周慧穎，余麗琴，劉 進(jìn)，胡佳曉，黎毛毛

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/江西省農(nóng)作物種質(zhì)資源研究中心，江西 南昌 330200）

【研究意義】長期以來，華南稻區(qū)以秈稻生產(chǎn)為主，東北稻區(qū)以粳稻生產(chǎn)為主，長江中下游沿江地區(qū)為秈、粳稻混栽區(qū)[1-2]。近年來，城市化的發(fā)展推動了南方城市粳米的消費，由于粳稻的耐寒性好、耐肥抗倒且增產(chǎn)潛力大，適合機(jī)械化生產(chǎn)，加之長江中下游沿江地區(qū)具有種植粳稻的傳統(tǒng)和自然條件，恢復(fù)粳稻生產(chǎn)已成為該區(qū)域水稻轉(zhuǎn)型生產(chǎn)的戰(zhàn)略選擇[3-5]。但非江西省培育并大面積推廣的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)常規(guī)粳稻品種不適應(yīng)江西省水稻高溫生長環(huán)境，種植中表現(xiàn)生長量小、品質(zhì)下降明顯[6]。因此，江西省發(fā)展粳稻生產(chǎn)急需本土化的優(yōu)質(zhì)粳稻品種。實踐證明，基于秈稻和粳稻亞種間的雜交育種理論，利用秈粳雜種優(yōu)勢[7]不僅能夠提高粳稻的產(chǎn)量，對豐富粳稻的遺傳構(gòu)成也有重要意義[8-10]。因此，有必要利用高效的分子標(biāo)記技術(shù)，分析檢測品種的秈型或粳型基因頻率與秈粳分類屬性，為育種與判定品種的類別提供理論指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】秈稻品種9311 和粳稻品種日本晴全基因組測序的完成，為建立基于InDel 分子標(biāo)記的秈粳分類方法提供了重要工具[11-14]。王林友等[15]通過InDel 分子標(biāo)記法鑒別了育種上常用的48 份秈粳及中間型材料的秈粳屬性，并運用程式指數(shù)法對其準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗證，證明了In-Del 分子標(biāo)記在稻種資源秈粳屬性鑒定上的可行性。王明軍等[16]利用34 對InDel 分子標(biāo)記對來自云南的181 份糯稻品種進(jìn)行秈粳屬性分析，再次表明InDel 分子標(biāo)記法能快速高效的鑒定云南糯稻品種的秈粳屬性?！颈狙芯壳腥朦c】在江西省實施晚稻“秈改粳”，既有利于提高日干物質(zhì)產(chǎn)量的積累和稻米品質(zhì)，又有利于充分利用后期光、溫等土地利用資源的充分利用，提高了土地綜合利用效率。同時，也可以適當(dāng)延長雙季稻中早稻生長的周期，早稻種植中遲熟的品種，提高雙季早稻的生產(chǎn)率，進(jìn)而達(dá)到雙季高產(chǎn)[8]。隨著我國水稻秈粳屬性分析技術(shù)的不斷完善，目前有關(guān)稻種資源的秈粳鑒定工作已取得長足的進(jìn)展，但主要集中在部分地區(qū)資源的鑒定，其研究結(jié)果具有一定局限性，真正用于水稻品種鑒定與評價方面報道較少，尚未對適合江西省稻種資源的秈粳分化水平及秈粳基因頻率與表型性狀的相關(guān)性進(jìn)行深入研究，秈型血緣的引入在提高產(chǎn)量的同時是否會對其品質(zhì)有負(fù)面影響也需要進(jìn)行深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用30 對InDel 秈粳特異性標(biāo)記對來自國內(nèi)外收集和引種的360 份優(yōu)異粳稻資源進(jìn)行秈粳屬性鑒定，并調(diào)查其田間表現(xiàn)、產(chǎn)量和品質(zhì)等8 個表型性狀，分析秈型基因頻率與表型性狀兩者之間的相關(guān)性，并結(jié)合株型、產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀，最終篩選出123 份粳稻種質(zhì)作為江西省“秈改粳”育種核心種質(zhì)資源，為有效合理利用粳稻資源以及改良水稻品種提供了理論依據(jù)及育種材料。在江西省大力發(fā)展粳稻生產(chǎn)，提高粳稻的總產(chǎn)量及其品質(zhì)，對于保證江西省人民“口糧”安全和維護(hù)社會穩(wěn)定具有重要戰(zhàn)略意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為2016—2019 年收集的1 617 份國內(nèi)外粳稻資源，在江西省南昌、宜豐、上饒、撫州、萍鄉(xiāng)5個地區(qū)進(jìn)行多年多點的適應(yīng)性初步鑒定后，篩選出生育期適宜和株高適中的優(yōu)異粳稻種質(zhì)資源360份，包括北方粳稻、長江中下游優(yōu)質(zhì)粳稻、云貴川高原粳稻、日本優(yōu)質(zhì)粳稻等（圖1），以日本晴和9 311分別作為典型粳稻和典型秈稻的對照品種。

