度。計(jì)算各組對癌細(xì)胞的存活率。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism軟件中計(jì)算IC50值,所有試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次[26]。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

HGC-27細(xì)胞(每孔30萬)接種在6孔板中,孵育12 h。將不同濃度的供試化合物(5、1、 0.2、 0μmol·L-1)添加到每個(gè)孔中,并孵育24 h,收集細(xì)胞。PBS洗滌(4 ℃),然后離心(1200 r/min),去除上清液,加入Binding buffer(200 μL)、Annexin V-FITC(5 μL)和PI(10 μL)染料混合,避光孵育(25 ℃, 5 min),流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞,所有實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次[27]。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞孵育與加藥同1.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),收集細(xì)胞用預(yù)冷的70%乙醇溶液(1 mL)固定12 h(4 ℃),離心(1000 r/min, 5 min),棄去70%乙醇溶液,PBS沖洗。每管加入0.5 mL氧化丙啶染色液[氧化丙啶染色液(20×)/RNase A(50×)=50/2.5/1),重懸,避光孵育(30 min),使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期,相同條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次[28]。

1.6 蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)

HGC-27細(xì)胞(每孔100萬)接種在6孔板中,孵育12 h,將不同濃度的供試化合物(0、 0.5和1.0μmol·L-1)添加到每個(gè)孔中,并孵育48 h。收集細(xì)胞裂解(冰上),離心(12000 r/min,30 min, 4 ℃),棄去沉淀,加入蛋白上樣緩沖液(37 μL),用水浴鍋(100 ℃, 10 min)煮,變性后裂解液在SDS-PAGE中分離,并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加入一抗(抗Bax、抗Bcl-2)在4 ℃下孵育18 h,然后用二抗孵育,洗滌后檢測目標(biāo)蛋白[29]。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

合成中間體4-(苯基氨基)丁酸乙酯(2)時(shí),在堿性條件下,苯胺與4-溴丁酸乙酯易發(fā)生N-烷基化反應(yīng)(Scheme 2)。但是,由于N-單烷基化產(chǎn)物上的氨基受到相連烷基的作用,氨基活性得到了提高,常伴有雙烷基化的副產(chǎn)物產(chǎn)生,導(dǎo)致反應(yīng)收率下降,通過文獻(xiàn)調(diào)研[30-31]和實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)了最佳的反應(yīng)條件[投料比：4-溴丁酸乙酯/苯胺=1.3/1,溶劑：甲苯,縛酸劑和用量：三乙胺(3eq.), 溫度和時(shí)間：100 ℃和6 h],有效的減少了雙烷基化副產(chǎn)物的生成,使反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到了80%～85%。

合成中間體1-甲氧羰基-5-氧代-2,3,4,5-四氫-1H-苯并[b]氮雜(6)時(shí),選用了2種催化劑進(jìn)行傅克酰基化反應(yīng)。(1)以多聚磷酸(PPA)做催化劑[32],1,1,2,2-四氯乙烷做溶劑,在110 ℃下反應(yīng)6 h,可使原料直接從羧酸(4)得到中間體(6),收率為42.6%；(2)以路易斯酸AlCl3做催化劑[33],首先以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為催化劑,用價(jià)格便宜的二氯亞砜將羧酸(4)酰氯化轉(zhuǎn)化為酰氯(5),以酰氯為?；瘎r(shí),用路易斯酸AlCl3做催化劑,以無水二氯甲烷做溶劑,35 ℃下反應(yīng)3 h可獲得中間體(6),收率為53.8%。其中PPA具有粘稠性高、易吸潮且價(jià)格高等缺點(diǎn),同時(shí)在110 ℃時(shí),才能溶解在溶劑1,1,2,2-四氯乙烷中,所以反應(yīng)溫度必須維持在110 ℃左右才能維持均相體系,考慮到催化劑的價(jià)格、產(chǎn)物的收率及操作的難易程度,最終選用路易斯酸AlCl3做催化劑合成中間體6。

在合成目標(biāo)化合物(7a～7l)時(shí),選用了2種方法合成。(1)酸法[34]：以濃硫酸做催化劑,冰醋酸做溶劑,在60 ℃下反應(yīng)6 h獲得目標(biāo)化合物,收率約為40%。(2)堿法[35]：以強(qiáng)堿KOH做催化劑,乙醇做溶劑,在室溫下反應(yīng)6 h獲得目標(biāo)化合物,收率約為55%?？紤]到堿法相比于酸法具有條件溫和、操作簡單、成本低和收率高等優(yōu)點(diǎn),選擇堿法合成目標(biāo)化合物7a～7l。

2.2 體外抗增殖活性評價(jià)

采用MTT法對所合成的12個(gè)新型苯并[b]氮雜-查爾酮雜合物進(jìn)行了體外抗增殖活評價(jià)。以標(biāo)準(zhǔn)藥物順鉑做為陽性對照,評價(jià)了目標(biāo)化合物7a～7l對3種人癌細(xì)胞(HGC-27、HepG2和A549)的體外抗增殖活性,結(jié)果見表1。由表1可知,目標(biāo)化合物對HGC-27細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗增殖活性(IC50=0.78～20 μmol·L-1),對HepG2和A549細(xì)胞表現(xiàn)出中等的抗增殖活性(IC50=9.73～35 μmol·L-1)。其中化合物7b(IC50=0.80 μmol·L-1)和7d(IC50=0.78 μmol·L-1)對HGC-27細(xì)胞的抗增殖活性優(yōu)于陽性對照順鉑(IC50=7.38 μmol·L-1)。

