李 萍，滕長才，丁寶軍，劉玉皎，侯萬偉，何 濤

（1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院（青海省農(nóng)林科學(xué)院），青海 西寧 810016；2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016）

【研究意義】氮素是蠶豆生長必需的營養(yǎng)元素之一，蠶豆氮素的來源主要有根瘤固氮、土壤氮和肥料氮[1]，雖然肥料氮為作物獲得高產(chǎn)提供了可能，但過度的施用和依賴造成土壤板結(jié)、肥力下降，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境帶來巨大的負(fù)面影響而引起關(guān)注[2-3]。根瘤菌（Rhizobium）是一類能夠固定大氣中游離態(tài)的氮與豆科植物建立共生關(guān)系的α-和β-變形菌[4]，蠶豆-根瘤菌構(gòu)成的共生固氮體系可為蠶豆提供生長所需80%的氮源，一個生長季節(jié)能夠固定并提供約200 kg/hm2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大豆（100 kg/hm2）[5]，因此，根瘤菌共生固氮的研究成為生命科學(xué)的研究熱點。然而根瘤菌與豆科植物之間有很強(qiáng)的選擇性，只有因地制宜的篩選與宿主相匹配的根瘤菌，才能形成有效共生固氮體系，生物固氮作用才得以充分發(fā)揮。【前人研究進(jìn)展】根瘤菌-豆科作物的相互作用不僅取決于宿主植物自身的結(jié)瘤親和性，更與限制結(jié)瘤環(huán)境因子有直接的關(guān)系[6-7]。干旱是影響作物生長的一個全球性問題，在干旱和半干旱地區(qū)，缺水使根瘤菌的繁殖受到抑制難以與豆科植物共生結(jié)瘤，是限制結(jié)瘤的重要因子之一。然而在這種干旱環(huán)境中卻能孕育出在逆境中生長繁殖并結(jié)瘤、固氮的耐旱根瘤菌[8-9]，表現(xiàn)出與環(huán)境良好的適應(yīng)性。研究者們發(fā)現(xiàn)，接種與之共生的高效根瘤菌不僅能減少干旱缺水所造成的細(xì)胞膜損傷、維持滲透壓、減少氧化脅迫，顯著提高作物的抗旱能力，而且能減少化學(xué)氮肥的施用，提高豆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。在農(nóng)業(yè)實際生產(chǎn)中，大豆[10]、豌豆[11]、花生[12]、苜蓿[13]等豆科植物與高效根瘤菌接種提高其抗逆性、結(jié)瘤固氮能力和產(chǎn)量的研究報道屢見報端，已成為一項重要的農(nóng)業(yè)措施?！颈狙芯壳腥朦c】蠶豆（Vicia fabaL.）屬蝶形花科野豌豆屬，是青海省重要的糧食、蔬菜、副食、飼料和輪作倒茬、間套種養(yǎng)地作物，在“化肥減量增效”和“全省打造全域綠色有機(jī)農(nóng)畜產(chǎn)品示范省”行動中，蠶豆的生物固氮作用發(fā)揮著非常重要的作用[14]。有關(guān)蠶豆根瘤菌的研究報道主要涉及生物地理分布及形成機(jī)制[15]、系統(tǒng)發(fā)育及多樣性[16]，生物和非生物脅迫少有研究[17]，而針對青海干旱地區(qū)耐旱根瘤菌篩選與評價尚未見報道。本研究以耐旱菌株接種提高蠶豆抗旱性的題科學(xué)問為出發(fā)點，廣泛采集干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌并對其耐旱性進(jìn)行篩選和評價?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌的耐旱性進(jìn)行研究，試圖從中篩選出具有較強(qiáng)抗逆性的根瘤菌株，為下一步開展蠶豆耐旱根瘤菌的接種應(yīng)用，充分發(fā)揮根瘤菌與蠶豆共生固氮效率提供前期技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020 年6—7 月，對青海省干旱農(nóng)業(yè)蠶豆種植區(qū)的海東市1 區(qū)（樂都區(qū)）、4 縣（化隆縣、循化縣、民和縣、互助縣）、西寧市3 縣（湟中縣、大通縣、湟源縣）、海南藏族自治州1 縣（共和縣）、1 鎮(zhèn)（塘格木鎮(zhèn)）進(jìn)行蠶豆根瘤采樣（表1）。2020 年8 月—2021 年1 月，對72 份根瘤樣品進(jìn)行分離，經(jīng)滅菌處理YMA 剛果紅平板上劃線純化至獲得單個典型菌落，革蘭氏染色、鏡檢、初步鑒定后獲得49 份蠶豆根瘤菌，于10%甘油中-80 ℃保存。

表1 蠶豆根瘤菌菌株及其來源Tab.1 Rhizobium strains isolated from faba bean and information of their source

續(xù)表Continued tab.