圖1 360份粳稻種質(zhì)資源分布情況Fig.1 Geographical distribution of 360 japonica rice germplasm resources

1.2 田間試驗設(shè)計及統(tǒng)計

試驗材料于2019 年在江西萍鄉(xiāng)試驗基地種植，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3 次重復(fù)，每區(qū)8 行，每行28 株，株行距16.5 cm×26.4 cm，雙本插。5 月21 日播種，6 月16 日移栽，田間管理同常規(guī)水稻大田生產(chǎn)。調(diào)查單株有效穗數(shù)（個）、穗長（cm）、每穗粒數(shù)（粒）、結(jié)實率（%）、千粒質(zhì)量（g）、理論產(chǎn)量（t/hm2）、粒長（mm）和粒型（長寬比），具體調(diào)查方法按照韓龍植等[17]主編的“水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)”。所有表型性狀數(shù)據(jù)使用Excel 2010 軟件處理和繪制圖表，用SPSS20.0 計算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差、方差和變異系數(shù)并進(jìn)行相關(guān)分析。

1.3 基因組DNA的提取和分子標(biāo)記分析

在每個品種中間行取幼苗的嫩葉2 片，采用CTAB 法[18]分別提取各基因組DNA。參考盧寶榮等[19]選擇均勻分布于l2條染色體且具有較高秈粳特異性的34對InDel分子標(biāo)記，委托江西鼎國生物科技有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系參考劉進(jìn)等[20]的方法，選擇10 μL反應(yīng)體系，PCR 產(chǎn)物利用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳完畢硝酸銀染色后作帶型分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以典型秈稻9311和典型粳稻日本晴DNA的PCR 電泳結(jié)果為對照，在各InDel位點上，樣品電泳條帶位置與9311 位置一致的，記為純合秈稻基因型（II）；樣品電泳條帶位置與日本晴一致的，記為純合粳稻基因型（JJ）；樣品電泳條帶位置出現(xiàn)既與秈稻9311 位置相同又同時與粳稻日本晴條帶置相同的，記為秈/粳稻雜合基因型（IJ）。根據(jù)所有InDel 位點上各樣品的基因型數(shù)據(jù)來計算其秈粳基因頻率（F），計算公式[21]如下：

式（1）（2）中，Xii為純合秈稻基因型（II），Xjj為純合粳稻基因型（JJ），Xij為秈粳稻雜合基因型（IJ），N為秈粳特異InDel 分子標(biāo)記數(shù)目。根據(jù)被檢測樣品在多個InDel 位點上的秈粳基因頻率，參照栽培稻秈粳屬性的判別標(biāo)準(zhǔn)（表1）來判定參試品種的秈粳屬性[21]。

表1 按照秈型（Fi）或粳型（Fj）基因頻率鑒定秈稻或粳稻的InDel分類標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 InDel classification standands based on indica（Fi）gene frequencies and japonica（Fj）gene frequencies

