陳露珠,李念,裴諾,施文正,2,汪之和,2,3*
1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海),上海,201306) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306)
羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan,CMC)具有較好的安全性、成膜性、生物相容性、生物降解性和抗菌活性等特性,是一種較好的聚合物基質(zhì)[1]。為了增強CMC保鮮膜的機械強度和保鮮性能,目前關(guān)于CMC與其他成分復(fù)配制備復(fù)合膜已成為國內(nèi)外研究的熱點。ZIMET等[2]在CMC的膜液中加入乳酸鏈球菌素,所制成復(fù)合膜的理化性能和抗菌性能均得到提升。譚福能等[3]采用CMC/海藻酸鈉/納米二氧化硅復(fù)合涂膜保鮮草莓,使草莓水分有效保留并可降低其代謝。
普魯蘭多糖是出芽短梗霉利用糖發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖,又名茁霉多糖[4-5]。普魯蘭多糖具有良好的成膜性、生物相容性以及降解性,最主要的特點是其膜透氣性要低于其他的高分子合成材料。近年來其涂膜已廣泛應(yīng)用于食品保鮮[6-9]。胡云峰等[10]研究了普魯蘭多糖對雞蛋保鮮效果的影響,發(fā)現(xiàn)普魯蘭多糖水溶液能較好地在雞蛋表面形成涂膜層,阻止微生物進入和空氣接觸,減少失重,延長雞蛋的貨架期。有研究證實普魯蘭多糖在水產(chǎn)品中的保鮮應(yīng)用也有良好的效果,用普魯蘭多糖保鮮白蝦可將保鮮期延長至8~9 d[11]。因此將普魯蘭多糖和CMC進行復(fù)配,可以制備出一種可食用、環(huán)保、性能優(yōu)良的多糖復(fù)合保鮮膜。
本研究將普魯蘭多糖添加至CMC中,研究不同添加量的普魯蘭多糖對復(fù)合膜的理化性能和結(jié)構(gòu)的影響,并用制備的復(fù)合膜液對羅氏沼蝦進行涂膜保鮮,在(4±1) ℃條件下貯藏,對羅氏沼蝦進行感官評價、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)、pH值、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)值和菌落總數(shù)的測定,以研究復(fù)合膜對羅氏沼蝦的保鮮效果。本文可為CMC和普魯蘭多糖復(fù)配膜的進一步研究及其在食品中的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。
CMC(取代度≥0.95),實驗室自制;普魯蘭多糖(食品級),浙江一諾生物科技有限公司;2-TBA、三氯乙酸、氫氧化鉀、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、氧化鎂(輕質(zhì)),皆為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
新鮮羅氏沼蝦,購于上海市浦東新區(qū)南匯新城鎮(zhèn)水產(chǎn)品店,30 min內(nèi)運至實驗室。
PHS-3CpH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;H2050R高速冷凍離心機,長沙湘儀有限公司;UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司;Kjeltec2300全自動凱氏定氮儀,丹麥FOSS公司;XLW(EC)型智能電子拉力試驗機,濟南蘭光機電技術(shù)有限公司;JB-1A型磁力攪拌器,上海精密科學(xué)儀器有限公司;DZF-6050型真空干燥箱,上海慧泰儀器制造有限公司;Hitachi S-3400 N掃描電子顯微鏡,日本日立公司。
1.3.1 南極磷蝦CMC的制備
將南極磷蝦殼粉與5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HCl以1∶10(料液比,下同)比例充分混合,在室溫下反應(yīng)1 h后用蒸餾水洗滌至中性,然后按1∶10比例加入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液,在100 ℃下反應(yīng)1 h后用蒸餾水洗滌至中性,再按1∶10的比例加入45% NaOH溶液,150 ℃條件下處理5 h后用蒸餾水洗滌至中性并放置真空干燥箱(60 ℃)烘干,即得到南極磷蝦殼聚糖。以上步南極磷蝦殼聚糖質(zhì)量為準(zhǔn),加入異丙醇(料液比1∶12)溶脹1 h,按1∶10比例加入40%NaOH溶液,于30 ℃下攪拌1 h,然后再按1∶10比例加入50%(體積分?jǐn)?shù))氯乙酸-異丙醇溶液,微波處理(微波功率540 W)25 min后,再按1∶10比例加入40%NaOH溶液,在50 ℃ 條件下反應(yīng)1 h后用鹽酸溶液調(diào)pH值至7.0。離心(10 000 r/min)5 min后取上清液并加入無水乙醇靜置30 min,使CMC完全沉淀析出,最后用甲醇多次洗滌后放置真空干燥箱(60 ℃)烘干,即得到南極磷蝦CMC,取代度為0.95。
