史東靈，解天慧，石慧

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

噬菌體(phage)是感染細(xì)菌的病毒，能特異性的感染和殺死宿主菌[1-2]。近年來噬菌體作為抗生素的代替劑得到了廣泛關(guān)注。與抗生素相比，噬菌體具有很多優(yōu)勢?？股乜梢猿掷m(xù)存在于土壤和其他環(huán)境中，從而增加細(xì)菌耐藥性進(jìn)一步發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3]。噬菌體在沒有宿主菌的情況下不會(huì)在環(huán)境中持續(xù)很長時(shí)間，不會(huì)對環(huán)境造成嚴(yán)重污染[4]。而且噬菌體專門針對某一類細(xì)菌，具有特異性。

有研究表明少數(shù)噬菌體含有致病菌的毒力因子基因，并能隨噬菌體傳播[5]。另外，一些溶原性噬菌體編碼的毒力因子能將原本無害的細(xì)菌轉(zhuǎn)化為致病菌[1]。例如，與霍亂毒素相關(guān)的CTX噬菌體[6]。此外，溶原性噬菌體通過把DNA插入到宿主菌來傳播自身的DNA，也能從宿主菌中獲得并傳播基因片段，包括耐藥性基因[5]。噬菌體攜帶耐藥性基因在細(xì)菌之間的傳播，被認(rèn)為是耐藥基因傳播、擴(kuò)散或細(xì)菌獲得耐藥性基因的主要途徑之一[7-8]。內(nèi)溶酶和穿孔素作為噬菌體裂解系統(tǒng)中的功能蛋白，能很好的解決噬菌體制劑存在的這些不足和缺陷。

噬菌體內(nèi)溶酶(endolysin)是一種可以生物降解的蛋白質(zhì)[9]，具有裂解細(xì)菌的能力，能從宿主細(xì)胞內(nèi)部降解細(xì)菌細(xì)胞壁。內(nèi)溶酶的肽聚糖靶標(biāo)十分保守，是裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層的主鍵。與抗生素相比，細(xì)菌很難對內(nèi)溶酶產(chǎn)生抗性[10]。此外，內(nèi)溶酶還具有穩(wěn)定性好、作用速度快、細(xì)胞毒性低甚至沒有，以及能與現(xiàn)有抗生素協(xié)同等優(yōu)點(diǎn)，使其成為有潛力的新型抗菌物質(zhì)[11-12]。穿孔素(holin)能調(diào)控由內(nèi)溶酶介導(dǎo)的宿主細(xì)胞裂解[13]。穿孔素的2個(gè)基本作用是在細(xì)胞膜上制造小孔以釋放內(nèi)溶酶和決定感染周期的結(jié)束時(shí)間。穿孔素在宿主的細(xì)胞質(zhì)中積累，累積到特定的濃度后在細(xì)胞膜上形成小孔，使內(nèi)溶酶能夠通過細(xì)胞膜并降解肽聚糖[14-15]。與內(nèi)溶酶不同，它對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有廣譜的非特異性抗菌活性[16]。與單純的內(nèi)溶酶制劑相比，聯(lián)合使用穿孔素和內(nèi)溶酶制劑是一種有效控制革蘭氏陽性菌的方法[17]。內(nèi)溶酶和穿孔素可以直接作用于細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，不需要經(jīng)過噬菌體與細(xì)菌吸附、核酸注入和復(fù)制等過程，因此具有更高的效率[18-19]。并且這2種蛋白在保留噬菌體宿主特異性的前提下，具有比噬菌體更寬的宿主譜[20]。此外，內(nèi)溶酶和穿孔素作為蛋白質(zhì)，比噬菌體更容易被大眾接受。

在前期的工作中，本實(shí)驗(yàn)室分離得到1株大腸桿菌(Escherichiacoli)O157∶H7噬菌體EC-p9和沙門氏菌(Salmonella)噬菌體SM-p2,表達(dá)純化了EC-p9和SM-p2的內(nèi)溶酶和穿孔素(Lys 9、Hol 9和Lys 2、Hol 2)。本研究通過平板菌落計(jì)數(shù)法研究了這4種蛋白的裂解活性，評估這4種蛋白對溫度和pH的穩(wěn)定性，以及細(xì)菌是否會(huì)對這4種重組蛋白產(chǎn)生抗性。由此來對噬菌體內(nèi)溶酶和穿孔素的功能進(jìn)行評價(jià)。為更好地利用內(nèi)溶酶和穿孔素提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和噬菌體

