劉 瑩，譚寅鳳，張 迎，孫 菲，許瀠月，何抒陽(yáng)，周艷秋，于 苗

(吉林市人民醫(yī)院，吉林 吉林 132001)

隨著人類(lèi)微生物組計(jì)劃的提出，腸道菌群逐漸成為微生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn).有研究[1-2]表明：腸道菌群與人類(lèi)健康及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此，腸道菌群檢測(cè)及鑒定日益受到專(zhuān)家學(xué)者們的關(guān)注.目前，腸道菌群常用的檢測(cè)方法主要包括16S rRNA基因序列分析技術(shù)、組學(xué)(宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組)、代謝組學(xué)及培養(yǎng)組學(xué)等不同檢測(cè)技術(shù).16S rRNA基因序列分析技術(shù)和宏基因組測(cè)序技術(shù)均為高通量測(cè)序技術(shù)，其能夠準(zhǔn)確地描述微生物群落，并且具有功能預(yù)測(cè)等特點(diǎn)，在科學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用.但是高通量測(cè)序技術(shù)成本昂貴，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，技術(shù)要求高，不能辨別菌的死活，不能區(qū)分同一菌種的不同菌株[3-4]，因此，臨床上開(kāi)展16S rRNA基因序列分析技術(shù)和宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)患者的腸道菌群受到限制.不同技術(shù)有不同的檢測(cè)閾值，例如宏基因組學(xué)僅能分析每克糞便含有>106數(shù)量的細(xì)菌，PCR僅能分析每克糞便含有>104數(shù)量的細(xì)菌，而培養(yǎng)組學(xué)能分析到每克糞便含有>102數(shù)量的細(xì)菌.因此，培養(yǎng)組學(xué)的研究閾值低于宏基因組學(xué)和PCR法，更加靈敏.

腸道菌群培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)具有簡(jiǎn)便、實(shí)用、成本低等優(yōu)勢(shì)，LAGIER J C等[5]率先利用培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)獲得腸道中優(yōu)勢(shì)菌群，使得腸道菌群培養(yǎng)及鑒定技術(shù)在臨床上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.但是目前關(guān)于人體腸道菌群培養(yǎng)條件的研究較少，并且尚未有利用光密度(optical density，OD)確定最佳細(xì)菌接種量的報(bào)道.本研究旨在探索一種適宜臨床應(yīng)用的腸道菌群培養(yǎng)及鑒定方法，并可獲得評(píng)估腸道菌群的相關(guān)量化指標(biāo)，為診治腸道菌群失調(diào)、指導(dǎo)抗菌藥物應(yīng)用、制定微生態(tài)調(diào)節(jié)方案等提供參考依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈(默克公司，德國(guó))；三氟乙酸(Sigma-aldrich公司，美國(guó))；IVD Bacterial Test Standard、IVD Matrix HCCA(Bruker Daltonik GmbH，德國(guó))；Gifu Anaerobic Medium(GAM，日水制藥株式會(huì)社，日本)；哥倫比亞培養(yǎng)基、沙保羅培養(yǎng)基(鄭州安圖生物工程公司)；Breathe-Easy?sealing membrane(Sigma-aldrich公司，美國(guó)).

1.2 主要儀器

Microflex LT/SH型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MADLI-TOF MS，布魯克科技有限公司，德國(guó))；BACTRONI-2型厭氧培養(yǎng)箱(SHELLAB公司，美國(guó))；Heratherm IGS100型微生物培養(yǎng)箱、371型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；Smartcountert-1型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；SYNERGY H1型多功能微孔板檢測(cè)儀(BioTek公司，美國(guó))；ULUP-IV-40L型超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的選擇及制備

厭氧菌培養(yǎng)選擇GAM(用于厭氧菌培養(yǎng)和抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的培養(yǎng)基)，準(zhǔn)確稱取9.25 g的GAM粉末于燒瓶中，并加入125 mL去離子水完全溶解，115 ℃高壓滅菌15 min，當(dāng)高壓滅菌器溫度降至90 ℃左右時(shí)，制作厭氧培養(yǎng)基平板，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)室中過(guò)夜，除氧備用[6-7].需氧菌培養(yǎng)選擇哥倫比亞培養(yǎng)基[8-9]，真菌培養(yǎng)選擇沙保羅培養(yǎng)基[9-10]，培養(yǎng)皿的直徑均為90 mm.厭氧菌[11]、需氧菌[12]、真菌[13]的培養(yǎng)溫度均為37 ℃，厭氧環(huán)境為混合氣體(90%N2，5%CO2，5%H2).

