李志偉，李本杰，劉志兵，林 菲，徐漢虹，舒 薇

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，廣東 廣州510642；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 測試中心，廣東 廣州510642)

導(dǎo)向農(nóng)藥是將農(nóng)藥有效成分與導(dǎo)向載體偶聯(lián)后使其能在植物體內(nèi)特定部位(果實、葉、芽或病蟲害造成的傷口)定向累積的新型農(nóng)藥[1]。在大多數(shù)情況下，農(nóng)藥是通過被動擴散或離子捕獲機制跨生物膜運輸。此外，一些小的農(nóng)用化學(xué)分子可以通過植物質(zhì)膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運[2]，這表明這些轉(zhuǎn)運蛋白的特異性并不嚴格受限于它們的天然生理底物[3]。在制藥領(lǐng)域，一些轉(zhuǎn)運蛋白被廣泛認為是藥物動力學(xué)的重要決定因素，在某些藥物進入靶器官的過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。因此，農(nóng)藥分子定向修飾后，可以被植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運蛋白識別并轉(zhuǎn)運，從而提高農(nóng)藥分子在植物體內(nèi)的靶向輸導(dǎo)能力。選擇合適的植物轉(zhuǎn)運蛋白并分析其結(jié)構(gòu)與底物之間的構(gòu)效關(guān)系，是導(dǎo)向農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計和優(yōu)化的關(guān)鍵。潛在的農(nóng)藥轉(zhuǎn)運蛋白應(yīng)具有相對較高的通量和較寬的底物特異性，并且不影響韌皮部組織液的循環(huán)[5]。由于糖、氨基酸和寡肽的植物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在植物組織中的表達和功能，它們被認為是新農(nóng)藥創(chuàng)制的可能靶標(biāo)。其中一些轉(zhuǎn)運蛋白已經(jīng)被證明具有廣泛的底物特異性，例如擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白AtSUT2，除轉(zhuǎn)運蔗糖外，還能夠轉(zhuǎn)運一系列糖苷，包括天然存在的香豆素糖苷[6]；擬南芥組氨酸/賴氨酸轉(zhuǎn)運蛋白AtLHT1可以轉(zhuǎn)運L-谷氨酰胺-氟蟲腈等一系列保留α氨基的電中性共軛物[7]；蓖麻單糖轉(zhuǎn)運蛋白RcSTP1可以轉(zhuǎn)運葡萄糖基一氟蟲腈(GTF)等一系列糖基偶合物[8]。

LHT1屬于擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族(Amino acid transporter family，ATF)，ATF 是植物中最先報道的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族。ATF在植物對氨基酸的吸收、轉(zhuǎn)運、長距離運輸及“源”和“庫”再分配過程中扮演著重要角色。在植物根部吸收氨基酸的轉(zhuǎn)運蛋白研究中，Chen等[9]報道了擬南芥第1個參與植物根部吸收氨基酸的轉(zhuǎn)運蛋白-AtLHT1，后續(xù)研究表明其對中性氨基酸和酸性氨基酸有很高的親和力，是植株在自然濃度下從土壤中吸收氨基酸的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)運蛋白[10]。在以氨基酸或氨基酸衍生為導(dǎo)向農(nóng)藥的研究中，Chen 等[11]利用電生理技術(shù)證明了甘氨酸甲酯-氯蟲苯甲酰胺(CAP-Gly-2)會引起表達有AtLHT1的爪蟾卵母細胞的膜電位變化，并且在植株水平上，AtLHT1轉(zhuǎn)錄水平的變化會影響擬南芥對甘氨酸甲酯-氯蟲苯甲酰胺的吸收，從而證明了該藥物可能被AtLHT1轉(zhuǎn)運。Xie 等[12]在植株水平和爪蟾卵母細胞異源水平均證明了AtLHT1可以影響甘氨酸甲酯-氯蟲苯甲酰胺的吸收。由于AtLHT1轉(zhuǎn)運底物的廣譜性，以其為基礎(chǔ)設(shè)計開發(fā)一種簡單快速的導(dǎo)向農(nóng)藥輸導(dǎo)性的檢測方法，有可能得到在植株中具有良好輸導(dǎo)性的化合物，從而加快導(dǎo)向農(nóng)藥的研發(fā)進程。