為了檢測各樣品由InDe1 分子標(biāo)記所揭示的遺傳親緣關(guān)系，以“0，l”建立統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫，每一對InDel分子標(biāo)記檢測一個位點，每一條多態(tài)性條帶為一個等位基因，在相同位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，條帶缺失記為“9”。同時以InDel 條帶賦值為變量，用統(tǒng)計分析軟件SPSS25.0 對各樣品數(shù)據(jù)庫進(jìn)行主成分分析（principal componentanalysis，PCA），獲得所有研究材料各主成分的特征向量值，然后用Excel軟件依據(jù)第一和第二主成分的特征向量的平均分量值作平面散點圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的秈粳等位基因頻率和屬性鑒定

篩選出在擴(kuò)增粳稻種質(zhì)資源時帶型分化明顯的30對InDel分子標(biāo)記，360份粳稻種質(zhì)資源均可擴(kuò)增出2 條特異性條帶，含3 種帶型，即秈稻特異性條帶（II）、粳稻特異性條帶（JJ）和秈粳雜合型條帶（IJ），說明篩選出30對InDel引物具有較強(qiáng)的秈粳特異性。計算每份資源的秈稻型基因頻率（Fi），并按照表1進(jìn)行資源的秈粳屬性分類，結(jié)果表明，在360 份粳稻種質(zhì)資源中，秈型成分集中分布于0～10%，有典型粳稻312 份，占86.67%；粳稻42 份，占11.67%；偏粳5 份，占1.39%；偏秈1 份，品種鹽恢559（圖2）。因此，所鑒定的粳稻種質(zhì)資源中基本都是含有粳型基因頻率的粳型稻（典型粳稻、粳稻和偏粳），這些品種沒有或引入了極少量的秈型血緣。

圖2 360份粳稻種質(zhì)資源的秈型基因頻率分布情況Fig.2 Indica gene frequency of 360 japonica rice germplasm resources

2.2 供試材料的主成分分析

根據(jù)30對InDel分子標(biāo)記擴(kuò)增條帶建立的數(shù)據(jù)庫，對360份粳稻進(jìn)行主成分分析（圖3），依據(jù)各參試材料第一主成分和第二主成分的向量值作平面散點圖。其中，第一主成分對遺傳變異的貢獻(xiàn)率為53.28%，第二主成分為14.90%，累積貢獻(xiàn)率為68.19%，代表主要的遺傳變異。圖中每一個點代表一個參試材料，以各試驗材料在散點圖中的空間位置來推斷它們之間的遺傳親緣關(guān)系，PCA 散點圖結(jié)果和秈粳屬性鑒定結(jié)果高度一致，360 份試驗材料被聚集到2 個不同的區(qū)域，●區(qū)為粳稻區(qū)，對應(yīng)著358 份含有粳型基因頻率的粳型稻（典型粳稻、粳稻和偏粳），◆區(qū)為秈稻區(qū)，對應(yīng)著偏秈品種鹽恢559，區(qū)域大小反映的是區(qū)域內(nèi)材料變異的水平，區(qū)域空間距離反映的是遺傳距離的遠(yuǎn)近。

圖3 360份粳稻種質(zhì)資源的主成分分析散點圖Fig.3 The scatter plotting of principal component analysis(PCA）of the 360 japonica rice germplasm resources

2.3 數(shù)量性狀表型變異情況

由表2可知，360份粳稻種質(zhì)資源的8個表型性狀均存在不同程度的變異，其中每穗粒數(shù)（24.26%）的變異系數(shù)最高，谷粒長的變異系數(shù)（5.45%）最小，其它6個性狀的變異系數(shù)（10.09%～18.66%）。所調(diào)查的8個性狀表型的變異系數(shù)均在5.00%以上，表明360份粳稻種質(zhì)資源表型性狀的變異較大，其表型多樣性極其豐富。

表2 360份粳稻種質(zhì)資源數(shù)量性狀的變異情況Tab.2 Variation of quantitative characters of 360 japonica rice germplasm resources

2.4 秈型頻率與產(chǎn)量相關(guān)性狀的關(guān)系

以360份粳稻種質(zhì)資源的秈型基因頻率與6個產(chǎn)量性狀進(jìn)行相關(guān)分析，從圖4可以看出，在秈粳屬性方面，秈型基因頻率與穗長、每穗粒數(shù)均呈極顯著正相關(guān)；與單株有效穗數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，與理論產(chǎn)量和千粒質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)；與結(jié)實率無顯著相關(guān)性。因此，引入秈型血緣對粳稻品種的產(chǎn)量性狀有著顯著的影響。