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇

選擇49種厭氧菌和20種需氧菌，對(duì)其進(jìn)行菌種生長(zhǎng)能力的監(jiān)測(cè)，制作生長(zhǎng)曲線，確定厭氧菌培養(yǎng)時(shí)間和需氧菌培養(yǎng)時(shí)間.所選菌種覆蓋人體腸道菌群的5大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，即擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和梭桿菌門(mén).所有菌種均在-80 ℃冰箱中保存.

2.2.2 厭氧菌和需氧菌培養(yǎng)時(shí)間

監(jiān)測(cè)49種厭氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和一個(gè)厭氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株混合菌、20種需氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和一個(gè)需氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株混合菌的生長(zhǎng)能力.挑取1～4個(gè)菌落置于4 mL GAM中，充分振蕩混勻，10倍稀釋?zhuān)O(shè)為3個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，每個(gè)濃度取500 μL接種到96孔培養(yǎng)板中，每塊培養(yǎng)板上設(shè)置6個(gè)陰性對(duì)照孔，培養(yǎng)板使用呼吸膜密封(Breathe-Easy?sealing membrane)，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中培養(yǎng).通過(guò)檢測(cè)光密度(OD600)監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)，總監(jiān)測(cè)時(shí)長(zhǎng)為48 h.

2.3 臨床應(yīng)用

2.3.1 臨床資料及標(biāo)本采集

選取吉林市人民醫(yī)院2019年10月—2020年3月20例健康志愿者(對(duì)照組)，腸道菌群檢測(cè)前1周內(nèi)應(yīng)用抗菌藥物治療的162例患者(實(shí)驗(yàn)組)進(jìn)行接種細(xì)菌數(shù)的研究，比較兩組人群的腸道菌群.所選研究對(duì)象均需簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò).用無(wú)菌糞便標(biāo)本采集盒中的小勺挑取自然排出的新鮮糞便的不同部位約1 g，放入無(wú)菌糞便標(biāo)本采集盒中送檢.

對(duì)照組篩選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)身體檢查無(wú)相關(guān)臨床疾病癥狀，無(wú)腸道相關(guān)疾病病史；采樣前1個(gè)月內(nèi)無(wú)腹瀉和便秘史；采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)抗菌藥物和微生態(tài)調(diào)節(jié)劑.

2.3.2 標(biāo)本接種、菌落計(jì)數(shù)及菌種鑒定

接種細(xì)菌數(shù)：稱取100～150 mg新鮮糞便標(biāo)本，加入4 mL 0.9%的無(wú)菌生理鹽水(原液)，渦旋振蕩充分混勻，用無(wú)菌生理鹽水將原液分別稀釋至OD600值為0.060、0.045和0.030進(jìn)行厭氧菌培養(yǎng)，接種量為5 μL；將原液分別稀釋至OD600值為0.070、0.050和0.030進(jìn)行需氧菌培養(yǎng)，真菌培養(yǎng)接種原液接種量為50 μL.觀察生長(zhǎng)的菌落數(shù)，菌落計(jì)數(shù)采用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器.

接種時(shí)間：稱取100～150 mg新鮮糞便標(biāo)本，加入4 mL 0.9%的無(wú)菌生理鹽水(原液)，渦旋振蕩充分混勻，用無(wú)菌生理鹽水將原液稀釋至最佳OD600值，然后將5 μL稀釋的原液接種到GAM上，分別于0、1、2、3 h時(shí)接種培養(yǎng)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中培養(yǎng).菌落計(jì)數(shù)采用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器，菌種鑒定采用MADLI-TOF MS.