如果2個熒光團相距為1～10 nm，且1個熒光團(供體)的發(fā)射光譜與另1個熒光團(受體)的吸收光譜有重疊，當(dāng)供體被入射光激發(fā)時，可通過偶極-偶極耦合作用將其能量以非輻射方式傳遞給受體分子，供體分子衰變到基態(tài)而不發(fā)射熒光，受體分子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再衰變到基態(tài)同時發(fā)射熒光，這一過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)[13]。FRET 現(xiàn)象最早由F?rster[14]闡明，在綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)后基于熒光蛋白的FRET探針在生命科學(xué)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用，如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化、酶類活性研究、細胞信號通路的研究等[15]，常用的FRET熒光基團有CFP-YFP、CFP-dsRED、BFPGFP、Cy3-Cy5、YFP-TRITC、YFP-Cy3 等[16]。FRET探針被用于蛋白與底物的檢測，如基于麥芽糖結(jié)合蛋白與底物結(jié)合后的構(gòu)象變化構(gòu)建出麥芽糖檢測的FRET探針，其探針構(gòu)建是在麥芽糖結(jié)合蛋白的兩端分別添加YFP和CFP形成“三明治”融合蛋白。當(dāng)麥芽糖結(jié)合蛋白與底物結(jié)合后，使蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，F(xiàn)RET探針的熒光效率發(fā)生變化[17]。本研究基于FRET原理，將氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白AtLHT1兩端添加青色熒光蛋白(Cyan fluorescence protein CFP)和黃色熒光蛋白 (Yellow fluorescence protein，YFP)基團構(gòu)建FRET探針，擬通過酵母細胞或原核表達蛋白的熒光比率變化來驗證AtLHT1參與多種氨基酸的轉(zhuǎn)運功能，并運用于農(nóng)藥的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥物 草甘膦 (Glyphosate)、谷氨酸(Glutamic acid)、精氨酸 (Arginine)、甘氨酸(Glycine)均購于Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 含有CFP和YFP基因序列的Ubi-YFP-CFP-SV40-NOS載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳樂天教授課題組惠贈，大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生物試劑公司，pREST系列載體購于Takara公司。BY4741酵母和pDR196載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室保存。

1.1.3 主要儀器 PCR Thermal Cycler Dice TP600(Takara)，Power Pac Universal型恒壓恒流電泳儀(Biorad)，ND1000核算蛋白定量儀 (Eppendorf)，Tanon 1600凝膠成像儀(廣州譽維)，熒光顯微鏡(日本 Olympus)，Leica TCS SP8 STED 3X 激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)，F(xiàn)Lx800熒光分析儀(美國BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 表達載體構(gòu)建 在CFP的C端和YFP的N端分別添加linker序列GGTACCGGAGGCGCC和GGCGCCGGTACCG[18]，構(gòu)建的 CFP-LHT1-YFP 三明治探針，分別連接到pRSET-A原核表達載體和pDR196酵母表達載體，構(gòu)建方法如圖1所示。

圖1 CFP-LHT1-YFP三明治探針表達載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of expression vector of CFP-LHT1-YFP sandwich probe

1.2.2 原核表達及酶標(biāo)儀熒光檢測 將測序結(jié)果正確的pDR196-CFP-linker-LHT1-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取經(jīng)氨芐青霉素抗性LB平板篩選的陽性克隆接種于5 mL SOB液體培養(yǎng)基，30 ℃ 搖床培養(yǎng)至D600nm= 0.4～0.6，取 1 mL菌液至100 mL新鮮SOB培養(yǎng)基，加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，30 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)。加入 IPTG 時的時間記為 0 h，間隔 1 h 取 1 mL菌液，試驗進行 6 h，所取樣品經(jīng) SDS-PAGE 電泳后用考馬斯亮藍染色確定表達時間，通過Western blot驗證該條帶是否為目的條帶。采用全式金公司的ProteinIso Ni_NTA 填料柱對誘導(dǎo)表達后的蛋白進行純化。

