黃 菲，王 海，陳堯清，吳 貴

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1中心實(shí)驗(yàn)室 2骨科，福建福州 350005

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)家族的一員[1]。人BMP2作為一種BMP分子，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨潛能，在肌肉組織中也能誘導(dǎo)骨形成[2]。此外，有報(bào)道表明BMP2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有作用[3]。然而，BMP2信號(hào)在癌癥發(fā)展中的作用尚存爭(zhēng)議。有報(bào)道表明BMP2/4信號(hào)的活化可以抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新，但增強(qiáng)癌干細(xì)胞的分化，并進(jìn)一步提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[4-5]。然而，BMP還可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[6-7]。此外，BMP信號(hào)在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中高表達(dá)可能與這些腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[8-9]。有研究表明BMP2信號(hào)的活化可通過(guò)激活髓樣抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)[10]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte，Treg)具有免疫抑制功能。在腫瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤組織中Treg細(xì)胞的活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[11]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β在誘導(dǎo)Treg的分化中具有重要作用[12]。本研究旨在明確BMP2信號(hào)是否通過(guò)增強(qiáng)MDSC分泌TGF-β誘導(dǎo)腫瘤組織Treg的分化和浸潤(rùn)，以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

材料和方法

材料抗體：抗-CD4-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC)(Biolegend公司，貨號(hào)100405)；抗CD25-別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)(Biolegend公司，貨號(hào)101909)；抗叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)(Biolegend公司，貨號(hào)126403)；抗-CD8-FITC(Biolegend公司，貨號(hào)100705)；抗CD11b-FITC(Biolegend公司，貨號(hào)101205)；抗Ly6G-PE(Biolegend公司，貨號(hào)127607)；抗Foxp3-APC(聯(lián)科生物公司，貨號(hào)70-AM0F05- 100)；抗CD- 3(Biolegend公司，貨號(hào)145- 2C11)。生長(zhǎng)因子：小鼠粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)(R&D公司，貨號(hào)415-ML- 005)，純度大于97%，其誘導(dǎo)小鼠淋巴瘤細(xì)胞增殖的半數(shù)有效劑量為5～30 pg/ml；人源重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(recombined human bone morphogenetic protein 2，rhBMP2)(R&D公司，貨號(hào)355-BM- 010)，純度大于95%，每微克包含BMP2活性分子781 U，其誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的半數(shù)有效劑量為40～200 ng/ml，人BMP2與小鼠BMP2具有很高的同源性，其氨基酸序列同源性高達(dá)95.7%，蛋白C端關(guān)鍵區(qū)域同源均為100%，完全保守，前期已經(jīng)有大量的研究在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證rhBMP2的生物學(xué)功能，并取得了理想的生物學(xué)效應(yīng)[13-15]。rhBMP2能夠成功地活化小鼠細(xì)胞的BMP2受體，并活化經(jīng)典的BMP信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[16]。因此，本文使用重組人BMP2研究小鼠的細(xì)胞及腫瘤，該方案具有合理性；白介素(interleukin，IL)- 2(派普泰克生物科技公司，貨號(hào)200- 02)，純度大于98%，每毫克包含IL- 2活性分子1×107U，其誘導(dǎo)小鼠CTLL細(xì)胞活化的半數(shù)有效劑量<0.1 ng/ml。小鼠TGF-β酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBiosciences公司，貨號(hào)85-BMS608- 4 。大鼠尾膠原蛋白Ⅰ購(gòu)自Cornin公司，貨號(hào)356236。Tris-HCl、NaCl和其他化學(xué)試劑購(gòu)自Sigma公司。

流式細(xì)胞術(shù)

MDSC細(xì)胞的分選：將ICR小鼠骨髓樣品重懸于含2%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)中，在4 ℃下用抗體將表面分子CD11b和Ly6G染色30 min后使用BD公司的BD FACS Aria Ⅲ流式分選儀進(jìn)行分選，獲得MDSC細(xì)胞。將細(xì)胞樣品重懸于含2%FBS的PBS中。

T淋巴細(xì)胞的分選：將ICR小鼠脾臟和淋巴結(jié)勻漿后重懸于含2%FBS的PBS中，裂解紅細(xì)胞，在4 ℃下用抗體將表面分子CD3染色30 min后使用BD公司的BD FACS Aria Ⅲ流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選，獲得T淋巴細(xì)胞。

Treg細(xì)胞的檢測(cè)：在4 ℃下用抗體將表面分子CD4和CD25染色30 min。然后將細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定20 min。Foxp3在通透緩沖液(PBS中0.2%皂苷和2%FBS)中于4 ℃染色1 h。使用BD公司的BD FACS C6流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果通過(guò)軟件FlowJo 7.6.1進(jìn)行分析。

細(xì)胞培養(yǎng)

