寇美玲，楊佳萍，謝佳芮，苗海生

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224；2.施甸縣畜牧獸醫(yī)中心，云南施甸 678200）

藍(lán)舌病（bluetongue，BT）是由藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV）引起的一種通過(guò)吸血庫(kù)蠓傳播的蟲(chóng)媒病毒病，牛、羊等反芻動(dòng)物對(duì)其易感，目前尚無(wú)有效的治療方法[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)將其歸為一類(lèi)動(dòng)物疫病。該病可以引起感染動(dòng)物發(fā)熱，鼻腔和胃腸道黏膜卡他性炎癥，以及妊娠母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等，致死率為20%～30%，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)影響較大[2-3]。目前全球已報(bào)道發(fā)現(xiàn)27 種BTV 血清型。我國(guó)近年來(lái)已分離到13 種血清型BTV 毒株[4-9]。BTV 不同血清型間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)，因而會(huì)產(chǎn)生不同血清型毒株在同一區(qū)域混合流行的情況，這給BT 防控帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)[10-11]。

云南省位于我國(guó)西南邊陲，有多個(gè)縣市與老撾、越南和緬甸接壤，是通往東南亞、南亞的關(guān)口，每年有大量牛、羊等家畜通過(guò)邊境縣市進(jìn)入我國(guó)境內(nèi)。這些邊境縣市及其相鄰的南亞、東南亞國(guó)家基本屬于亞熱帶氣候，年溫差較小，降雨充沛，適于庫(kù)蠓等媒介昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖，因而易于BTV 傳播，導(dǎo)致云南省邊境地區(qū)BT 防控形勢(shì)較為嚴(yán)峻。

本研究利用BTV C-ELISA 抗體試劑盒，對(duì)2020 年從云南省邊境12 個(gè)縣市采集的3 800 份牛血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，以期了解云南省邊境地區(qū)牛群中的BT 流行情況，從而為其防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牛血清樣品由云南省12 個(gè)縣市（瑞麗、芒市、隴川、盈江、景洪、勐臘、勐海、瀾滄、江城、孟連、西盟、富寧）的動(dòng)物疫病控制機(jī)構(gòu)采集，共3 800 份。每個(gè)縣市先按采樣點(diǎn)所屬地理位置劃定采樣區(qū)域，再將區(qū)域內(nèi)的養(yǎng)殖場(chǎng)、活畜交易市場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)分別編號(hào)，根據(jù)所在地區(qū)的實(shí)際養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)數(shù)量，按比例隨機(jī)抽取養(yǎng)殖場(chǎng)3～9 個(gè)、活畜交易市場(chǎng)個(gè)1～2 個(gè)、散養(yǎng)戶(hù)1～19 個(gè)；場(chǎng)戶(hù)內(nèi)，同樣根據(jù)存欄量按比例通過(guò)頸靜脈隨機(jī)采集牛血清樣品。各縣市具體采樣信息見(jiàn)表1。采樣地點(diǎn)選擇熱帶、亞熱帶氣候，年平均降雨量較多，年均日照時(shí)間較長(zhǎng)，相對(duì)濕度大，適于媒介昆蟲(chóng)庫(kù)蠓的生長(zhǎng)和繁殖的地區(qū)。

表1 云南省12 個(gè)縣市采樣信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果 單位：個(gè)/份

1.2 主要儀器和試劑

Multiskan FC 酶標(biāo)儀，購(gòu)自Thermo 公司；脫脂奶粉，購(gòu)自BD difco 公司；BTV C-ELISA 檢測(cè)試劑盒、PBSTM（磷酸鹽緩沖液+Tween 20+脫脂奶粉），為云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；PBS 干粉、Tween 20，均購(gòu)自云南豐科生物科技有限公司。

1.3 血清抗體檢測(cè)