1.3.2 普魯蘭多糖-CMC(pullulan CMC,CP)復(fù)合膜的制備
在25 ℃下完全溶解CMC后,加入不同濃度的普魯蘭多糖攪拌至完全溶解;將混合膜液超聲20 min去除氣泡;利用流延法將超聲后的混合膜液(40 mL)在成膜板(17 cm×17 cm×2 cm)上于真空干燥箱中干燥成膜(50 ℃,24 h),所成膜保存于恒溫恒濕(25 ℃,53%)的干燥器中穩(wěn)定48 h,等待檢測。每種類型的薄膜至少制備3片膜。具體見表1。
表1 復(fù)合膜中普魯蘭多糖和CMC的添加量及其命名Table 1 The dosage of pullulan polysaccharide and CMC in composite membrane and its naming
1.3.3 拉伸強度與斷裂伸長率
根據(jù)VUDDANDA等[12]的方法并稍作修改,將膜裁成150 mm×15 mm的長條,設(shè)置初始上下夾片距離為50 mm,拉伸速率50 mm/min。記錄薄膜的拉伸強度和斷裂伸長率,每個樣品測定6次,取其平均值。
1.3.4 水蒸氣透過系數(shù)
取20 mL蒸餾水倒入50 mL燒杯中,用膜包覆杯口并用細(xì)皮筋進行固定,在22 ℃條件下,放入含有硅膠的干燥器中。每隔2 h稱量,稱取6次,每組膜取3個平行樣品,按照公式(1)計算水蒸氣透過系數(shù)[13]。
(1)
式中:x為膜厚,mm;S為有效面積,S=16.61×10-4m2;Δm為水分透過的質(zhì)量,g;t為間隔時間,s;ΔP為膜兩邊的壓強差,ΔP=3 167 Pa(25 ℃)
1.3.5 透光率
使用紫外可見分光光度計評估薄膜的透明度。選取光滑、平整和潔凈的膜,將膜切成矩形,緊貼在比色皿的內(nèi)側(cè)。以空皿作為空白對照,在600 nm處測定其透光率,用透光率的大小來表征復(fù)合膜透明度。透光率越高,表明膜的透明度越高。
1.3.6 傅里葉紅外光譜
采用KBr壓片法,將膜烘干剪碎后與溴化鉀混合,研磨均勻后壓片,在400~4 000 cm-1內(nèi)掃描,掃描速率為4 cm-1,掃描次數(shù)為32次。并記錄各樣品的紅外光譜。
1.3.7 掃描電鏡觀察
將膜在干燥器中干燥一段時間后,將其裁剪成5 mm×5 mm的大小,用導(dǎo)電膠將膜固定在銅板上,真空噴金處理。采用掃描電子顯微鏡觀察膜表面形態(tài)。
1.3.8 CP保鮮復(fù)合膜羅氏沼蝦的保鮮效果
選用最優(yōu)性能CP復(fù)合膜配方對羅氏沼蝦進行涂膜處理,研究復(fù)合膜對羅氏沼蝦保鮮效果的影響。
將鮮活羅氏沼蝦浸沒在冰水中致其昏死,挑選個體大小一致,蝦體完整的羅氏沼蝦,在不同膜液中浸漬10 min,處理后快速分裝于聚乙烯保鮮袋,并用封口機封口,放置在(4±1) ℃生化培養(yǎng)箱中進行保鮮實驗,每隔2 d取樣進行指標(biāo)測定。以未涂膜的羅氏沼蝦作為對照組(CK)。
1.3.8.1 感官評價
感官評定由6名有感官評定經(jīng)驗的人員組成,分值由高到低為9~0分,對羅氏沼蝦從肌肉組織、體表色澤和氣味等方面進行評分,具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。
表2 羅氏沼蝦綜合感官評分表Table 2 Sensory evaluation of Macrobrachium rosenbergii
1.3.8.2 TVB-N的測定
按照GB/T 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[14]進行測定。
1.3.8.3 肌肉pH值
稱取2.00 g樣品,加入10 mL蒸餾水,均質(zhì) 1 min 后進行冷凍離心10 min(10 000 r/min、4 ℃),過濾后取上清液進行pH值測定[15]。
1.3.8.4 TBA值測定
準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品,加入4 mL蒸餾水和5 mL三氯乙酸溶液(20%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),均質(zhì)1 min,靜置1 h 后冷凍離心10 min(8 000 r/min,4 ℃)。過濾取其上清液定容至10 mL,取其5 mL并加入5 mL TBA溶液(0.02 mol/L),迅速搖勻并置于沸水中加熱20 min后,進行流水冷卻5 min,測其吸光度A(532 nm)。用蒸餾水作空白實驗,每組樣品平行測定3次。TBA值=A×7.8,以mg/100g表示[16]。
1.3.8.5 菌落總數(shù)
按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗-菌落總數(shù)測定》[17]進行測定。