圖4 秈型頻率（Fi）與產(chǎn)量性狀的關(guān)系Fig.4 Relationship between indica gene frequencies（Fi）and yield traits

2.5 秈型頻率與粒型性狀的關(guān)系

以360份粳稻種質(zhì)資源的秈型基因頻率與2個粒型性狀進(jìn)行相關(guān)分析，從圖5可以看出，在秈粳屬性方面，秈型基因頻率與谷粒形狀呈極顯著正相關(guān)，與粒長呈顯著正相關(guān)。因此，粳稻種質(zhì)資源的秈粳屬性與粒型性狀密切相關(guān)，在選育不同類型的水稻材料的時應(yīng)綜合考慮。

圖5 秈型頻率（Fi）與粒型性狀的關(guān)系Fig.5 Relationship between indica gene frequencies（Fi）and grain traits

3 結(jié)論與討論

3.1 利用InDel分子標(biāo)記鑒定粳稻種質(zhì)資源的秈粳屬性

確定親本的秈粳屬性、掌握廣親和品種和中間型材料的秈粳分化程度對水稻育種極為重要。基于秈稻和粳稻全基因組插入/缺失位點差異特異開發(fā)的InDel分子標(biāo)記，在鑒定水稻的秈粳屬性方面有其明確的分子機(jī)制[23-24]。蔡星星等[25]從SHEN 等[26]報道的InDel 分子標(biāo)記中選擇了45 對引物對栽培稻及野生稻進(jìn)行了檢驗，結(jié)果表明InDel標(biāo)記可以用于水稻秈粳屬性的鑒定。趙偉等[27]利用InDel標(biāo)記揭示了水稻的秈粳分化機(jī)制。徐建欣等[28]利用InDel 標(biāo)記鑒定了云南陸稻品種的秈粳屬性。上述研究表明，InDe1分子標(biāo)記是一種十分有效可靠的分子標(biāo)記，可用于測定并分析稻種資源的秈粳屬性以及親緣關(guān)系，同時為培育具有亞種間雜種優(yōu)勢的秈粳雜交稻提供了可行的分子技術(shù)。

本研究通過均勻分布在水稻基因組12條染色體上的30對InDel標(biāo)記，對360份適合江西省地區(qū)種植推廣的種質(zhì)粳稻種質(zhì)資源的秈粳屬性進(jìn)行了分析，每對引物均檢測到秈稻特異性帶、粳稻特異性帶和秈粳雜合型條帶等3 種帶型，計算每份材料的秈稻基因型頻率以判定其秈粳屬性，360 份粳稻種質(zhì)資源被判定為典型粳稻、粳稻、偏粳和偏秈4種類型，包括典型粳稻312份、粳稻42份、偏粳型5份、偏秈型1份。可見，秈型成分集中分布于0～10%，所鑒定的粳稻種質(zhì)資源中基本都是含有粳型基因頻率的粳型稻，這些品種沒有或者引入了極少的秈型血緣?！熬尽焙汀捌i”這2個不同的群，通過主成分平面散點圖在空間上被分隔成2個獨立的區(qū)域，分與秈粳屬性鑒定結(jié)果高度一致。