1.2 試驗設(shè)計

對采集分離純化后的蠶豆根瘤菌進(jìn)行耐旱性評價，在YMA 培養(yǎng)液中加入不同濃度的聚乙二醇（PEG-6000）人工模擬干旱條件，設(shè)置4個不同的PEG-6000滲透勢水平：（1）僅使用YMA液體培養(yǎng)液，滲透勢為0 mPa；（2）10%PEG-6000 的YMA 液體培養(yǎng)液，滲透勢為-0.2 mPa；（3）15%PEG-6000 的YMA 液體培養(yǎng)液，滲透勢為-0.4 mPa；（4）20%PEG-6000的YMA液體培養(yǎng)液，滲透勢為-0.6 mPa，以0 mPa PEG-6000為對照（CK），每水平設(shè)3次重復(fù)。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌懸液制備 將保存于10%甘油中的菌株接入YMA 固體平板培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，分別挑取1 環(huán)接種到已滅菌的YMA 液體培養(yǎng)液中，置于28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，測定根瘤菌懸浮液的光密度值（OD600值約0.8～0.9）。以較低OD600值菌液為基準(zhǔn)，將各菌液加無菌水稀釋制成光密度值一致的菌懸液，即為試驗用的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液。

1.3.2 耐旱性測定 以菌株在滲透勢下能否增殖為劃分根瘤菌耐旱標(biāo)準(zhǔn)。吸取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)菌懸液接入不同PEG-6000濃度的YMA液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，7 d后混勻取樣，在600 nm下測定其OD值，以O(shè)D值的大小評價其生長繁殖狀況，測定前用相應(yīng)濃度PEG-6000的YMA培養(yǎng)液對儀器進(jìn)行調(diào)零處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆根瘤菌耐旱性的多樣性分析

2.1.1 蠶豆根瘤菌耐旱性分析 以菌株在PEG-6000滲透勢下能否增殖為劃分根瘤菌耐旱標(biāo)準(zhǔn)，供試菌株在模擬干旱脅迫0～-0.6 mPa 下各滲透勢水平下的濁度及相對值（即各菌株在各水平下的OD600值與相應(yīng)0 mPa的OD600值的比值）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（表2）。

表2 供試菌株在干旱模擬條件下的吸光值（OD600）Tab.2 Turbidity of the tested strain under simulated drought conditions

干旱缺水對根瘤菌與豆科植物建立結(jié)瘤固氮共生體系具有重要影響。本研究結(jié)果顯示，隨著PEG6000 濃度的增加，各菌株OD 值總體上呈下降趨勢，PEG6000 濃度在10%、15%、20%時，與對照菌株的OD 值比較下降幅度分別為3.40%～98.38%、3.74%～72.45%、17.94%～81.49%，平均下降27.50%、39.06%、51.32%。隨著干旱程度的增加，菌株生長受到的抑制作用逐漸增大。同時，筆者也發(fā)現(xiàn)在PEG6000 濃度為10%時，有3 個菌株（HD-13、XN-25、HN-43）的OD 值并沒有下降，反而與對照相比OD值上升，為26.05%、1.52%、0.56%。比較不同菌株OD值下降結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一個滲透水平PEG6000濃度條件下，菌株間OD 值下降率存在較大差異，其中來自于典型干旱農(nóng)業(yè)區(qū)的海東市樂都區(qū)瞿曇鎮(zhèn)菌株號為HD-21 和來自于西寧市湟中縣李家山鎮(zhèn)菌株號為XN-22 的OD 值下降率明顯低于其它菌株，說明這2 株根瘤菌能夠耐受一定程度的干旱，可以作為下一步耐旱菌株接種蠶豆提高耐旱性的實驗的材料。

2.1.2 干旱脅迫下蠶豆根瘤菌生長分析 對不同PEG6000滲透勢水平下測定的菌懸液濁度值進(jìn)行方差分析，考察干旱模擬脅迫下供試的49份蠶豆根瘤菌菌株耐旱性的顯著性差異（表3）。方差分析表明，以PEG6000模擬干旱脅迫條件，以不脅迫0%為對照，設(shè)定10%、15%、20%的脅迫梯度間在1%水平上差異極顯著，說明本研究設(shè)定的脅迫梯度能較好區(qū)分菌株的耐旱能力，結(jié)果可靠。同時方差分析還顯示干旱對蠶豆根瘤菌生長存活的影響差異極顯著（P＜0.000 1）。

表3 干旱模擬條件下供試菌株生長的方差分析Tab.3 Variance analysis of rhizobia growth under drought conditions