MDSCs的體外培養(yǎng)和激活：收獲ICR小鼠骨髓細(xì)胞，用上述流式細(xì)胞術(shù)分選MDSC細(xì)胞。 按組添加10 ng/ml GMCSF(R&D公司，貨號(hào)415-ML- 005)[17]和20 ng/ml rhBMP2(R&D公司，355-BM- 100)，BMP2的有效濃度為10～300 ng/ml[18-20]，培養(yǎng)72 h。

Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)：收集小鼠脾臟和淋巴結(jié)，在含5%FBS的RPMI- 1640培養(yǎng)液中研磨，制成單細(xì)胞懸液。用上述流式細(xì)胞術(shù)分選T淋巴細(xì)胞。在具有20 U/ml IL- 2和5 μg/ml抗CD3的完全RPMI- 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)[21]，并按照實(shí)驗(yàn)分組加入MDSC細(xì)胞條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h。

rhBMP2膠原凝膠的制備將rhBMP2溶解在PBS中以獲得1 mg/ml的濃度。對(duì)于每種rhBMP2膠原凝膠，將7.5 μl rhBMP2溶液添加到150 μl鼠尾Ⅰ型膠原溶液(質(zhì)量/濃度：3%)中并均勻混合；對(duì)照組僅添加7.5 μl PBS。之后，再向上述鼠尾Ⅰ型膠原溶液中加入3 μl 1 mol/L NaOH，將pH值調(diào)節(jié)至7.0。含或不含rhBMP2的膠原蛋白溶液在37 ℃下保存2 h，形成膠原蛋白凝膠。

小鼠ICR小鼠50只，雌性，鼠齡4～8周，來(lái)源于吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，在福建醫(yī)科大學(xué)特定的無(wú)病原體動(dòng)物設(shè)施中飼養(yǎng)。觀察終末斷頸處死小鼠收取實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018- 039)。

小鼠皮下成瘤模型將5×105個(gè)H22細(xì)胞皮下注射到每只ICR小鼠的腹部，以建立小鼠皮下成瘤模型。待7 d后腫瘤長(zhǎng)出，將實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組，每組8只，一組為rhBMP2局部植入模型組，將rhBMP2膠原凝膠凍干后，制成rhBMP2膠原材料，埋植小鼠的臀部肌袋內(nèi)；一組為對(duì)照組，植入空白膠原凝膠。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR用TRIzol(英維杰公司)分離細(xì)胞總RNA，并用Revertra Ace試劑盒(普羅麥格公司)合成cDNA。 使用ABI公司的熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀ABI QuantStudio 5系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。 使用比較性循環(huán)數(shù)(Ct法)測(cè)量基因的mRNA表達(dá)水平。以內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)為基準(zhǔn)值，將目標(biāo)基因的表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化為相對(duì)mRNA表達(dá)水平。引物序列為：β-肌動(dòng)蛋白：正向：5’-ACCAACTGGGACGATATGGAGAAGA- 3’；反向：5’-TACGACCAGAGGCATACAGGGACAA- 3’。TGF-β：正向：5’-GGCGGTGCTCGCTTTGTA- 3’；反向：5’-TTTCT-CATAGATGGCGTTGTT- 3’。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定腫瘤組織和血清標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化：用膠原蛋白凝膠包載rhBMP2。給ICR小鼠接種H22癌細(xì)胞。在第7天，將小鼠隨機(jī)分成兩組。然后，將rhBMP2膠原蛋白凝膠植入小鼠的臀部肌袋中，而對(duì)照組僅植入空膠原蛋白凝膠。手術(shù)后14 d處死荷瘤小鼠，收獲外周血和腫瘤組織標(biāo)本。收獲小鼠腫瘤組織，將腫瘤組織置于PBS中勻漿，獲得組織懸液。采用EDTA- 3K抗凝，收獲小鼠外周血，12 000 r/min于室溫離心5 min(轉(zhuǎn)子半徑10 cm)，收獲小鼠血清。通過(guò)BCA測(cè)定將所有源自腫瘤和血清的樣品定量至蛋白濃度為10 mg/ml。 BCA試劑盒來(lái)自碧云天公司，貨號(hào)P0009。將來(lái)自腫瘤或小鼠的血清樣本進(jìn)行TGF-β酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分析。

組織免疫熒光檢測(cè)將組織包埋在石蠟中，切成3 μm的組織切片，組織切片用二甲苯脫蠟。 然后將切片用100%- 95%- 75%酒精梯度重新水化。在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中于95 ℃抗原修復(fù)15 min后，將切片用CD8-FITC抗體和Foxp3-APC抗體在4 ℃染色過(guò)夜。然后加入抗熒光淬滅劑(碧云天公司，貨號(hào)P0128)封片觀察。圖像由奧林巴斯顯微鏡BX53拍攝。