3.2 粳稻種質(zhì)資源秈粳基因頻率與表型性狀的相關(guān)性

育種研究人員利用秈稻與粳稻進(jìn)行雜交育種，發(fā)揮秈粳亞種間強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢，既提高了水稻產(chǎn)量，又豐富了品種的遺傳構(gòu)成，解決了遺傳基礎(chǔ)狹窄的難題，為水稻新品種選育提供了保障[29]。因此，通過秈稻與粳稻進(jìn)行雜交育種的方式，“適量”的引入秈稻血緣是培育高產(chǎn)粳稻新品種的有效途徑，但是如何把握“適量”的程度，更加有效地發(fā)揮亞種間雜交育種的優(yōu)勢，仍需進(jìn)行深入地研究。為更好地探明“適量”的程度，本研究將360份適合江西省地區(qū)種植推廣的種質(zhì)粳稻種質(zhì)資源的秈型基因頻率與8個表型性狀進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明，除了結(jié)實率，其他粳稻種質(zhì)資源的秈型基因頻率與7個表型性狀均存在顯著或極顯著相關(guān)，其中，秈型基因頻率與穗長、每穗粒數(shù)、粒長、谷粒形狀呈正相關(guān)，與單株有效穗數(shù)、理論產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，說明粳稻種質(zhì)資源秈粳屬性與表型性狀間存在高度的相關(guān)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，受秈型血緣影響的千粒質(zhì)量和理論產(chǎn)量基本上都是在Fi≥0.2以后明顯增加負(fù)向效應(yīng)；在Fi＜0.2范圍內(nèi)，F(xiàn)i與千粒質(zhì)量、理論產(chǎn)量的相關(guān)系數(shù)或顯著水平降低，F(xiàn)i在0.1左右各性狀變異幅度較廣，育種選擇機(jī)會較多。基于此，引入10%左右的秈型血緣可能有利于控制其對粳稻產(chǎn)量的負(fù)面作用，在保障粳稻品質(zhì)的前提下，促進(jìn)粳稻的產(chǎn)量和品質(zhì)在更高程度上統(tǒng)一起來。

3.3 江西粳稻育種核心種質(zhì)的篩選

2008 年以來，江西省政府將“秈改粳”工程作為糧食增產(chǎn)的重要舉措，而東北、江浙等地培育并大面積推廣的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)常規(guī)粳稻品種不適應(yīng)江西省高溫生長環(huán)境，這些顯著差異決定了必須結(jié)合本地實際開展核心基礎(chǔ)理論和關(guān)鍵應(yīng)用技術(shù)研究，當(dāng)前江西省發(fā)展粳稻生產(chǎn)急需本土化的優(yōu)質(zhì)粳稻品種[30]。因此，從國內(nèi)外粳稻主產(chǎn)區(qū)引進(jìn)粳稻種質(zhì)資源，積極開展粳稻資源的適應(yīng)性篩選和鑒定核心育種資源是秈改粳的重要途徑。

從秈型基因頻率與8個表型性狀的相關(guān)分析可以看出，F(xiàn)i＜0.2范圍內(nèi)，F(xiàn)i與千粒質(zhì)量、理論產(chǎn)量的相關(guān)系數(shù)或顯著水平降低。因此，為了盡量降低秈型基因頻率的負(fù)向效應(yīng)，存在Fi＜0.2 范圍內(nèi)對360 份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，選取出123份粳稻品種作為江西省“秈改粳”育種核心親本材料。這些粳稻核心親本材料的秈型基因頻率在8%至16%，其中品種農(nóng)林11、05-0549、靖粳7 號、龍稻16、遼鹽283、2014H002、中作9936、鎮(zhèn)糯19 號、富禾66、松粳22、中花15 號、遼星3 號、贛榆8286、武運3264、稻花香1號、花117、莊育3 號、寧粳24、遼粳25、龍稻5 號、綏粳1 號、遼鹽241、龍粳2 號、沈稻5 號、沈農(nóng)606、吉農(nóng)大888、滇靖8 號、九稻68、吉粳502、蘇秀10 號、通育401、農(nóng)林11、龍稻22、中遼9052、丹星稻1 號的結(jié)實率和理論產(chǎn)量分別在88%及11 t/hm2以上，特別是品種龍稻5號、綏粳1號、遼鹽241、龍粳2號，其產(chǎn)量高達(dá)13 t/hm2，而品種松粳22、農(nóng)林11、綏粳1號、稻花香1號的粒型（長寬比）為2.8以上，達(dá)到了秈稻優(yōu)質(zhì)米的標(biāo)準(zhǔn)之一。此粳稻育種核心親本庫的構(gòu)建，解決了目前江西省粳稻生產(chǎn)上存在的問題，尤其是江西省發(fā)展粳稻缺乏本土化品種問題，為江西省有效合理利用粳稻資源改良水稻品種提供了理論依據(jù)及育種材料，將產(chǎn)生巨大的社會效益。