在96孔黑色底部不透光的酶標(biāo)板內(nèi)，加入經(jīng)BL21表達后純化的蛋白探針和待測底物，選擇430 nm激發(fā)光激發(fā)，檢測 480 ± 20 nm 和 535 ± 20 nm 2 個波段的光強變化及 FRET 比率（D535nm/D480nm）。如果有明顯的FRET發(fā)生，CFP的能量會通過FRET傳遞給YFP，從而使YFP熒光強度增加，最終導(dǎo)致FRET比率升高。在不同底物濃度對LHT1-FRET探針光強變化影響試驗中，作為陽性對照的甘氨酸加入濃度為 0.5、5 和 100 mmol/L，谷氨酸加入濃度為5和50 mol/L，草甘膦加入濃度為1、5和30 mmol/L，作為陰性對照的精氨酸、2，4-二氯苯氧乙酸、乙氧氟草醚，加入濃度均為10 mmol/L。

1.2.3 酵母真核表達及共聚焦檢測 把保存的BY4741酵母在固體YPDA培養(yǎng)基上劃線活化用于制備酵母感受態(tài)，利用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Takara)將pRSET-A-CFP-linker-LHT1-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BY4741酵母感受態(tài)細胞后涂板。設(shè)置序列掃描，序列1的激發(fā)光波長為405 nm，發(fā)射光檢測波長范圍為450 ～490 nm，序列2的激發(fā)光波長為514 nm，發(fā)射光檢測波長范圍為525～570 nm。挑選陽性克隆至載玻片，分序列掃描確定YFP和CFP在酵母中的表達是否正確，篩選表達正確的克隆。將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的酵母單克隆轉(zhuǎn)至YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至D600nm= 1，取 1 mL 菌液離心后去上清液，沉淀用 20 mmol/L pH 7.0 的 PBS 緩沖液漂洗 3 次后，在PBS緩沖液中處理24 h后，加入濃度均為10 mmol/L的藥物處理，取處理液10 μL至多聚賴氨酸處理后的共聚焦培養(yǎng)皿，設(shè)置供體激發(fā)光波長為405 nm，受體激發(fā)光波長為514 nm，選定發(fā)光區(qū)域后，用100%的514 nm激光漂白YFP，觀察CFP的熒光強度是否增加，根據(jù)FRET效率公式計算：

1.2.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)整理和分析采用 IBM SPSS Statistics 25 和 ExceL 2003 軟件，結(jié)果用 3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用Duncan’s法比較分析各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段的獲取及表達載體的構(gòu)建

在CFP的C端和YFP的N端分別添加linker序列，第1輪PCR擴增分別得到760 bp的CFP-linker和 linker-YFP片段(圖2A)。經(jīng)第2輪融合PCR擴增拼接獲得1.5 kb的CFP-linker-YFP片段。再以第2輪產(chǎn)物為模板，進行第3輪融合PCR，大量擴增CFP-linker-YFP片段(圖2B)，膠回收后的CFP-linker-YFP片段與經(jīng)雙酶切、膠回收后的線性pDR196空載體經(jīng)infusion酶連接后轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆，經(jīng)測序驗證成功獲得6.7 kb的載體pDR196-CFP-linker-YPF(圖 2C)。

圖2 目的基因片段的獲取及表達載體的構(gòu)建Fig. 2 Acquisition of target gene fragment and construction of expression vector

