溫新麗,賀玉偉,薛曉梅,吳欣,賈兆通

(青島大學,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院內分泌與代謝性疾病科；2 附屬醫(yī)院山東省代謝性疾病重點實驗室；3 代謝病研究院)

近年來痛風已經成為繼糖尿病之后的第二大代謝系統(tǒng)疾病[1]。相關調查數據顯示，痛風病人已超過8 000萬人，而且病人人數以9.7%的年增長率增加[2]。痛風的病理特征是尿酸鹽結晶沉積在關節(jié)和組織中，進而觸發(fā)免疫細胞引發(fā)炎癥反應[3]。其主要危險因素是高尿酸血癥，即血清尿酸鹽水平升高。對于大多數痛風病人來說，排泄不足是高尿酸血癥的主要原因[4]。痛風如得不到及時有效的治療可能累及腎臟，導致痛風性腎病，嚴重者出現腎功能不全等[5]。目前西醫(yī)治療可產生諸多副作用，如胃腸道反應、皮疹、肝腎功能損傷等。此外，此類藥物不能預防、阻止或逆轉痛風的進程。中藥復方和從中草藥分離出的某些化合物已被用于治療痛風，效果令人滿意[6]，并且不良反應低于西藥[7]。痛風湯是以土茯苓、萆薢、蒼術、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花組合形成基礎方，病人合并不同痛風癥狀時加減不同藥材以控制癥狀[8]。痛風湯治療痛風效果良好，無顯著毒副作用，復發(fā)率低[9]。目前尚無系統(tǒng)研究痛風湯物質基礎及其治療痛風機制的報道。本研究通過網絡藥理學方法揭示痛風湯活性成分和關鍵靶點，以探討其治療痛風的機制?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 痛風湯活性成分和對應靶點的獲取

分別以“威靈仙”、“蒼術”、“薏苡仁”、“澤瀉”、“桃仁”、“紅花”、“土茯苓”、“粉萆薢”、“蠶沙”為關鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php)[10]中，檢索獲得其化學成分；在檢索結果中限定口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為條件進行篩選。同時在中國中藥整合數據庫(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid)[11]平臺中以“地龍”為關鍵詞，檢索獲得其化學成分“蚯蚓素”。“蚯蚓素”的相應靶點通過Similarity Ensemble Approach數據庫(SEA，http://sea.bkslab.org)[12]進行預測。使用Cytoscape 3.7.1軟件構建痛風湯的“藥材-成分-靶點”網絡。

1.2 痛風相關靶點基因的獲取

在人類基因組注釋數據庫(Genecards，https://www.genecards.org)中以“gout”為關鍵詞檢索與痛風相關的靶點基因。

1.3 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡

所有的PPI網絡數據均來自STRING數據庫(https://string-db.org)的分析結果。首先將數據導入Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網絡，構建痛風湯靶點之間的PPI網絡、痛風相關靶點之間的PPI網絡、痛風湯和痛風共同涉及的關鍵通路的PPI網絡。然后用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)預測痛風湯某些成分的真實靶點。

1.4 KEGG信號通路富集分析

將痛風湯靶點和痛風相關靶點的基因名導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[13]進行KEGG信號通路富集分析，保存結果。選取滿足FDR<0.05的通路，并根據 FDR值的大小繪制氣泡圖。

1.5 分子對接

應用SwissDock(http://www.swissdock.ch)將FLT3(PDB ID:4rt7)、MAOA(PDB ID:2Z5X)分別與槲皮素、木犀草素進行分子對接；選取NOS2(PDB ID:4NOS)、PTGS2(PDB ID:5ikq)與漢黃芩素進行分子對接。對接結果通過PyMOL 1.7.0(美國Schr?dinger,LLC)展示。