按照BTV C-ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。取試劑盒提供的ELISA 板，分別取10 μL 被檢血清樣品、陽(yáng)性對(duì)照、弱陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照血清加入到相應(yīng)檢測(cè)孔和對(duì)照孔中，每孔加入50 μL 100倍稀釋的競(jìng)爭(zhēng)抗體，振蕩器震蕩或輕拍微量反應(yīng)板，將反應(yīng)板中的液體充分混勻，在37 ℃溫箱里溫育30 min；取出板，倒掉孔中的液體，在吸水紙上拍干，每孔加入50 μL 1 000 倍稀釋的羊抗豚鼠HPR 酶標(biāo)二抗，充分混勻，在37 ℃溫箱里溫育40 min；取出板，洗板5～6 次拍干，加入TMB顯色液50 μL/孔，37 ℃避光溫育10 min；加入終止液50 μL/孔，ELISA 讀板儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定樣本和對(duì)照的吸光值A(chǔ)450[12]。試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔A450≤0.2，兩孔間A450差距＜0.05，兩個(gè)陰性對(duì)照孔1.0 ≤A450＜1.6，兩孔間A450差距＜0.2。判定標(biāo)準(zhǔn)：按照抑制率（PI）=（陰性對(duì)照A450平均值-樣品血清A450）/陰性對(duì)照A450平均值×100%計(jì)算，抑制率≥50%時(shí)判為抗體陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4 檢測(cè)結(jié)果分析

比較各地BTV 抗體陽(yáng)性率，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地區(qū)分布

地區(qū)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示：在12 個(gè)縣市均檢測(cè)到BTV 抗體陽(yáng)性血清，共檢出血清陽(yáng)性2 960份，總樣品抗體陽(yáng)性率為77.9%（2 960/3 800），推斷牛BTV 感染在云南省邊境地區(qū)普遍存在，感染率較高[11]。各縣市樣品抗體陽(yáng)性率有所差異，其中隴川縣最高（92.0%），孟連縣最低（48.0%），差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；瑞麗市相較于瀾滄、西盟、孟連等縣市，陽(yáng)性率較高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；勐臘縣相較于盈江、富寧、隴川、江城等縣市，陽(yáng)性率較低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；孟連縣與其他縣市比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。西盟、孟連和勐臘等縣市的采樣場(chǎng)戶(hù)中，有部分場(chǎng)戶(hù)未檢測(cè)到BTV 血清陽(yáng)性樣品，其余縣市全部檢測(cè)到BTV 血清抗體陽(yáng)性樣品。

表2 云南邊境地區(qū)12 縣市牛BTV 血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 群間分布

2.2.1 不同來(lái)源 不同來(lái)源牛統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示：本地牛和入境牛BTV 血清抗體陽(yáng)性率分別為67.9%和84.8%，差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同來(lái)源牛BTV 血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2.2 不同場(chǎng)戶(hù)類(lèi)型 不同場(chǎng)戶(hù)類(lèi)型統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示：養(yǎng)殖場(chǎng)、活畜交易市場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)BTV 血清抗體樣品陽(yáng)性率分別為78.4%、77.3%和76.8%，養(yǎng)殖場(chǎng)和活畜交易市場(chǎng)的場(chǎng)戶(hù)陽(yáng)性率均為100%，散養(yǎng)戶(hù)為89.8%，差異不明顯（P＞0.05）。

表4 不同場(chǎng)戶(hù)的BTV 抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 不同飼養(yǎng)方式 對(duì)不同飼養(yǎng)方式的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）顯示：舍飼的BTV 抗體血清陽(yáng)性率最高（81.4%），系牧飼養(yǎng)（72.2%）次之，半放牧半舍飼（62.5%）最低；舍飼與半放牧半舍飼飼養(yǎng)方式比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與系牧方式比較，差異不明顯（P＞0.05）；半放牧半舍飼與系牧方式比較，差異不明顯（P＞ 0.05）。未采集放牧牛樣品。

表5 不同飼養(yǎng)方式的BTV 抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2.4 不同品種 不同品種牛BTV 血清抗體統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表6）顯示：黃牛和水牛BTV 抗體陽(yáng)性率分別為80.0%和61.4%，存在顯著差異（P＜0.05）。

表6 不同品種牛的BTV 抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

BT 是通過(guò)媒介昆蟲(chóng)傳播的蟲(chóng)媒病毒病。1979 年我國(guó)在云南省師宗縣首次分離到BTV，隨后湖北（1983）、山西（1993）等地也報(bào)道發(fā)現(xiàn)BTV[13]。截至2017 年，我國(guó)已有11 個(gè)省份的63個(gè)市（區(qū)）檢測(cè)到BTV 抗體陽(yáng)性[14-15]。到目前為止，該病無(wú)有效治療措施。近年來(lái)BTV 新血清型不斷出現(xiàn)，這將會(huì)對(duì)我國(guó)牛羊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展與畜產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易造成極大影響，因此開(kāi)展BTV 血清學(xué)流行調(diào)查極為重要。