2.2 原核表達分析

CFP-LHT1-YFP融合蛋白理論相對分子質(zhì)量為 125 000。BL21(DE3) 經(jīng)誘導(dǎo)后，分別對誘導(dǎo)后不同時間點取樣，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在加入IPTG后4 h內(nèi)融合蛋白表達不明顯，5 h后融合蛋白的表達明顯(圖3A)，且6 h后表達量增加。為避免BL21過量表達融合蛋白后形成包涵體，時間沒有繼續(xù)延長。蛋白電泳檢測融合蛋白的表觀相對分子質(zhì)量大小與理論接近。用抗GFP兔源抗體的Western blot驗證，融合蛋白帶有GFP，且相對分子質(zhì)量與理論值接近(圖3B)。

圖3 原核表達分析Fig. 3 Prokaryotic expression analysis

2.3 不同底物對LHT1-FRET探針的光強變化

取純化后的原核表達蛋白，分別與PBS緩沖液、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、草甘膦混合后檢測YFP和CFP的熒光比率變化。試驗結(jié)果(圖4)顯示，在加入不同底物后，D535nm/D480nm的變化會有明顯差異。其中加入陽性對照的甘氨酸和谷氨酸后，D535nm/D480nm明顯升高，在加入藥物 10 min 后，甘氨酸的D535nm/D480nm增加 13%，谷氨酸的增加6%；在加入藥物 20 min 后，甘氨酸的D535nm/D480nm增加17%，谷氨酸的增加12%；在加入藥物40 min后，甘氨酸的D535nm/D480nm增加 20%，谷氨酸的增加15%；隨著時間推移，比率變化趨緩。草甘膦處理同樣使D535nm/D480nm升高，其趨勢與甘氨酸和谷氨酸接近，在 10、20、40 min 分別增加 7%、10%和12%。加入用作陰性對照的精氨酸后，D535nm/D480nm沒有變化。僅含PBS緩沖液的空白對照組的D535nm/D480nm同樣沒有明顯變化 (圖 4A)。不同底物的光強比率最大變化(圖4B)也進一步表明，所構(gòu)建的LHT1的FRET探針對甘氨酸、谷氨酸、草甘膦光強有較大影響，說明對底物有較強的轉(zhuǎn)運能力；而對PBS緩沖液和精氨酸影響較小，說明對該底物的轉(zhuǎn)運能力低或不轉(zhuǎn)運。

圖4 不同底物對LHT1-FRET探針光強變化Fig. 4 Changes in light intensity of the LHT1-FRET probe with different substrates

2.4 不同底物濃度對LHT1-FRET探針光強變化的影響

為了檢測LHT1-FRET探針的檢測域和靈敏度，以不同濃度底物對LHT1-FRET探針光強比率影響進行檢測。加入不同濃度底物后，D535nm/D480nm變化會有明顯差異。其中陽性對照的甘氨酸分別按照 0.5、5 和 100 mmol/L 加入后，20 min 后D535nm/D480nm分別升高 3%、3% 和10%(圖 5B)；陽性對照的谷氨酸分別按照5 和50 mmol/L加入后，20 min 后的D535nm/D480nm分別升高 2% 和 9%(圖 5C)；草甘膦處理同樣以 1 、5 和 30 mmol/L 濃度加入后，20 min 后的D535nm/D480nm分別升高 3%、1%和13%(圖5A)。而加入濃度為10 mmol/L的陰性對照精氨酸2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、乙氧氟草醚，D535nm/D480nm沒有升高 (圖 5D)。由此說明，F(xiàn)RET變化明顯受底物濃度影響。底物濃度越高，F(xiàn)RET比率變化越明顯，在較低底物濃度下，F(xiàn)RET比率變化會較小，說明該探針在靈敏度方面需要進一步改進。

圖5 不同底物濃度對LHT1-FRET探針光強變化（D535 nm/D480 nm）的影響Fig. 5 Effects of substrate concentrations on the light intensity (D535 nm/D480 nm) of the LHT1-FRET probe