結(jié) 果

BMP2對(duì)MDSC分泌TGF-β的作用首先分選MDSC細(xì)胞(圖1)，并用GMCSF和GMCSF+BMP2誘導(dǎo)MDSC的活化，結(jié)果顯示GMCSF+BMP2誘導(dǎo)MDSC的活化組的TGF-β mRNA表達(dá)水平為GMCSF活化組的(1.409±0.237)倍，在GMCSF誘導(dǎo)活化的MDSC中加入BMP2可以促進(jìn)MDSC的TGF-β mRNA表達(dá)升高(t=3.165，P=0.0435)。GMCSF誘導(dǎo)MDSC活化組培養(yǎng)上清TGF-β蛋白水平為(46.91±3.65)pg/ml，而GMCSF+BMP2誘導(dǎo)MDSC活化組培養(yǎng)上清TGF-β蛋白水平為(141.62±13.99)pg/ml，GMCSF+BMP2組與GMCSF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.360,P=0.0002)。

MDSC：髓源抑制性細(xì)胞；FITC：異硫氰酸熒光素；PE：藻紅蛋白

BMP2增強(qiáng)MDSC分泌TGF-β對(duì)Treg細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用TGF-β處理可以顯著促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化[對(duì)照組比TGF-β組：(6.34±0.36)%比(30.63±1.21)%，q=6.973，P=0.0027]。組間比較結(jié)果顯示GMCSF+BMP2誘導(dǎo)MDSC分泌的細(xì)胞培養(yǎng)上清相較于GMCSF單獨(dú)誘導(dǎo)MDSC分泌的細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化明顯增加[GMCSF組比GMCSF-BMP2 條件培養(yǎng)基組：(20.13±3.03)%比(34.50±1.56)%，q=4.929，P=0.0413]。 TGF-β信號(hào)通路受體抑制劑SB505124處理T細(xì)胞，能抑制GMCSF+BMP2誘導(dǎo)MDSC分泌的細(xì)胞培養(yǎng)上清增強(qiáng)Treg細(xì)胞的分化[GMCSF-BMP2條件培養(yǎng)基組比 GMCSF-BMP2條件培養(yǎng)基-TGF-β抑制劑組：(34.50±1.56)%比(16.43±4.23)%，q=6.198，P=0.0076；GMCSF-BMP2 條件培養(yǎng)基-BMP2抑制劑組比 GMCSF-BMP2 條件培養(yǎng)基-TGF-β抑制劑-BMP2抑制劑組：(33.20±2.58)%比(15.27±4.02)%，q=6.153，P=0.0081]；但是BMP2信號(hào)通路受體抑制劑LDN193189處理則無(wú)此作用[GMCSF-BMP2 條件培養(yǎng)基組比GMCSF-BMP2 條件培養(yǎng)基-BMP2抑制劑組：(34.50±1.56)%比(33.20±2.58)%，q=0.4460，P=0.9999](圖2)。

載BMP2材料對(duì)荷肝癌小鼠外周血和腫瘤組織TGF-β表達(dá)水平的作用植入BMP2材料的荷肝癌小鼠外周血中TGF-β濃度為(11.33±0.97)ng/ml，而對(duì)照組荷肝癌小鼠外周血中TGF-β濃度為(6.37±2.11)ng/ml，rhBMP2膠原蛋白凝膠植入荷瘤小鼠體內(nèi)可增加小鼠外周血TGF-β水平(t=2.355，P=0.0326)。腫瘤組織中載BMP2材料植入的荷肝癌小鼠腫瘤組織TGF-β濃度為(21.40±4.90)ng/ml，而對(duì)照組荷肝癌小鼠腫瘤組織TGF-β濃度為(7.70±2.84)ng/ml，rhBMP2膠原蛋白凝膠植入荷瘤小鼠體內(nèi)可增加小鼠腫瘤組織中TGF-β水平(t=2.584，P=0.0246)。

載BMP2材料對(duì)荷肝癌小鼠腫瘤組織中Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)作用rhBMP2膠原蛋白凝膠植入荷瘤小鼠體內(nèi)可以促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)，載BMP2材料組腫瘤組織的平均質(zhì)量為(0.81±0.17)g，而對(duì)照組腫瘤組織的平均質(zhì)量為(0.20±0.06)g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.436，P=0.0032)。載BMP2材料植入組腫瘤組織中抗腫瘤的CD8+陽(yáng)性的T細(xì)胞的浸潤(rùn)百分率較對(duì)照組顯著減少[(19.31±10.08)%比(0.37±0.51)%，t=3.213，P=0.0126]，而載BMP2材料植入組腫瘤組織中Foxp3+的Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)百分率較對(duì)照組顯著增加[(0.59±0.51)%比(2.67±0.57)%，t=5.210,P=0.0032](圖3)。