表1 化合物7a～7l對3種癌細(xì)胞的抗增殖活性

比較化合物7a～7l對HGC-27細(xì)胞的抗增殖活性(除化合物7b外)可知,在苯并[b]氮雜-查爾酮雜合物的B環(huán)上引入吸電子基團(tuán)(增加電子云密度)會顯著提高化合物的抗增殖活性。比較化合物7a(4-Cl,IC50=4.90 μmol·L-1)與7f(3-Cl, IC50=6.30 μmol·L-1)和化合物7b(4-OCH3), IC50=0.80 μmol·L-1) 與7k(2-OCH3), IC50=12.13 μmol·L-1) 對HGC-27細(xì)胞的抗增殖活性可知,當(dāng)R取代基位于B環(huán)C-4位置有利于提高化合物的抗增殖活性。比較化合物7h(IC50=6.89 μmol·L-1)與7i(IC50=7.12 μmol·L-1) 對HGC-27細(xì)胞的抗增殖活性可知,當(dāng)用雜環(huán)吡啶替代苯并[b]氮雜-查爾酮雜合物的B環(huán)時(shí)對化合物的抗增殖活性影響不大。

選擇對HGC-27細(xì)胞具有有效抗增殖活性的化合物7b和7d,檢測其對人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1的毒性,結(jié)果見表2。由表2可知,化合物7d(IC50=22.77 μmol·L-1)對人正常細(xì)胞GES-1的毒性比化合物7b(IC50=7.40 μmol·L-1)和順鉑(IC50=9.51 μmol·L-1)弱。然而化合物7d(IC50=0.78 μmol·L-1, SI=29.19)對人胃癌細(xì)胞HGC-27的毒性比化合物7b(IC50=0.80 μmol·L-1, SI=9.25)和順鉑(IC50=7.38 μmol·L-1, SI=1.29)強(qiáng)。結(jié)果表明,化合物7d在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間具有良好的選擇性。因此,選擇化合物7d進(jìn)一步探究其抗腫瘤機(jī)制。

表2 化合物7b和7d對HGC-27細(xì)胞和GES-1細(xì)胞的抗增殖活性

2.3 化合物7d誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞術(shù)探究了化合物7d對癌細(xì)胞HGC-27的細(xì)胞凋亡影響,結(jié)果見圖1。由圖1可知,不同濃度的化合物7d處理HGC-27細(xì)胞后,早期凋亡(0.2 μmol·L-1: 14.04%; 1 μmol·L-1: 20.13%; 5 μmol·L-1: 32.89%)和晚期凋亡(0.2 μmol·L-1: 13.06%; 1 μmol·L-1: 16.69%; 5 μmol·L-1: 17.80%)的比例都明顯高于空白對照組(7.61%; 8.24%),同時(shí)隨著給藥濃度的增加,早期凋亡和晚期凋亡的比例明顯增加。結(jié)果表明,化合物7d顯著誘導(dǎo)了HGC-27細(xì)胞的凋亡,且細(xì)胞凋亡呈濃度的依賴性。

Concentration/μmol·L-1

2.4 化合物7d誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞G2/M期阻滯

采用流式細(xì)胞術(shù)探究了化合物7d對癌細(xì)胞HGC-27細(xì)胞周期分布的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可知,不同濃度的化合物7d處理HGC-27細(xì)胞后,G2/M期的細(xì)胞比例(0.2 μmol·L-1: 22.52%; 1 μmol·L-1: 67.99%; 5 μmol·L-1: 77.28%)明顯高于空白對照組(9.06%)且G0/G1期的細(xì)胞比例(0.2 μmol·L-1: 70.33%; 1 μmol·L-1: 22.00%; 5 μmol·L-1: 16.94%)明顯低于空白對照組(79.08%),同時(shí)隨著給藥濃度的增加,G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加且G0/G1期的細(xì)胞比例明顯減少。結(jié)果表明,化合物7d能以濃度依賴性的方式對HGC-27細(xì)胞在G2/M期引起明顯的細(xì)胞周期阻滯。

Concentration/μmol·L-1

2.5 化合物7d調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)

采用蛋白印跡法在蛋白水平上探究了化合物7d誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞凋亡的機(jī)制,結(jié)果見圖3。由圖3可知,不同濃度的化合物7d處理HGC-27細(xì)胞后,與對照組相比,促凋亡蛋白Bax表達(dá)量增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量減少,且二者均具有劑量的依賴性。結(jié)果表明,7d是通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞的凋亡。

圖3 7d對HGC-27細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響a

通過將苯并[b]氮雜結(jié)構(gòu)與具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物查爾酮母體結(jié)構(gòu)雜交,設(shè)計(jì)并合成了12個(gè)新型的苯并[b]氮雜-查爾酮雜合物(7a～7l)。初步的體外抗增殖活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),目標(biāo)化合物對HGC-27細(xì)胞展現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗增殖活性,尤其是化合物7d對HGC-27細(xì)胞的抗增殖活性最強(qiáng)(IC50=0.78 μmol·L-1),優(yōu)于陽性對照順鉑(IC50=7.38 μmol·L-1),同時(shí)其對正常細(xì)胞GES-1的毒性較低(IC50=22.77 μmol·L-1, SI=29.19),弱于陽性對照順鉑(IC50=9.51 μmol·L-1, SI=1.29)。進(jìn)一步抗腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),化合物7d能夠?qū)┘?xì)胞HGC-27的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,并通過增加促凋亡蛋白Bax和降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞的凋亡。以上研究獲得了一種高效、低毒的先導(dǎo)化合物7d為查爾酮衍生物類抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的骨架結(jié)構(gòu),具有進(jìn)一步開發(fā)為新型抗胃癌藥物的潛力。