蟲(chóng)媒病毒病的流行主要取決于媒介昆蟲(chóng)的活動(dòng)情況，易受溫度、濕度等因素影響，具有明顯地域性和季節(jié)性。本次調(diào)查的12 個(gè)邊境縣市與老撾、越南、緬甸接壤，處于亞熱帶、熱帶地區(qū)，年平均氣溫較高，降雨量較多，適于各類(lèi)蠓蚊等媒介昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖，易于BTV 傳播，具有地域代表性。此次檢測(cè)在12 個(gè)邊境縣市均檢測(cè)到BTV 抗體陽(yáng)性血清，且樣品抗體總陽(yáng)性率達(dá)77.9%，場(chǎng)戶(hù)陽(yáng)性率為93.3%，說(shuō)明云南邊境地區(qū)存在一定的BTV 流行風(fēng)險(xiǎn)。12 個(gè)縣市BTV 抗體陽(yáng)性率存在差異，可能與采集血液樣品的時(shí)間、樣本數(shù)量及場(chǎng)戶(hù)等差異有關(guān)。12 個(gè)縣市的采樣場(chǎng)戶(hù)中，僅有西盟、孟連和勐臘縣的部分場(chǎng)戶(hù)未檢測(cè)到BTV血清陽(yáng)性樣品，其余9 個(gè)縣市采樣場(chǎng)戶(hù)中全部檢測(cè)到BTV 血清抗體陽(yáng)性樣品，推斷BTV 已在該地區(qū)定殖，因此需要持續(xù)開(kāi)展BTV 流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，入境牛血清樣品抗體陽(yáng)性率顯著高于本地牛（P＜0.05），說(shuō)明境外地區(qū)的BTV 流行可能更為嚴(yán)重，對(duì)我國(guó)本地牛群威脅較大。本次調(diào)查的結(jié)果雖然與2019 年的檢測(cè)結(jié)果[11]存在差異，但本次樣品檢測(cè)數(shù)量較多，可能更能反映來(lái)源地的流行情況。針對(duì)境外牛感染較為嚴(yán)重的情況，應(yīng)該加強(qiáng)海關(guān)檢疫及運(yùn)輸檢疫，并在鄰近地帶，避免在媒介昆蟲(chóng)活躍的時(shí)間內(nèi)放牧，加強(qiáng)防蟲(chóng)、殺蟲(chóng)措施的實(shí)施，減少媒介昆蟲(chóng)對(duì)易感動(dòng)物的侵襲。本次調(diào)查中，本地牛采樣數(shù)量相對(duì)較少，后續(xù)需要加大樣本數(shù)量，進(jìn)一步驗(yàn)證本地牛的BTV流行情況。

在散養(yǎng)戶(hù)牛血清樣品中檢測(cè)到BTV 陽(yáng)性抗體的戶(hù)數(shù)相對(duì)較少，這可能與牛的飼養(yǎng)方式有關(guān)，大部分散養(yǎng)戶(hù)采取半放牧半舍飼方式。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，舍飼方式下BTV 血清抗體陽(yáng)性率較高，而半放牧半舍飼方式下BTV 抗體陽(yáng)性率則較低，可能是由于半放牧半舍飼方式可以保證牛群運(yùn)動(dòng)充足，體質(zhì)更為健壯，對(duì)病毒抵抗力較強(qiáng)，感染相對(duì)較低。

本研究對(duì)不同品種牛的BTV 血清進(jìn)行抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黃牛較水牛BTV 抗體陽(yáng)性率高。由于水牛的樣本量相對(duì)較少，僅能反應(yīng)出本次檢測(cè)的情況，牛品種與BTV 血清學(xué)陽(yáng)性情況之間的相關(guān)性需要進(jìn)一步加大樣本量來(lái)驗(yàn)證。本次采樣根據(jù)所在地區(qū)的實(shí)際養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)及場(chǎng)戶(hù)的存欄量按比例隨機(jī)采集，并未進(jìn)行科學(xué)的采樣設(shè)計(jì)，檢測(cè)結(jié)果具有一定的局限性。后續(xù)在進(jìn)一步開(kāi)展BTV 流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，應(yīng)科學(xué)設(shè)計(jì)樣本采集的標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)云南省12 個(gè)邊境地區(qū)進(jìn)行牛BT 血清學(xué)調(diào)查，推斷BT 在云南邊境地區(qū)可能廣泛流行，需要引起動(dòng)物防疫部門(mén)和養(yǎng)殖戶(hù)的重視，應(yīng)持續(xù)開(kāi)展血清學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)對(duì)該病的防控。