1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析
每組實驗進行3個平行,實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行計算,以SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析,在單因素方差分析(ANOVA)的基礎(chǔ)上,采用Duncan法多重比較。運用Origin 9.1繪圖。
復(fù)合膜的機械性能用抗拉強度和斷裂伸長率這2個指標(biāo)來表征。其中抗拉強度反映了膜的力學(xué)強度,而斷裂伸長率是反映膜的柔韌性的指標(biāo)[18]。圖1顯示了不同配比復(fù)合膜的抗拉強度和斷裂伸長率。
圖1 不同配比對復(fù)合膜抗拉伸強度和斷裂伸長率的影響Fig.1 The effect of different ratios on the tensile strength and elongation at break of the compositefilm注:抗拉伸強度的平均值間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),斷裂伸長率的平均值間不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)
隨著普魯蘭多糖含量的增加,復(fù)合膜的抗拉強度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。其中CP2組的抗拉強度最大,為14.36 MPa,顯著高于其他組復(fù)合膜(P<0.05),比CMC膜高98.34%。說明具有較強的抗拉強度,這為CMC中的羧基與普魯蘭多糖中的羥基之間所形成氫鍵作用所致,隨著復(fù)合膜中普魯蘭多糖比例的增加,羥基的數(shù)目也相應(yīng)增加了,從而增強了多糖分子間的氫鍵作用。CP組復(fù)合膜的斷裂伸長率均高于CMC膜,說明普魯蘭多糖的加入可以增強CMC膜的柔韌性。其中CP1,CP2和CP4組的斷裂伸長率無顯著性差異(P>0.05)。綜合考慮,CP2組的機械性能較好。
水蒸氣透過系數(shù)的大小反應(yīng)了復(fù)合膜透濕性的高低,而透濕性的高低會直接影響到對產(chǎn)品的包裝效果,透濕性越低,即水蒸氣透過系數(shù)越小,說明膜的阻水性越好,則越有利于食品的保鮮[19-20]。圖2為不同配比復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)。隨著普魯蘭多糖添加量增加,復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)先降低后增大,其中CP2組復(fù)合膜的水蒸氣透過率最小,為2.32×10-12g/(m·s·Pa),顯著低于其他組復(fù)合膜(P<0.05),且比CMC膜的水蒸氣透過系數(shù)低12.5%,說明CP2組復(fù)合膜的透濕性最低,最有利于食品保鮮。
圖2 不同配比對復(fù)合膜水蒸氣透過系數(shù)的影響Fig.2 The effect of different ratios on the water vapor transmission coefficient of composite membranes注:圖中不同復(fù)合膜配比的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)
復(fù)合膜的透光率通常是判斷共混高分子材料相容性好壞的輔助手段,若復(fù)合膜中2種多糖相容性很差,則在相界面上由于光的散射或反射而使膜的透光率降低[21]。圖3為不同配比復(fù)合膜的透光率的變化。隨著普魯蘭多糖添加量的增加,復(fù)合膜的透光率增大,并呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P<0.05),這是因為普魯蘭多糖為白色物質(zhì),CMC為淡黃色物質(zhì),普魯蘭多糖比例的增加會提高復(fù)合膜液透明度。所有復(fù)合膜的透光率均大于90%,顯著高于CMC膜,說明復(fù)合膜中2種多糖有較好的相容性。
圖3 不同配比對復(fù)合膜透光率的影響Fig.3 The influence of different ratios on the light transmittance of the composite film
紅外光譜可以反映出各組分的特征基團和相互作用,尤其是氫鍵的作用,已被廣泛地應(yīng)用于表征共混物之間的相容性。相容的共混物之間有強相互作用,其產(chǎn)生的光譜相對于各組分的光譜產(chǎn)生較大的偏差,由此體現(xiàn)物質(zhì)的相容性[22]。