同時，用平均連鎖法（UPGMA）對參試的49 份蠶豆根瘤菌菌株耐旱能力相似性進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果表明：來自青海干旱地區(qū)的49 份菌株的耐旱能力可分為3 類群（圖1）。第一類群由8 個菌株組成，均來自海東市干旱地區(qū)，其中6株來自海東市化隆縣和循化縣，2株來自海東市民和縣；第二類群由38個菌株組成，其中3株來自海東市民和縣，2株來自海東市樂都縣，10株來自西寧市湟中縣，4株來自海東市互助縣，1株來自西寧市大通縣，12株來自海南州共和縣，6株來自西寧市湟源縣；第三類群由3個菌株組成，1株來自西寧市湟中縣，2株來自海南州共和縣和海南州塘格爾鎮(zhèn)。

圖1 供試菌株耐旱能力聚類分析結(jié)果Fig.1 Dendrogram showing relationship among rhizobia strain of dry-tolerant

綜合方差分析和聚類結(jié)果表明：青海干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌耐旱能力呈現(xiàn)多樣性，來自青海不同干旱地區(qū)的蠶豆根瘤菌的干旱耐受能力不盡相同，并且來自同一地區(qū)的蠶豆根瘤菌之間的耐旱能力也呈多要性特征。

2.2 干旱條件下菌株生長模式分析

PEG-6000 模擬干旱條件下供試菌株的生長模式也不盡相同，以0%PEG-6000 培養(yǎng)液為對照，不同脅迫條件下供試菌株主要表現(xiàn)為3種生長模式。

第一種模式，在ψ=-0.2 mPa（10%PEG6000）時，菌株的生長不但沒有被抑制，其濁度值反而高于CK（ψ=0 mPa）（圖2），這些菌株是HD-13、XN-25、HN-43，占供試菌株的6.1%。在干旱條件下，這3 種菌株在10% PEG 處理下的生長狀況優(yōu)于對照，說明培養(yǎng)液10%的滲透勢對根瘤菌菌株生長的影響不大，而且適當(dāng)?shù)拿{迫反而對根瘤菌菌株的生長有促進(jìn)作用，這可能是這些菌株與宿主蠶豆植株長期生長在干旱環(huán)境中對其生存環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。同時發(fā)現(xiàn)，菌株號為HD-13的菌株分離自海東市民和縣西溝鄉(xiāng)，宿主蠶豆為地膜栽培種植。蠶豆地膜覆蓋栽培技術(shù)是青海省干旱農(nóng)業(yè)區(qū)蠶豆生產(chǎn)的一項高產(chǎn)栽培技術(shù)，地膜栽培下干旱地區(qū)土壤濕潤，適合類生菌的生長及繁殖；菌株號為HN-43的菌株分離自海南州共和縣鐵蓋村，宿主蠶豆種植在不施肥的青稞茬農(nóng)田，不同的土壤環(huán)境催生了具有抗性的菌株，使菌株具有較好的耐旱性。第二種模式，菌株HD-1，HD-11，HD-21，XN-22，HN-50，HN-59，這6個菌株一方面存在一個中間致死滲透勢，即菌株在-0.4 mPa滲透勢時存活數(shù)量減少或增殖能力減弱，而在-0.6 mPa這一更低滲透勢時存活數(shù)量又增高（圖3）。第三種模式，隨著滲透勢的下降，蠶豆根瘤菌培養(yǎng)液的吸光度值也隨之下降（圖4）。這些菌株HD-2，HD-3，HD-13，HD-15，HD-19，XN-24，XN-26，XN-29，XN-30，XN-31，XN-32，XN-33，XN-34，HD-38，HD-40，HD-41，XN-42，HN-45，HN-46，HN-47，HN-49，HN-51，HN-54，HN-55，HN-57，HN-58，XN-88，XN-89，XN-90，XN-92，XN-95，XN-98，共32個菌株，占供試菌株的65.3%。