大腸桿菌O157∶H7(NCTC 12900)和沙門氏菌(CGMCC 1.0090)分別購于英國菌種保藏中心和中國科學(xué)院微生物學(xué)研究所(北京)。單增李斯特菌(ATCC 19115)貯存在實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱。噬菌體為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的烈性大腸桿菌 O157∶H7噬菌體EC-p9和烈性沙門氏菌噬菌體SM-p2。內(nèi)溶酶和穿孔素為本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化的噬菌體EC-p9和SM-p2的內(nèi)溶酶和穿孔素Lys 9、Hol 9和Lys 2、Hol 2。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

LB肉湯、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(trypticase soy broth，TSB)、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar，TSA)、BHI肉湯和PALCAM瓊脂，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；醋酸鈉、甘氨酸、磷酸、氯化鋅、碳酸鈉、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)、NaH2PO4、鹽酸、氯化鈉、氯化鈣、氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉，Gentihold；Tris、結(jié)晶紫，索萊寶生物技術(shù)有限公司。所有試劑均為分析純，所有水均為二次蒸餾水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

YX280A型高壓滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SQP型電子天平、PB-10型pH儀，Sartorius；SW-CJ-FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Mill-Q型純水系統(tǒng)，Merck Millipore；U410型超低溫冰箱，NEW BRUNSWICK Premium；BCD-649 W型普通冰箱，青島海爾股份有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-D型恒溫?fù)u床，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；5810R型冷凍高速離心機(jī)，Eppendorf；MX-F型微型渦旋混合儀、DK-98-II型萬用電爐、DHP-9272型恒溫培養(yǎng)箱，上海瀘西分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

從-80 ℃超低溫冰箱取出大腸桿菌O157∶H7或沙門氏菌分別平板劃線于TSA板，然后37 ℃過夜培養(yǎng)。取單菌落接種于20 mL的LB肉湯或BHI肉湯中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)16 h。

1.2.2 內(nèi)溶酶和穿孔素的殺菌活性測定

1.2.2.1 殺菌活性

將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7或沙門氏菌在8 000×g離心5 min，去除上清液。用Tris-NaCl緩沖液洗滌細(xì)菌沉淀2次，然后重懸于Tris-NaCl緩沖液，用Tris-NaCl緩沖液調(diào)整重懸液使OD600為1.0。將100 μL細(xì)菌懸浮液放入96孔板中。實(shí)驗(yàn)組加入100 μL 已知濃度的親和純化的重組蛋白，其中Lys 9和Hol 9用于處理大腸桿菌O157∶H7；Lys 2和Hol 2用于處理沙門氏菌。對照組加入不含重組蛋白的緩沖液。將96孔板放置于37 ℃，每隔10 min測定細(xì)菌的菌落數(shù)，共60 min。酶的裂解活性計(jì)算入公式(1)所示：

(1)

1.2.2.2 重組蛋白的最小抑菌濃度

將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌和單增李斯特菌用培養(yǎng)基稀釋到106CFU/mL。然后用培養(yǎng)基對Lys 9、Lys 2、Hol 9和Hol 2進(jìn)行2倍比稀釋。取0.5 mL不同濃度的重組蛋白溶液分別與4.5 mL稀釋后菌液混合，加入試管。置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。以沒有肉眼可見的細(xì)菌生長的最低濃度為重組蛋白的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。用不含重組蛋白的試管作為陽性對照，菌液出現(xiàn)明顯渾濁則表明實(shí)驗(yàn)有意義。

1.2.3 重組蛋白的穩(wěn)定性

將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌在8 000×g離心5 min，用Tris-NaCl緩沖液洗滌2次并重懸于Tris-NaCl緩沖液，使OD600值為1.0，測定細(xì)菌數(shù)量為初始細(xì)菌數(shù)。Lys 9和Hol 9的穩(wěn)定性用其對大腸桿菌O157∶H7的裂解活性進(jìn)行評估；Lys 2和Hol 2則用其對沙門氏菌的裂解活性進(jìn)行評估。

為了評價(jià)不同溫度對內(nèi)溶酶和穿孔素酶活性的影響，將蛋白分別在4、25、37、50、60、70、80、90 ℃下處理15 min，在96孔板中加入150 μL的細(xì)胞重懸液和不同溫度下處理的50 μL終濃度為MIC的重組蛋白，將96孔板放置在37 ℃處理30 min，測定菌落數(shù)并計(jì)算酶的裂解活性。