圖4為不同配比復(fù)合膜的紅外光譜圖。CMC膜在3 452 cm-1處有強吸收峰,是—OH和—NH2的特征吸收峰,可以反映出—OH和—NH2分子內(nèi)和分子間氫鍵。CP1,CP2,CP3和CP4復(fù)合膜在此處也有強吸收峰,CP4膜在此處的吸收峰有明顯增強,這說明普魯蘭多糖的加入增強了—OH和—NH2分子內(nèi)和分子間氫鍵作用。CMC膜在2 830 cm-1處的吸收峰是C—H伸縮振動吸收峰,隨著普魯蘭多糖的加入,CP復(fù)合膜的吸收峰均向更高波數(shù)偏移(CP1膜為2 831 cm-1,CP2膜為2 838 cm-1,CP3膜為2 846 cm-1,CP4膜為2 902 cm-1),表明普魯蘭多糖和CMC之間存在強烈的氫鍵作用。CMC膜在1 617 cm-1處的吸收峰為羧基的不對稱振動,CP組復(fù)合膜發(fā)生了偏移。CMC膜在1 369 cm-1處的吸收峰為羧基的對稱振動,CP組復(fù)合膜的吸收峰發(fā)生偏移,可能是因為CMC中的羧基與普魯蘭多糖的羥基之間存在氫鍵作用。由于普魯蘭多糖添加量的增加,CP4組在1 391 cm-1處出現(xiàn)了1個新峰,這是因為普魯蘭多糖中C—O的伸縮振動。這些基團的變化可能導(dǎo)致復(fù)合膜的物理和化學(xué)性質(zhì)的變化。由于從紅外圖譜中證明普魯蘭多糖和CMC之間存在氫鍵作用,這可以在一定程度上說明復(fù)合膜具有比較良好的相容性。
圖4 不同配比復(fù)合膜的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of composite films with different ratios
利用掃描電鏡放大500倍觀察CMC、CP1、CP2、CP3和CP4的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖5)。純CMC膜(圖5-a)表面平滑,但呈現(xiàn)大量纖維狀物質(zhì)。隨著普魯蘭多糖的加入,膜的表面變得光滑,纖維狀物質(zhì)減少。圖5-c和圖5-d表面光滑,無纖維狀;圖5-e存在少量微纖維狀物質(zhì)。所有薄膜的表面微觀結(jié)構(gòu)不存在任何的裂隙和小孔,為均勻、光滑的表面形態(tài),無明顯相分離現(xiàn)象,表現(xiàn)出很好的相容性。
a-CMC;b-CP1;c-CP2;d-CP3;e-CP4圖5 不同配比復(fù)合膜的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrographs of composite films with different ratios
2.6.1 感官評價變化
圖6為不同處理組的羅氏沼蝦在4 ℃低溫保鮮過程中感官評分的變化。隨著保鮮時間的延長,各處理組羅氏沼蝦的感官評分逐漸降低。羅氏沼蝦在貯藏過程中產(chǎn)生的氣味和色澤黑變,是由于自身內(nèi)源酶和微生物的作用,導(dǎo)致蝦體內(nèi)的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)降解所致[23]。在0~8 d的貯藏過程中,CP2組和CMC組的感官評分始終高于CK組。這是因為膜液處理對羅氏沼蝦的保鮮起到了一定的作用。在保鮮前4 d,CMC組和CP2組的感官評分并無明顯差異(P>0.05)。在保鮮后期(6~8 d)時,CP2組的感官評分顯著高于CMC組(P<0.05)。說明CP2組的復(fù)合膜液對羅氏沼蝦的保鮮效果優(yōu)于CMC單一膜液。這主要是因為復(fù)合膜的機械性能好,水蒸氣透過系數(shù)低,能有效抑制微生物生長,降低脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)降解的速率,從而抑制羅氏沼蝦在貯藏過程中的腐敗變質(zhì),維持羅氏沼蝦的感官質(zhì)量。
圖6 羅氏沼蝦保鮮過程中感官評分的變化Fig.6 Changes in sensory scores during the preservation of Macrobrachium rosenbergii注:不同貯藏時間的不同組別間的上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)
2.6.2 TVB-N變化
TVB-N是在水產(chǎn)品貯藏過程中,由于微生物和酶的作用,蛋白質(zhì)被分解產(chǎn)生氨氣及揮發(fā)性胺類物質(zhì),是評價水產(chǎn)品新鮮程度的重要指標(biāo)之一[24]。圖7為不同處理組對羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中TVB-N的變化。隨著保鮮時間的延長,各處理組的TVB-N值均呈現(xiàn)上升趨勢,其中CK組的TVB-N值顯著高于CMC組和CP2組(P<0.05),CK組樣品TVB-N值[(20.48±0.25) mg/100g]已超過國家規(guī)定的限量值20 mg/100g。在保鮮到第8天時,CMC處理組和CP2處理組的TVB-N值分別為(21.26±0.20)和(19.92±0.31) mg/100g,比CK組延長4 d左右,這不僅因為CMC可以抑制微生物生長,從而降低羅氏沼蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)被分解的速率,還因為CP2膜的機械性能和水蒸氣透過系數(shù)優(yōu)于CMC膜,可以更有效地阻止外界空氣和水,防止外界微生物的進一步侵染繁殖。