討 論

rhBMP2具有強(qiáng)大的骨誘導(dǎo)性，載rhBMP2成骨材料已被廣泛應(yīng)用于臨床骨缺損的治療。盡管有報(bào)道rhBMP2在誘導(dǎo)新的骨再生方面令人滿意的結(jié)果，但rhBMP2應(yīng)用后產(chǎn)生的一些并發(fā)癥，如術(shù)后神經(jīng)根炎、異位骨形成、水腫，尤其是致癌作用等[2]，引起了人們對(duì)其安全性問(wèn)題的關(guān)注。2010年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局報(bào)告，rhBMP2的應(yīng)用可顯著增加患者癌癥的發(fā)生率[2]。既往有報(bào)道載rhBMP2成骨材料可促進(jìn)肝癌的進(jìn)展，并提出rhBMP2是通過(guò)誘導(dǎo)MDSC細(xì)胞分化的方式促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。本研究進(jìn)一步深入討論rhBMP2成骨材料促進(jìn)肝癌進(jìn)展的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)rhBMP2可誘導(dǎo)MDSC細(xì)胞分泌TGF-β，進(jìn)一步誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化。本研究不僅從免疫學(xué)角度深入探討了rhBMP2促進(jìn)肝癌進(jìn)展的機(jī)制，也為腫瘤患者慎重使用載rhBMP2成骨材料提供了依據(jù)。

有研究顯示循環(huán)中的BMP2可以促進(jìn)外周血MDSC的擴(kuò)增以及腫瘤中MDSC的浸潤(rùn)，從而促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)[10]。MDSC是腫瘤微環(huán)境的主要組成部分之一。MDSC有兩種不同類型：多形核MDSC和單核MDSC。它們?cè)诠撬柚挟a(chǎn)生并遷移到腫瘤中以調(diào)節(jié)癌癥的免疫反應(yīng)[22]。它們具有免疫抑制活性可以導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[23]。有報(bào)道MDSC通過(guò)產(chǎn)生活性氧[24]、IL- 10[25]、TGF-β[26]誘導(dǎo)癌癥中的T細(xì)胞功能障礙。還有研究報(bào)道MDSC通過(guò)IL- 6增強(qiáng)腫瘤進(jìn)展[27-28]，活化的MDSC可以通過(guò)分泌IL- 6、IL- 8和IL- 10促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[29-30]。既往研究顯示，BMP2信號(hào)激活了MDSC分泌IL- 6，從而進(jìn)一步增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖[10]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BMP2信號(hào)激活了MDSC分泌TGF-β，并促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化。由于Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用，其活化能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)[31]。因此，本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善了BMP2信號(hào)通路可能通過(guò)誘導(dǎo)MDSC活化促進(jìn)腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)的機(jī)制。

BMP2：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；Treg：調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；Foxp3：抗叉頭轉(zhuǎn)錄因子；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；GMCSF：小鼠粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子

A.NS；B.BMP2

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β在誘導(dǎo)Treg的分化中具有重要作用[12]。TGF-β是誘導(dǎo)Treg細(xì)胞活化的經(jīng)典細(xì)胞因子，TGF-β信號(hào)通路的活化在Treg細(xì)胞形成早期即可發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。TGF-β信號(hào)通路既可以通過(guò)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的活化，也可以獨(dú)立于Foxp3發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[32]。既往研究表明TGF-β可以通過(guò)活化Treg促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[33]。阻斷TGF-β信號(hào)活化可以通過(guò)抑制Treg細(xì)胞的功能起到抗腫瘤的作用[34]。此外，Moo-Young等[35]研究表明，腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞膜表達(dá)的TGF-β受體可以受到胰腺癌細(xì)胞分泌的腫瘤源性TGF-β的刺激，從而調(diào)節(jié)腫瘤的免疫耐受。然而，BMP2作為TGF-β超家族的一員，既往研究表明BMP2不能直接誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化，然而它可以協(xié)同TGF-β誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化[36]。本研究表明GMCSF+BMP2處理的MDSC細(xì)胞培養(yǎng)上清可以促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，并且該促進(jìn)作用可以被TGF-β抑制劑阻斷，而BMP2阻斷劑對(duì)此作用無(wú)影響，表明BMP2信號(hào)可以單獨(dú)活化MDSC并分泌TGF-β，從而間接促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化。本研究驗(yàn)證了BMP2調(diào)控Treg細(xì)胞活化以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，對(duì)完善BMP2信號(hào)通路的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及BMP2信號(hào)通路在腫瘤微環(huán)境中的作用具有一定的意義。BMP2信號(hào)通路有望成為抗腫瘤治療的藥物靶點(diǎn)。同時(shí)，由于載BMP2植骨材料在骨缺損治療中的應(yīng)用[2]，揭示BMP2促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，對(duì)于載BMP2植骨材料的安全性評(píng)價(jià)具有警示作用。