2.5 酵母真核表達的共聚焦檢測

當(dāng)供體熒光分子和受體熒光分子存在能量轉(zhuǎn)移時，對受體熒光分子進行光漂白后，供體熒光分子的熒光會升高，通過檢測其漂白前、后的光強變化來計算FRET效率。結(jié)果顯示，在加入濃度均為10 mmol/L的不同底物后，漂白前(圖6A)、后(圖6B)，F(xiàn)RET效率變化會有明顯差異。其中加入陽性對照的甘氨酸和谷氨酸后，F(xiàn)RET效率變化比較明顯，其中甘氨酸的FRET效率達到30%，谷氨酸的FRET效率也達到26%。加入草甘膦處理的FRET效率與谷氨酸接近，也達到26%。含PBS緩沖液的空白對照組沒有明顯的FRET效率變化(圖7)。與原核表達的探針檢測結(jié)果一致。

圖6 熒光分子漂白（514 nm激光）前、后的光強變化Fig. 6 Changes of light intensity in fluorescent molecules before and after 514 nm laser bleaching

圖7 光漂白法測定不同底物處理后的FRET效率Fig. 7 FRET efficiencies of treatments with different substrates measured by photobleaching method

3 討論與結(jié)論

自被報道參與擬南芥根部氨基酸的吸收以來，LHT1已有大量研究。對唯一氨基酸氮源的篩選證明，LHT1對中性氨基酸和酸性氨基酸有較高親和力，而對堿性氨基酸親合力最低[19-20]。Chen等[11]證明擬南芥LHT1可以轉(zhuǎn)運氨基酸衍生物CAP-Gly-2。本研究結(jié)果顯示，在原核表達中LHT1-FRET探針可以與中性氨基酸甘氨酸和酸性氨基酸谷氨酸、谷氨酰胺結(jié)合，而不結(jié)合堿性氨基酸精氨酸，結(jié)果與文獻報道的一致。另外，本文試驗證明了LHT1可能與草甘膦發(fā)生結(jié)合，進一步拓展了LHT1轉(zhuǎn)運底物的范圍。

本研究以LHT1轉(zhuǎn)運蛋白為主要研究對象，選用CFP 和YFP結(jié)合FRET技術(shù)，構(gòu)建基于LHT1的FRET探針，進一步研究LHT1對多種氨基酸的轉(zhuǎn)運。本文構(gòu)建了2種表達系統(tǒng)質(zhì)粒，分別在原核細胞和酵母細胞中表達，用作陽性對照的氨基酸處理后，F(xiàn)RET比率均有明顯的變化，說明成功構(gòu)建了FRET探針。LHT1是擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，其在低等的原核細胞BL21中表達的蛋白結(jié)構(gòu)與擬南芥天然LHT1蛋白有所差異，在試驗中表現(xiàn)出較低靈敏度，但原核細胞BL21表達系統(tǒng)操作簡單，且通過酶標(biāo)儀即可檢測，方便實驗室快速操作，但Vanoaica等[21]報道Arg-FRET探針檢測到μmol級別，有可能是不同的表達體系造成的，說明更高級的表達系統(tǒng)HEK293T細胞對FRET探針的靈敏度有幫助，可以通過更高級的表達系統(tǒng)獲得高靈敏度的LHT1-FRET探針，從而用于篩選體外藥物。利用酵母體系表達LHT1-FRET探針，靈敏度似乎要高于原核表達體系。但酵母表達的探針進行單細胞檢測需要在激光共聚焦顯微鏡下操作，光漂白處理對細胞有影響，不利于在單細胞中多次測量，同時也不能進行實時動態(tài)檢測[22]。另一方面也可以在LHT1-FRET探針結(jié)構(gòu)上嘗試更多的組合，改變蛋白之間的linker，來提高探針的靈敏度[23]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了基于擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白LHT1的FRET探針，并分別在原核細胞和真核細胞中成功表達，證明LHT1確實參與了多種氨基酸的轉(zhuǎn)運，同時證明了草甘膦能夠被氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白LHT1轉(zhuǎn)運，為氨基酸導(dǎo)向農(nóng)藥的設(shè)計提供了理論依據(jù)，為導(dǎo)向農(nóng)藥的快速篩選提供了平臺。