菌落計(jì)數(shù)：培養(yǎng)后生長(zhǎng)的菌落均采用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù).

菌種鑒定：培養(yǎng)后生長(zhǎng)的菌落種類(lèi)均采用MADLI-TOF MS進(jìn)行鑒定.用無(wú)菌牙簽挑取單個(gè)菌落，均勻涂布在靶板孔上，自然晾干，每個(gè)靶板孔加1 μL甲酸，自然晾干，然后每個(gè)靶板孔加1 μL基質(zhì)液，自然晾干后上機(jī)鑒定.

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 厭氧菌和需氧菌培養(yǎng)時(shí)間

49種厭氧菌和一個(gè)混合厭氧菌中90%以上的菌種在36 h內(nèi)到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期(見(jiàn)圖1 a～d)；20種需氧菌和一個(gè)混合需氧菌中90%以上的菌種在18 h內(nèi)到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期(見(jiàn)圖1 e～f).

a～d.厭氧菌生長(zhǎng)曲線；e～f.需氧菌生長(zhǎng)曲線.圖1 各菌種生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of each strain

3.2 接種細(xì)菌數(shù)

厭氧培養(yǎng)條件下，OD600值為0.060時(shí)，生長(zhǎng)的菌落數(shù)無(wú)法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，OD600值為0.045時(shí)，生長(zhǎng)的菌落數(shù)為(462.65±25.86) cfu；OD600值為0.030時(shí)，生長(zhǎng)的菌落數(shù)為(348.75±38.54)cfu；兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；需氧培養(yǎng)條件下，OD600值為0.070時(shí)，生長(zhǎng)的菌落數(shù)無(wú)法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，OD600值為0.050時(shí)，生長(zhǎng)的菌落數(shù)為(444.50±23.77)cfu；OD600值為0.030時(shí)，生長(zhǎng)的菌落數(shù)為(339.35±21.76)cfu；兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).見(jiàn)表1.

表1 厭氧菌和需氧菌在不同OD600值培養(yǎng)生長(zhǎng)的菌落數(shù)Tab.1 Colony numbers of anaerobic bacteria and aerobic bacteria cultured in different OD600

3.3 標(biāo)本采集后的不同接種時(shí)間

標(biāo)本留取后分別于0、1、2、3 h時(shí)接種培養(yǎng)，0、1、2 h菌落數(shù)和種類(lèi)多于3 h的菌落數(shù)和種類(lèi)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，0、1、2 h 3組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)圖2.

*、#.P<0.05.圖2 標(biāo)本不同留置時(shí)間培養(yǎng)生長(zhǎng)的菌落數(shù)和種類(lèi)數(shù)Fig.2 Number of colonies and species in different indwelling time

3.4 兩組患者的腸道菌群相關(guān)量化指標(biāo)

對(duì)照組總菌數(shù)、厭氧菌數(shù)/需氧菌數(shù)、革蘭陰性菌(G-菌)/革蘭陽(yáng)性菌(G+菌)、桿菌/球菌、益生菌占比高于抗菌藥物組，而真菌數(shù)低于抗菌藥物組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).見(jiàn)表2.

表2 兩組患者的腸道菌群相關(guān)量化指標(biāo)分析Tab.2 Quantitative indexes of gut microbiota in two groups

3.5 部分菌種的MADLI-TOF MS鑒定質(zhì)譜圖

部分菌種的核糖體蛋白特征性質(zhì)譜峰構(gòu)成該微生物的指紋圖譜，用于該菌鑒定.見(jiàn)圖3.

圖3 部分菌種的MADLI-TOF MS鑒定質(zhì)譜Fig.3 Mass spectra of MADLI-TOF MS for identification of some strains

4 討 論

微生物培養(yǎng)法歷史悠久，而建立一種更適合于臨床應(yīng)用的腸道菌群優(yōu)化培養(yǎng)方法顯得尤為重要.本研究通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)組學(xué)方法，獲得一種更適宜臨床應(yīng)用的腸道菌群培養(yǎng)及鑒定方法.