2 結 果

2.1 痛風湯“藥材-成分-靶點”網絡

共從痛風湯10味藥材中篩選出痛風湯活性成分82個，活性成分對應的靶點244個。通過Cytoscape 3.7.1軟件構建的痛風湯“藥材-成分-靶點”網絡見圖1。

綠色節(jié)點()代表痛風湯的10味藥材；藍色節(jié)點()代表痛風湯中的活性成分；紅色節(jié)點()代表痛風湯活性成分對應的靶點。

2.2 痛風湯作用靶點和痛風相關靶點PPI網絡

將痛風湯作用靶點導入STRING數據庫中，獲取其PPI網絡的原始數據并保存，使用Cytoscape 3.7.1繪制PPI網絡。剔除未與網絡連接的3個作用靶點，此網絡共包含了241個節(jié)點(圖2A)。靶點與靶點的連接度越高，重要性越強，顏色越趨向于紅色，且靶點的面積較大。因此，痛風湯靶點中連接度最高的5個靶點分別為AKT1、ALB、IL-6、TP53和MAPK-3。對978個痛風相關靶點進行分析，獲得了痛風相關靶點的PPI網絡(圖2B)。該網絡減去未結合的180個作用靶點，共包含798個痛風相關靶點基因。痛風相關靶點中連接度最高的5個靶點分別為IL-6、INS、GAPDH、TNF和ALB。

A：痛風湯作用靶點PPI網絡；B：痛風相關靶點PPI網絡。靶點與靶點的連接度越高，重要性越強，顏色越趨向于紅色，且靶點的面積較大。

2.3 痛風湯和痛風涉及的細胞信號通路

通過KEGG通路富集分析找到痛風湯涉及的26個重要信號通路(圖3A)和痛風發(fā)病涉及的14個細胞信號通路(圖3B)。痛風湯靶點通路與痛風發(fā)病相關通路相互重疊的共同通路為4個，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。由于KEGG分析中Pathway in cancer的-Log10FDR值最大，因此Pathway in cancer對于痛風湯治療痛風的機制是最重要的。

A：痛風湯涉及的26個重要信號通路；B:痛風發(fā)病涉及的14個細胞信號通路。

2.4 痛風湯與痛風涉及共同細胞信號通路的PPI網絡

從Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway共4個細胞信號通路中找到痛風湯和痛風均涉及的靶點構建PPI網絡，找到各PPI網絡中的關鍵靶點(圖4)。Cytoscape分析中，靶點顏色越趨向紅色，且靶點面積越大，即被認為關鍵程度越高。因此，Pathway in cancer通路中涉及的排名前5位的最關鍵靶點分別為TP53、PTGS2、IL6、MAPK1和RELA。

靶點顏色越趨向紅色，且靶點面積越大，關鍵程度越高。

2.5 TP53及其對應藥物活性成分真實靶點的PPI網絡

痛風湯中對應TP53靶點的活性成分是土茯苓和紅花中的槲皮素(Quercetin)、紅花中的木犀草素(Luteolin)和蒼術中的漢黃芩素(Wogonin)。通過SwissTargetPrediction數據庫預測到槲皮素的59個預測靶點、木犀草素的25個預測靶點和漢黃芩素的2個預測靶點。分別利用這些化合物的真實靶點構建了與TP53的PPI網絡(圖5)，顯示出槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等痛風湯活性成分調控TP53基因的機制。

A:木犀草素真實靶點與TP53的PPI網絡；B:漢黃芩素真實靶點與TP53的PPI網絡；C:槲皮素真實靶點與TP53的PPI網絡。

2.6 分子對接

選取FLT3、MAOA分別與木犀草素、槲皮素進行分子對接，選取NOS2、PTGS2與漢黃芩素進行了分子對接，揭示了痛風湯的特定活性成分與其靶點的結合模式(圖6)。

圖6 分子對接結果

3 討 論

痛風的臨床特點為高尿酸血癥及其引發(fā)的急性炎癥[14]。中醫(yī)學認為高尿酸血癥是因濕濁、熱毒、血瘀、痰凝所致，需以祛濕通絡、泄?jié)峤舛緸橹委熢瓌t[15]。國醫(yī)大師朱良春認為濕濁瘀滯內阻，才是痛風發(fā)病的主要原因，并將其命名為“濁瘀痹”[16]。痛風湯是治療“濁瘀痹”的專病專方。因此有必要深入研究其組方規(guī)律和作用機制。