圖7 羅氏沼蝦保鮮過程中TVB-N的變化Fig.7 Changes in TVB-N during the preservation of Macrobrachium rosenbergii
2.6.3 pH變化
圖8為不同處理組羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中pH的變化。隨著貯藏時間的延長,所有處理組的pH值呈現(xiàn)上升的趨勢。這與羅氏沼蝦在內(nèi)源酶和微生物的作用下,體內(nèi)蛋白質(zhì)被分解產(chǎn)生一系列堿性化合物有關(guān),如三甲胺,組胺,吲哚等,進而導(dǎo)致各處理組pH值的持續(xù)上升[25]。在貯藏過程中,CP2組的pH值始終低于CK組和CMC組。在貯藏到第8天時,CK組的pH值已上升至8.30,與CP2組區(qū)別顯著(P<0.05)。說明CP2組的復(fù)合膜液在貯藏過程中可以更有效地控制內(nèi)源酶和微生物的作用,抑制pH值上升,從而延長羅氏沼蝦的貯藏時間。
2.6.4 TBA值變化
圖9為不同處理組羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中TBA值的變化。隨著貯藏時間的延長,所有處理組的TBA值呈現(xiàn)上升的趨勢。TBA值越大,脂肪氧化程度越高,水產(chǎn)品腐敗程度越嚴(yán)重[26-27],因此常根據(jù)TBA值的變化來判斷水產(chǎn)品脂肪氧化程度。貯藏8 d 時,CK組的TBA值從0.26 mg MDA/100g增加到1.25 mg MDA/100g;而CMC組和CP2組分別增加到0.94和0.83 mg MDA/100g,說明CMC和CP2膜液能夠在一定程度上抑制羅氏沼蝦的脂肪氧化。其中CP2處理組的TBA值顯著低于其他處理組(P<0.05)。這是因為加入的普魯蘭多糖使復(fù)合膜液的成膜性能更好,水蒸氣透過系數(shù)更低,具有了良好的阻氧性,進而抑制蝦體的脂質(zhì)氧化,起到一定的保鮮作用。
圖9 羅氏沼蝦保鮮過程中TBA值的變化Fig.9 Changes in TBA value during the preservation of Macrobrachium rosenbergii
2.6.5 菌落總數(shù)變化
水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)主要是因為微生物的繁殖所導(dǎo)致,所以菌落總數(shù)可以作為衡量水產(chǎn)品腐敗情況的重要指標(biāo)之一[28]。圖10為不同處理組羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)的變化。隨著貯藏時間的延長,CK組的菌落總數(shù)一直呈現(xiàn)快速上升的趨勢,而CMC組和CP2組的菌落總數(shù)則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。這可能是因為在保鮮初期,羅氏沼蝦本身所攜帶的細(xì)菌受低溫和保鮮膜液的雙重抑制,生長出現(xiàn)延滯期,而后隨著貯藏時間延長,細(xì)菌逐漸適應(yīng)了環(huán)境,耐冷微生物不斷繁殖,以致菌落總數(shù)逐漸上升[29]。在貯藏8 d的過程中,CK組的菌落總數(shù)由4.81 lgCFU/g上升至5.86 lgCFU/g,CMC組和CP2組的分別上升至5.50 lgCFU/g和5.37 lgCFU/g。CP2組的菌落總數(shù)明顯低于CMC組(P<0.05),說明CP2組的復(fù)合膜液對羅氏沼蝦的抑菌效果更好,能更有效地延緩腐敗變質(zhì)。
圖10 羅氏沼蝦保鮮過程中菌落總數(shù)的變化Fig.10 Changes in the total number of colonies during the preservation of Macrobrachium rosenbergii
普魯蘭多糖和CMC復(fù)配能有效改善單一CMC膜的性能。結(jié)果顯示,加入1%普魯蘭多糖與1%CMC按1∶1復(fù)配后,復(fù)合膜的抗拉伸強度和斷裂伸長率明顯增加,水蒸氣透過系數(shù)顯著降低,透光率增高,說明能制備出性能優(yōu)良的復(fù)合膜。將復(fù)合膜應(yīng)用于羅氏沼蝦的保鮮試驗上,發(fā)現(xiàn)復(fù)合膜能顯著降低其TVB-N、pH值、TBA值和菌落總數(shù),可將羅氏沼蝦的貨架期由4 d延長至8 d,說明復(fù)合膜對羅氏沼蝦具有良好的保鮮效果。