由于受生活習(xí)慣、營(yíng)養(yǎng)狀況、性別、疾病情況、治療用藥等因素影響，使得個(gè)體間腸道菌群含量差別較大，因此，探索一種適合不同個(gè)體間細(xì)菌的接種數(shù)量是十分必要的.基于培養(yǎng)組學(xué)的腸道菌群培養(yǎng)及鑒定方法首次提出采用檢測(cè)樣本以O(shè)D600值確定接種數(shù)量，可顯著減少不同樣本間的接種誤差：培養(yǎng)人體腸道中的厭氧菌、需氧菌和真菌，并可獲得評(píng)估腸道菌群的相關(guān)量化指標(biāo)，如細(xì)菌總數(shù)、厭氧菌數(shù)/需氧菌數(shù)、G-菌/G+菌、桿菌/球菌、益生菌占比等，能夠更全面地反映腸道菌群的特征，對(duì)于診斷腸道菌群失調(diào)、制定個(gè)性化微生態(tài)調(diào)節(jié)方案、指導(dǎo)臨床抗菌藥物的應(yīng)用具有重要意義，可為臨床診療提供一定的參考依據(jù).基于培養(yǎng)組學(xué)的腸道菌群培養(yǎng)及鑒定方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、準(zhǔn)確率高和鑒定迅速等特點(diǎn)，尤其在價(jià)格上僅為16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)的百分之一，更具有臨床應(yīng)用價(jià)值.基于培養(yǎng)組學(xué)的腸道菌群培養(yǎng)及鑒定方法有利于發(fā)現(xiàn)新菌種，并為種或亞種的代謝特征、菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)抑制與協(xié)同作用、菌株與宿主關(guān)系等方面的研究提供活的菌株，為研究特定菌株在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制等后續(xù)延展性研究奠定基礎(chǔ).

有研究[6]表明：GAM是一種主要用于厭氧菌培養(yǎng)和抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的培養(yǎng)基，可作為一種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)人體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)培養(yǎng)人腸道菌群具有較高的應(yīng)用價(jià)值，此外，GAM無(wú)須補(bǔ)充馬血或羊血，經(jīng)高壓滅菌后仍然為透明狀態(tài)，有利于應(yīng)用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并且容易檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的OD600值，能夠很好地監(jiān)測(cè)各菌種的生長(zhǎng)特性等.哥倫比亞培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上額外加入了動(dòng)物血，營(yíng)養(yǎng)豐富，可培養(yǎng)并分離多種代謝類(lèi)型的微生物，各種樣本均適用[8].臨床上由真菌引起的感染逐年增多，沙保羅培養(yǎng)基是臨床上培養(yǎng)真菌的常用培養(yǎng)基，可培養(yǎng)多種類(lèi)型的真菌，如念珠菌、酵母菌、霉菌等[13].本研究已經(jīng)通過(guò)預(yù)試驗(yàn)排除了由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏對(duì)生長(zhǎng)平臺(tái)期的影響.在厭氧條件下，49種厭氧菌中90%以上的菌種在36 h內(nèi)到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期，故厭氧菌的培養(yǎng)時(shí)間選擇36～48 h；需氧條件下，20種需氧菌中90%以上的菌種在18 h內(nèi)到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期，故需氧菌的培養(yǎng)時(shí)間選擇18～24 h.常規(guī)臨床真菌培養(yǎng)為18～24 h，故本研究選擇上述時(shí)間作為培養(yǎng)真菌的最佳時(shí)間[14].考慮到菌種之間的生長(zhǎng)抑制和協(xié)同作用，本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)菌種混合后其生長(zhǎng)情況，觀察到厭氧混合菌和需氧混合菌分別在36 h和18 h內(nèi)也到達(dá)了生長(zhǎng)平臺(tái)期.