為了評價(jià)不同pH對內(nèi)溶酶和穿孔素酶活性的影響，pH 4.2和pH 5.2的20 mmol/L醋酸鈉、pH 6.2的10 mmol/L磷酸、pH 7.2的10 mmol/L PBS、pH 8.2的20 mmol/L Tris-HCl和pH 9.2的20 mmol/L甘氨酸-NaOH代替Tris-NaCl緩沖液重懸細(xì)菌細(xì)胞。在96孔板中加入150 μL的細(xì)胞重懸液和50 μL終濃度為MIC的重組蛋白，對照組用Tris-NaCl緩沖液重懸細(xì)胞。將96孔板放置在37 ℃處理30 min，測定菌落數(shù)并計(jì)算酶的裂解活性。

1.2.4 細(xì)菌對內(nèi)溶酶和穿孔素抗性產(chǎn)生的分析

將大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌分別涂布在2個(gè)不同的TSA平板上。將10 μL Lys 9和Hol 9(濃度為MIC)滴加在含有大腸桿菌O157∶H7的TSA平板上。將10 μL Lys 2或Hol 2(濃度為MIC)滴加在含有沙門氏菌的TSA平板上。將平板在37 ℃倒置培養(yǎng)8 h，在不清晰抑菌圈的邊緣挑取菌落加入LB肉湯或BHI肉湯中在37 ℃、120 r/min培養(yǎng)8 h后，涂布在TSA平板。重復(fù)以上操作，共循環(huán)7代。并在第7代的基礎(chǔ)上挑取單菌落到LB或BHI培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)5代(不與重組蛋白作用)，分別檢測內(nèi)溶酶對每一代酶的裂解活性。

1.2.5 穿孔素對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的檢測

ONPG作為β-半乳糖苷酶的底物，可以用來檢測細(xì)菌懸液中β-半乳糖苷酶的活性，間接探究細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。將大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌在37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6，5 000×g離心10 min，棄上清液，用0.05 mol/L NaH2PO4緩沖液洗滌3次后重懸，使其OD600值約為0.2。用終濃度為2 MIC的重組蛋白進(jìn)行處理后，取5 mL菌液12 000×g離心15 min。然后將1 mL上清液與4 mL 0.05 mol/L ONPG溶液混勻，在37 ℃水浴反應(yīng)30 min。隨后加入5 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，并測量OD420值。酶活力計(jì)算如公式(2)所示：

β-半乳糖苷酶活力/(U·mL-1)=(OD420×V)/(t×Vs×0.004 5)

(2)

式中：V，反應(yīng)混合液體積，5 mL；t，反應(yīng)時(shí)間，30 min；Vs，樣品體積，5 mL；0.004 5，消光系數(shù),mL/nmoL。換算后如公式(3)所示：

β-半乳糖苷酶活力/(U·mL-1)=OD420×7.407 4

(3)

1.2.6 內(nèi)溶酶和穿孔素的聯(lián)合抑菌作用

選擇大腸桿菌O157∶H7為底物，對重組內(nèi)溶酶Lys 9、穿孔素Hol 9及其組合物的殺菌能力進(jìn)行檢測分析。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7菌液用Tris-NaCl緩沖液洗滌重懸，并調(diào)節(jié)OD600值至0.8～1.0；取450 μL菌液分別加入50 μL終濃度為2 MIC 的Lys 9或Hol 9；取450 μL菌液加入50 μL Lys 9和Hol 9的組合物，Lys 9和Hol 9的終質(zhì)量濃度分別為2.5、1.4 mg/mL，在37 ℃培養(yǎng)1 h后測定菌落數(shù)。

選擇沙門氏菌為底物，對重組內(nèi)溶酶Lys 2、穿孔素Hol 2及其組合物的殺菌能力進(jìn)行檢測分析。方法如上所述，內(nèi)溶酶Lys 2和穿孔素Hol 2組合物加入菌液后，Lys 2和Hol 2的終濃度分別為1.2 mol/mL和1.0 mg/mL。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。本研究中所得數(shù)據(jù)在Excel 2016中統(tǒng)計(jì)，所有細(xì)菌菌落數(shù)(CFU/mL)和噬菌體滴度(PFU/mL)轉(zhuǎn)化為以10為底對數(shù)，單位分別為lgCFU/mL和lgPFU/mL。使用GraphPad Prism 8.0繪制圖表，運(yùn)用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0(Duncan)進(jìn)行顯著性分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白的殺菌活性測定

