宋海軍,楊族悌,劉軍,劉國磊

(1 南陽南石醫(yī)院麻醉科,河南 南陽 473000；2 河南省直第三人民醫(yī)院麻醉科)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是廣泛分布于哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的一類非神經(jīng)元細(xì)胞，在腦缺血病理過程中發(fā)揮著保護(hù)和損傷神經(jīng)元的雙重作用[1-3]。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是細(xì)胞核內(nèi)一種高度保守的非組蛋白，可作為促炎因子和預(yù)警蛋白在先天性免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[4-6]。研究證實(shí)，HMGB1在腦缺血后大量升高，且可通過促進(jìn)炎癥遞質(zhì)的釋放和調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡在腦缺血病理過程中發(fā)揮著重要作用[7]。丙泊酚是一種臨床手術(shù)過程中常見的靜脈麻醉藥，被證實(shí)可通過抑制細(xì)胞凋亡和炎癥遞質(zhì)的釋放在腦損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用[8-9]。近年研究顯示，丙泊酚可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)調(diào)控腦損傷免疫炎癥系統(tǒng)[10]，但HMGB1在丙泊酚保護(hù)腦缺血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用并不清楚。腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞糖氧剝奪再灌注模型是研究體內(nèi)腦缺血常用的細(xì)胞模型[11]，本研究從細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)角度出發(fā)，首次探討HMGB1在丙泊酚保護(hù)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用，以期為闡明丙泊酚保護(hù)腦損傷的分子機(jī)制提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)新生Wistar大鼠(體質(zhì)量12～15 g)購于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液和DMEM無糖培養(yǎng)液購于美國Gibco公司。丙泊酚購于美國Sigma公司。兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體均購于美國CST公司，兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved caspase-3)抗體和HMGB1抗體購于美國Abcam公司。噻唑藍(lán)(MTT)試劑和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購于美國Pierce公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ECL試劑盒及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和HMGB1的ELISA試劑盒購于上海碧云天公司。pcDNA3.1-HMGB1過表達(dá)載體質(zhì)粒購于BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與處理 將新生大鼠處死分離出大腦皮質(zhì)后，剝離腦膜和血管等結(jié)構(gòu)，將獲得的星形膠質(zhì)細(xì)胞參照文獻(xiàn)方法[12]檢測(cè)純化培養(yǎng)后以每孔3×105個(gè)細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞板上。實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、模型+丙泊酚組(C組)、模型+丙泊酚+空載體組(D組)和模型+丙泊酚+HMGB1組(E組)。其中后4組行糖氧剝奪再灌注處理：棄原培養(yǎng)液后，加入無糖DMEM培養(yǎng)液，放入低氧(含體積分?jǐn)?shù)0.02的O2)培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)6 h(即糖氧剝奪處理)；后3組給藥處理：加入含10 μmol/L丙泊酚的無糖DMEM培養(yǎng)液。糖氧剝奪處理6 h后，從低氧培養(yǎng)箱中取出并棄無糖培養(yǎng)液，加入含10 μmol/L丙泊酚的含糖培養(yǎng)液并培養(yǎng)24 h，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h(即再灌注處理)。模型+丙泊酚+空載體組：在糖氧剝奪處理前，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟加入pcDNA3.1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。模型+丙泊酚+HMGB1組：在糖氧剝奪處理前，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟加入pcDNA3.1-HMGB1過表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGB1過表達(dá)載體質(zhì)粒的陰性對(duì)照，以排除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞，按照每孔105個(gè)細(xì)胞密度種植于96孔細(xì)胞板上，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL孵育4 h。再以200 μL二甲基亞砜孵育20 min使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在490 nm波長處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞，參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書步驟，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-6和TNF-α含量 收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-6和TNF-α含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5比色法檢測(cè)細(xì)胞LDH漏出率 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)LDH試劑盒說明書步驟分別檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)的LDH活性。LDH漏出率=培養(yǎng)液中LDH活性/(細(xì)胞內(nèi)LDH活性+培養(yǎng)液中LDH活性)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá) 在冰上向收集到的各組細(xì)胞中加入RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以BCA定量法檢測(cè)蛋白的濃度。在SDS-RIPA凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜置于含50 g/L脫脂奶粉的TBST液中處理1 h后，加入使用TBST稀釋的HMGB1抗體(1∶1 000)、Bax抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、Cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000)于4 ℃下結(jié)合反應(yīng)24 h，再以TBST稀釋的二抗(1∶2 000，辣根過氧化酶標(biāo)記)室溫孵育1.5 h。蛋白條帶在Quantity One軟件中進(jìn)行半定量分析，以β-actin為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中的HMGB1蛋白表達(dá)和上清液中HMGB1、IL-1β及TNF-α含量比較

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量均顯著升高(F=171.199～391.008，q=28.058～49.269，P均<0.01)；與模型組相比，模型+丙泊酚組細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達(dá)水平以及HMGB1、IL-1β和TNF-α的含量均顯著降低(q=22.531～35.032，P<0.01)；與模型+丙泊酚組比較，模型+丙泊酚+HMGB1組細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達(dá)水平以及HMGB1、IL-1β和TNF-α的含量均顯著升高(q=14.811～23.987，P均<0.01)，而模型+丙泊酚+空載體組中則沒有見顯著改變(P>0.05)。見圖1和表1。