本研究結(jié)果顯示：生長(zhǎng)的菌落覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基且菌落之間不相連，為最佳的接種數(shù)量.厭氧菌在接種5 μL時(shí)，OD600為0.045的樣本生長(zhǎng)菌落數(shù)最多，并且可以精確計(jì)數(shù)；而需氧菌在接種50 μL時(shí)，OD600為0.050時(shí)可出現(xiàn)上述情況，因此，本研究將厭氧菌和需氧菌的最佳接種OD600值設(shè)置為0.045(5 μL)和0.050(50 μL).健康人糞便中的真菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)菌數(shù)量，數(shù)量約為細(xì)菌數(shù)量的一半，故本研究中真菌培養(yǎng)選擇接種原液.糞便中的部分菌種對(duì)氧或溫度等條件敏感，因此，糞便留置時(shí)間會(huì)對(duì)細(xì)菌總數(shù)及種類(lèi)產(chǎn)生影響[15-16].本研究發(fā)現(xiàn)：在2 h內(nèi)，隨著標(biāo)本留置時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)出的細(xì)菌種類(lèi)數(shù)和數(shù)量均呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而標(biāo)本留置時(shí)間延長(zhǎng)至3 h接種，其生長(zhǎng)的數(shù)量和種類(lèi)進(jìn)一步減少，與2 h內(nèi)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，故標(biāo)本留取后需2 h內(nèi)接種培養(yǎng).

抗菌藥物會(huì)引起腸道菌群失調(diào)，主要以數(shù)量、種類(lèi)和功能多樣性的減少、抵抗病原體入侵的能力降低為特征[17].JERNBERG C等[18]研究顯示：應(yīng)用克林霉素后厭氧菌減少、G+菌升高，可能導(dǎo)致總菌數(shù)、厭氧菌數(shù)/需氧菌數(shù)、G-菌/G+菌、益生菌占比降低，應(yīng)用環(huán)丙沙星后腸桿菌科減少，可能導(dǎo)致桿菌/球菌降低，與本研究結(jié)果類(lèi)似.本研究培養(yǎng)出的細(xì)菌總數(shù)為109～1010cfu/g，與RETTEDAL E A等[7]的研究結(jié)果一致.應(yīng)用抗菌藥物導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，真菌感染的機(jī)會(huì)增加，糞便中培養(yǎng)出真菌的數(shù)量增加，與王慮等[19]的研究一致.為獲得較高的鑒定率，在操作過(guò)程中要挑取單個(gè)菌落，為防止涂布混菌，挑取菌落的量要適宜，涂布不宜過(guò)厚或過(guò)薄，涂布要均勻，靶板要清洗干凈；同時(shí)，菌種的蛋白質(zhì)圖譜庫(kù)要及時(shí)更新.未被鑒定出或未被準(zhǔn)確鑒定時(shí)，可采用甲酸提取法處理.若仍未被準(zhǔn)確鑒定，將菌種凍存以備后續(xù)測(cè)序用.本研究建立的人類(lèi)腸道微生物培養(yǎng)組學(xué)法可培養(yǎng)鑒定出人體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，并可獲得評(píng)估腸道菌群的相關(guān)量化指標(biāo)，成本低，操作簡(jiǎn)便，對(duì)于診治腸道菌群失調(diào)、指導(dǎo)抗菌藥物應(yīng)用具有臨床價(jià)值.

本研究也存在一定的局限性，由于選取的人群樣本量有限，市售的培養(yǎng)基和機(jī)器鑒定通量的限制，尚不能培養(yǎng)及鑒定人體所有的腸道微生物；操作中也會(huì)產(chǎn)生誤差，如稀釋誤差、涂布丟失、未被準(zhǔn)確鑒定等.此外，本研究中對(duì)真菌的研究也不夠深入，在后續(xù)的研究中，將加大樣本量，重點(diǎn)研究真菌的培養(yǎng)及鑒定，以探索人體腸道菌群的更真實(shí)、準(zhǔn)確的特征，為臨床診斷腸道菌群相關(guān)疾病提供參考依據(jù).