圖2 第一類生長模式（菌株：HD-13）Fig.2 The first kind of growth model（strain：HD-13）

圖3 第二類生長模式（菌株：HD-11）Fig.3 The second kind of growth model（strain：HD-11）

圖4 第三類生長模式（菌株：HD-41）Fig.4 The third kind of growth model（strain：HD-41）

3 討論與結(jié)論

水分是土壤微生物能否正常生長的最重要的限制因素之一，豆科植物-根瘤菌共生關(guān)系的形成及其活性對干旱十分敏感，土壤干旱缺水使根瘤菌的存活受到影響。本論文結(jié)果表明青海干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌資源中存在耐旱性較強(qiáng)的菌株，耐旱能力呈現(xiàn)多樣性，同時從側(cè)面反映出利用PEG6000人工模擬干旱環(huán)境篩選耐旱根瘤菌的方法是可行的。以0%PEG6000 的YMA 液體培養(yǎng)液為對照，考察根瘤菌在不同梯度滲透濃度下的生長情況發(fā)現(xiàn)，分離自青海不同干旱地區(qū)的蠶豆根瘤菌在沒有滲透干旱脅迫下其生長繁殖能力存在差異，不同根瘤菌在相同滲透脅迫環(huán)境下和同一根瘤菌在不同脅迫環(huán)境下其生長繁殖能力均存在差異，并且隨著干旱脅迫強(qiáng)度的加深，所有菌株生長繁殖能力均出現(xiàn)不同程度的下降。分析原因筆者認(rèn)為青海特殊的地理環(huán)境造就了與之長期共生蠶豆根瘤菌的生長多樣性，加之土壤是一個不連續(xù)的高度異質(zhì)體，這種高度異質(zhì)環(huán)境使根瘤菌在土壤中所處的微環(huán)境存在差異，這些差異使蠶豆根瘤菌向不同方向進(jìn)化，從而表現(xiàn)出耐旱能力多樣性特點。同時筆者也認(rèn)為這種多樣性分布的產(chǎn)生是由于當(dāng)?shù)胤N植制度、土地利用狀況、土壤類型等方面差異使蠶豆根瘤菌表現(xiàn)出耐旱能力多樣性特點。與此同時，分離自同一地區(qū)不同蠶豆品種的根瘤菌耐旱能力也呈現(xiàn)多樣性，這可能與根瘤菌結(jié)瘤的宿主專一性及品種差異有關(guān)。遲玉成[18]研究山東省花生土著根瘤菌耐旱性中指出，山東省花生種植區(qū)存在具有較強(qiáng)耐干旱的菌株，來自同一地區(qū)的花生根瘤菌耐旱能力呈現(xiàn)多樣性，來自同一地區(qū)、不同花生品種的根瘤菌耐旱能力也呈現(xiàn)多樣性。這一結(jié)論與本研究得到的結(jié)果一致。裴曉峰[19]對耐旱大豆根瘤菌研究中同樣也得到相似結(jié)論。

逆境條件下分布的根瘤菌表現(xiàn)出與環(huán)境良好的適應(yīng)性，根瘤菌株的耐旱性與其分離地點相關(guān)，是菌株長期適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的結(jié)果，這一觀點在本研究中也得到了證實。本論文中大多數(shù)菌株生長的最適PEG 濃度在10%以下，說明10%的滲透勢對根瘤菌菌株生長的影響不大，而且適當(dāng)?shù)拿{迫反而對根瘤菌菌株的生長有促進(jìn)作用，這可能是這些菌株與宿主蠶豆植株長期生長在干旱環(huán)境中對其生存環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。相似的結(jié)論在黃明勇等[20]對花生根瘤菌耐旱性研究和韓梅[21]對蠶豆耐旱性研究中也有過報道。本論文發(fā)現(xiàn)隨著滲透勢濃度的增加，6 個菌株（HD-1，HD-11，HD-21，XN-22，HN-50，HN-59）在-0.4 mPa 滲透勢時存活數(shù)量減少或增殖能力減弱，而在-0.6 mPa這一更低滲透勢時存活數(shù)量又增高。本研究中存在的這種現(xiàn)象與曾小紅[22]在用PEG6000人工模擬干旱條件研究金沙江河谷地區(qū)豆科樹種根瘤菌耐干熱中得到的結(jié)論一致。Van Rensburg[23]在研究中認(rèn)為這是由于中間滲透勢使細(xì)胞部分失水使其功能酶造成損傷，而在-0.6 mPa更低的滲透勢情況下存活率提高是由于酶的正常功能受到保護(hù)所致。本研究最終篩選獲得5個比較耐干旱的菌株，分別分離自海東市民和縣的菌株HD-11，海東市樂都區(qū)的菌株HD-21，西寧市湟中縣的菌株XN-22，海南州共和縣的菌株HN-50，海南州塘格爾鎮(zhèn)的菌株HN-59，它們在-0.6 mPa（即20%PEG）的滲透勢水平仍能生長發(fā)育，菌液濁度在68%以上。可以間接推斷上述菌株在干旱脅迫時對寄主植物具有較強(qiáng)的浸染能力，有利于寄主植物在干旱環(huán)境中獲取更多的養(yǎng)分，從而提高了蠶豆植株的抗旱性。

同時，蠶豆根瘤菌共生體系的固氮過程從根本上是由根瘤菌、蠶豆和所在環(huán)境共同決定的，土壤復(fù)雜的理化性和各種生物因素，勢必對根瘤菌耐旱性造成影響，在下一步的研究工作中需要考慮土壤理化性對耐旱菌株的影響。