利用純化后的Lys 9、Hol 9、Lys 2、Hol 2驗(yàn)證其在體外的裂解能力。結(jié)果如圖1所示，Lys 9、Hol 9、Lys 2和Hol 2的裂解活性分別在30、20、40、30 min后逐漸保持穩(wěn)定，最高的裂解活性分別為61.348%、81.120%、74.251%和83.356%。

圖1 重組蛋白的裂解活性Fig.1 Lytic activity of recombinant protein

2.2 重組蛋白的MIC

重組蛋白對大腸桿菌O157∶H7，沙門氏菌和單增李斯特菌的MIC如表1所示。4種重組蛋白MIC不同，其中Lys 9對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.25 mol/mL，對單增李斯特≥0.125 mol/mL；Hol 9對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.14 mol/mL，對單增李斯特≥0.28 mol/mL；Lys 2對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.12 mol/mL，對單增李斯特≥0.06 mol/mL；Hol 2對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.10 mol/mL，對單增李斯特≥0.20 mol/mL。Lys 9和Lys 2對單增李斯特菌的MIC小于其他2種菌，這是因?yàn)閱卧隼钏固鼐鷮儆诟锾m氏陽性菌。與革蘭氏陰性菌相比，革蘭氏陽性菌沒有細(xì)胞壁外膜的阻隔，內(nèi)溶酶更容易與細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖接觸并導(dǎo)致細(xì)菌死亡[21-22]。

表1 重組蛋白的MIC 單位：mol/mLTable 1 The MIC of recombinant protein

2.3 溫度對重組蛋白穩(wěn)定的影響

重組蛋白用不同的溫度處理后，對細(xì)菌的裂解活性如圖2所示。4種重組蛋白在70、80、90 ℃處理15 min后完全喪失裂解活性。4、25、37 ℃處理15 min后，Lys 9 和Hol 9的裂解活性沒有顯著性差異(P>0.05)；隨著處理溫度升高到50、60 ℃，Lys 9的裂解活性與4 ℃相比顯著降低了17.00%和33.67%(P<0.05)；在50 ℃處理15 min后，Hol 9的裂解活性為44.15%，與4 ℃相比降低了34.68%；在60 ℃處理15 min后，Hol 9完全喪失裂解活性。4、25 ℃處理Lys 9 和Hol 9，其裂解活性沒有顯著性差異(P>0.05)，但隨著溫度從25 ℃上升至60 ℃，Lys 9的裂解活性從70.34%降低到42.65%；Hol 2的裂解活性從80.94%降低到13.23%。上述結(jié)果表明，在4、25、37 ℃時(shí)，這4種蛋白的裂解活性穩(wěn)定；在50 ℃時(shí)，這4種蛋白未完全失活，仍然具有裂解細(xì)菌的能力。

圖2 溫度對重組蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of recombinant protein注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 pH對重組蛋白穩(wěn)定性的影響

重組蛋白在不同pH環(huán)境中的裂解活性如圖3所示。Lys 9、Hol 9和Lys 2在pH為8時(shí)，裂解活性最強(qiáng)，分別為62.62%、81.12%和80.00%，Hol 2在pH為7的環(huán)境下裂解活性最強(qiáng)為83.36%，且這4種重組蛋白的裂解活性在pH為7和8時(shí)，沒有顯著性差異(P>0.05)。Lys 9和Lys 2在pH為4～10時(shí)較為穩(wěn)定，且在pH為3時(shí)，Lys 9和lys 2依然保持裂解活性，分別為22.61%和4.47%；Hol 9和Hol 2在pH為3時(shí)完全喪失列裂解活性，且在pH為4時(shí)，裂解活性僅為1.35%和9.01%；pH ≥11時(shí)，Hol 9和 lys 2 喪失裂解活性；總的來說，這4個(gè)重組蛋白對pH有較高的穩(wěn)定性且在中性和弱堿性條件下表現(xiàn)出最高的裂解活性。

圖3 pH對重組蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of recombinant protein