痛風湯的基礎方(土茯苓、萆薢、蒼術、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花)可促進濁毒泄化、瘀結解除。在此基礎上可加入其他藥材，做到辨證論治，個體化給藥[8]。由于中藥復方具有藥效的整體性和成分的復雜性，揭示復方中有效成分與靶點、信號途徑之間的關系，是研究中藥復方的關鍵[17]。同樣，深入理解痛風湯治療痛風的作用需要一種揭示成分-靶點-通路關系的系統(tǒng)生物學方法。中藥復方的藥理作用可能是由于多種成分作用于多個靶點，進而調控多個細胞信號途徑的過程。系統(tǒng)生物學中網絡藥理學也許能解決中藥作用機制復雜性的問題。網絡藥理學研究的目的不是確定單個候選化合物，而是全面分析復雜體系，構建復雜成分與其藥理學作用之間的網絡[18]，其整體和系統(tǒng)特征與中藥發(fā)揮作用的原理一致。

本研究中KEGG分析結果顯示，痛風湯的藥理作用涉及27個信號通路，而與痛風發(fā)病相關的關鍵通路共有14個。痛風湯藥理作用與痛風發(fā)病相關通路均涉及的共同通路為4個，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。這樣的思路與大部分中藥復方網絡藥理學研究不同。細胞信號通路包含了多種靶點，而且每個靶點被不同的化合物所影響。但是，每個信號通路所代表的生物學效應是固定的，這樣的生物學效應不會因為不同化合物靶向于通路中不同的靶點而發(fā)生改變。因此，不同化合物作用于不同的蛋白靶點時，很可能具有相同的生物學效應。只要這些蛋白靶點涉及同一信號通路即可。因此，在網絡藥理學研究過程中，可以預先忽略中藥復方的靶點與疾病相關靶點中共同靶點，分別尋找相關靶信號通路，進而得到共同信號通路。這可能是中藥復方網絡藥理學研究方法的改進。

本文研究結果還顯示，痛風湯涉及的最重要通路是Pathways in cancer，其中TP53為關鍵靶點?？捎绊慣P53的化合物分別是土茯苓和紅花中的槲皮素、紅花中的木犀草素、蒼術中的漢黃芩素。槲皮素是日常飲食中含量最豐富的類黃酮之一，它可抑制黃嘌呤氧化酶(XOD)催化的尿酸和超氧自由基的生成，可以作為預防痛風和過氧化損傷的潛在化合物[19]。木犀草素是芹菜和青椒的主要成分之一，可競爭性地抑制XOD[20]。在高尿酸血癥小鼠中，槲皮素與木犀草素的這種作用有助于增強尿酸排泄并改善高尿酸血癥引起的腎功能不全。此外，還有研究顯示，木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷還可減輕單鈉尿酸鹽晶體引起的小鼠足腫脹和炎癥，其機制可能與它們降低IL-1β和TNF-α的水平有關[21]。漢黃芩素對XOD也有較強的抑制作用[22]，其IC50=157.38 μmol/L[23]。因此有研究指出，漢黃芩素可能是治療痛風性關節(jié)炎的潛在化合物[24]。

該研究也存在一些網絡藥理學研究存在的共性問題。例如本研究中使用的痛風湯活性成分來自TCMSP數據庫，篩選標準則是根據化合物的OB和DL的大小來決定是否候選為活性成分。但是本研究中動物藥材地龍的唯一候選成分蚯蚓素，來自TCMID數據庫，沒有按照OB和DL的標準來篩選。因此，在今后的研究中需要統(tǒng)一篩選標準，且需要更多來自地龍的候選成分。另外在研究過程中還發(fā)現，許多文獻報道的活性化合物未達到數據庫的OB和DL大小標準而被從活性成分的列表中剔除。在今后的研究中需要對這部分化合物進行重新評價，納入活性成分列表進行深入發(fā)掘。未來在解決以上共性問題的基礎上，需要在細胞水平驗證活性成分-靶點、成分-通路的關系，這樣才能驗證網絡藥理學預測結果的準確性，這對于闡明痛風湯作用機制、篩選其中的活性成分具有重要意義。