A：對(duì)照組，B：模型組，C：模型+丙泊酚組，D：模型+丙泊酚+空載體組，E：模型+丙泊酚+HMGB1組。

表1 各組細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)及上清液HMGB1、IL-1β和TNF-α含量比較

2.2 各組細(xì)胞存活率和LDH漏出率的比較

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著降低，而LDH漏出率顯著升高(F=167.790、349.324，q=33.505、47.940，P均<0.01)；與模型組相比，模型+丙泊酚組細(xì)胞存活率顯著升高，而LDH漏出率顯著降低(q=21.751、24.714，P均<0.01)；與模型+丙泊酚組相比較，模型+丙泊酚+空載體組細(xì)胞存活率和LDH漏出率均未見顯著改變(P>0.05)，但模型+丙泊酚+HMGB1組細(xì)胞存活率顯著降低，而LDH漏出率顯著升高(q=13.038、17.792，P<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞存活率和LDH漏出率的比較

2.3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

對(duì)照組、模型組、模型+丙泊酚組、模型+丙泊酚+空載體組和模型+丙泊酚+HMGB1組的細(xì)胞凋亡率分別為(2.16±1.02)%、(32.25±2.36)%、(13.58±1.12)%、(12.16±1.05)%和(23.85±1.37)%，多組間比較差異有顯著性(F=184.887，P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(q=35.390，P<0.05)；與模型組比較，模型+丙泊酚組細(xì)胞凋亡率顯著降低(q=21.958，P<0.05)；與模型+丙泊酚組相比較，模型+丙泊酚+HMGB1組凋亡率顯著升高(q=12.079，P<0.05)，而模型+丙泊酚+空載體組凋亡率未見顯著改變(P>0.05)。見圖2。

A：對(duì)照組，B：模型組，C：模型+丙泊酚組，D：模型+丙泊酚+空載體組，E：模型+丙泊酚+HMGB1組。

2.4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的比較

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高(F=81.619～165.223，q=24.398～33.331，P均<0.05)；與模型組相比，模型+丙泊酚組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低(q=11.711～18.974，P均<0.05)；與模型+丙泊酚組相比，模型+丙泊酚+HMGB1組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高(q=5.885～13.703，P均<0.01)；但是，模型+丙泊酚+空載體組與模型+丙泊酚組相比較，細(xì)胞Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)。見圖3和表3。

A：對(duì)照組，B：模型組，C：模型+丙泊酚組，D：模型+丙泊酚+空載體組，E：模型+丙泊酚+HMGB1組。

表3 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)比較

3 討 論

HMGB1通常位于細(xì)胞核內(nèi)，可被主動(dòng)或被動(dòng)釋放到胞外，而胞外的HMGB1可通過與許多因子或受體作用，影響核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活性，進(jìn)而在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[13]。HMGB1可加重缺血損傷，而靶向抑制HMGB1被認(rèn)為是臨床預(yù)防腦缺血損傷的重要策略[14-15]。本研究在構(gòu)建的糖氧剝奪再灌注損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中顯示，HMGB1表達(dá)升高；同時(shí)，促炎因子IL-1β和TNF-α表達(dá)升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，促凋亡蛋白Bax和凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。李滿等[12]研究指出，糖氧剝奪/復(fù)氧后釋放的HMGB1可通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和凋亡。本研究結(jié)果與其類似，提示HMGB1在糖氧剝奪再灌注損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。

丙泊酚在抗炎和保護(hù)腦組織損傷方面發(fā)揮著重要作用[16-17]。劉波等[18]研究顯示，低劑量的丙泊酚可通過抑制炎癥反應(yīng)改善腦缺血再灌注損傷。顧新宇等[19]研究證實(shí)，丙泊酚可激活ERK信號(hào)通路提高原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力，在丙泊酚鎮(zhèn)靜過程中維持腦穩(wěn)態(tài)。陸瑜等[20]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過抑制miR-181a并增強(qiáng)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)對(duì)乏糖培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果也表明，丙泊酚對(duì)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性降低、炎癥反應(yīng)加重和細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)等現(xiàn)象均有明顯改善作用。同時(shí)，丙泊酚還可引起HMGB1表達(dá)降低。而WANG等[21]研究表明，丙泊酚可通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)和釋放在膿毒癥病人中起保護(hù)作用。張明曉等[10]研究證實(shí)，丙泊酚可通過激活p38 MAPK信號(hào)通路抑制TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)，影響腦損傷晚期炎癥反應(yīng)。提示HMGB1在丙泊酚保護(hù)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著重要作用。為了證實(shí)這一推測(cè)，本研究通過上調(diào)HMGB1蛋白的表達(dá)顯示，丙泊酚對(duì)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用明顯逆轉(zhuǎn)。說明丙泊酚可能通過下調(diào)HMGB1發(fā)揮保護(hù)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

綜上所述，丙泊酚可以通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)改善糖氧剝奪再灌注損傷，而HMGB1表達(dá)下調(diào)是該保護(hù)過程的重要機(jī)制。該結(jié)果進(jìn)一步豐富了丙泊酚保護(hù)腦缺血損傷的分子機(jī)制，但丙泊酚是如何從通路分子水平抑制HMGB1表達(dá)還有待進(jìn)一步深入研究。