2.5 細(xì)菌對重組蛋白產(chǎn)生抗性的情況

重組蛋白具有很寬的裂解譜和很強(qiáng)的殺菌能力，預(yù)示著其應(yīng)用前景十分廣泛。但宿主菌在進(jìn)化的過程中是否會(huì)對4種重組蛋白產(chǎn)生抗性，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。如圖4所示，在連續(xù)傳代12代后，每一代的細(xì)菌對4種重組蛋白的敏感性都沒有顯著降低(P>0.05)，表明在12代內(nèi)細(xì)菌不會(huì)對Lys 9、Lys 2、Hol 9和Hol 2產(chǎn)生抗性。

圖4 細(xì)菌對重組蛋白的抗性Fig.4 The bacteria resistance to recombinant proteins

2.6 穿孔素對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性檢測

穿孔素是在宿主的細(xì)胞質(zhì)膜中形成非特異性的孔或損傷，當(dāng)細(xì)胞膜受到破壞損傷時(shí)，一部分細(xì)胞內(nèi)合成β-半乳糖苷酶會(huì)泄漏到細(xì)胞外。該酶能分解ONPG，生成黃色的鄰硝基酚，然后通過溶液顏色變化檢測β-半乳糖苷酶活性。因此，細(xì)胞外β-半乳糖苷酶的酶活性可以作為一個(gè)參數(shù)用來間接評價(jià)細(xì)胞膜通透性是否發(fā)生變化。結(jié)果如圖5所示，經(jīng)Hol 9和Hol 2處理的大腸桿菌和沙門氏菌懸液中的OD600值顯著高于未處理組(P<0.05)。這表明，這兩種穿孔素處理的菌懸液中的β-半乳糖苷酶的酶活力明顯高于未處理組，β-半乳糖苷酶從胞內(nèi)流出。因此可以推斷，Hol 9和Hol 2影響了細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。

圖5 穿孔素對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of holin on membrane permeability

2.7 內(nèi)溶酶和穿孔素的聯(lián)合抑菌作用

本研究中4種重組蛋白都具有抑菌能力，見圖6。本實(shí)驗(yàn)通過平板菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)測定Lys 9和Hol 9聯(lián)合應(yīng)用對大腸桿菌的抑制作用和Lys 2和Hol 2聯(lián)合應(yīng)用對沙門氏菌的抑制作用。圖6顯示，Lys 9和Hol 9聯(lián)合應(yīng)用1 h 后，大腸桿菌的數(shù)量下降了約3 lgCFU/mL，顯著高于單獨(dú)使用Lys 9或Hol 9(P<0.05)；Lys 2和Hol 2聯(lián)合應(yīng)用1 h 后，沙門氏菌的數(shù)量下降了約4 lgCFU/mL，顯著高于單獨(dú)使用Lys 2或Hol 2(P<0.05)。這表明穿孔素和內(nèi)溶酶在抑制病原菌上表現(xiàn)出協(xié)同作用。

圖6 內(nèi)溶酶和穿孔素的聯(lián)合抑菌作用Fig.6 Bacteriostatic effect of endolysin and holing

3 結(jié)論

生化特征表明Lys 9和Lys 2具有中性或者弱堿性，因?yàn)樵谥行曰蛉鯄A性條件下，這2種蛋白活性相對較高。Lys 9、Hol 9、Lys 2和Hol 2在4 ℃時(shí)表現(xiàn)出較高的活性，然而，在60 ℃時(shí)還具有活性，表明這4種蛋白具有熱穩(wěn)定性，其在預(yù)防和治療病原細(xì)菌方面的實(shí)際應(yīng)用，具有明顯的優(yōu)勢。內(nèi)溶酶已經(jīng)應(yīng)用于控制家禽的體外或體內(nèi)革蘭氏陽性致病菌的感染；能有效去除頑固的生物被膜[23]；能控制牛奶和水果中的致病菌[24]。這4種蛋白具有廣譜的殺菌活性和很強(qiáng)的殺菌能力，使其可以作用于多種病原菌，能夠來預(yù)防食源性致病菌引起的疾病。穿孔素和內(nèi)溶酶還展現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用。細(xì)菌很難對噬菌體內(nèi)溶酶和穿孔素產(chǎn)生抗性，這主要是由于內(nèi)溶酶和穿孔素作用的細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)相對保守不容易產(chǎn)生變異。這些數(shù)據(jù)表明內(nèi)溶酶和穿孔素作為一種新型的抑菌物質(zhì)具有很大的潛力和巨大發(fā)展空間。