聶春桃，尚相龍，楊梓曼，陳 環(huán)，瞿明仁，游金明，宋小珍

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

【研究意義】瘤胃是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的主要場(chǎng)所，瘤胃中包含原蟲(chóng)、細(xì)菌和真菌等微生物，這些微生物可降解飼料纖維，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，并利用含氮物質(zhì)合成微生物蛋白，為動(dòng)物提供蛋白質(zhì)和能量[1]。因此，瘤胃微生物發(fā)酵對(duì)反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)意義重大，瘤胃發(fā)酵功能也成為研究反芻動(dòng)物消化代謝的一大熱點(diǎn)。在過(guò)去的幾十年里，一些化學(xué)飼料添加劑如抗生素、離子載體等被應(yīng)用于反芻動(dòng)物飼養(yǎng)，以調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。但抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性，且其藥物殘留及毒副作用對(duì)畜禽和人類的健康造成了很大的負(fù)面影響。自2020 年1 月1 日起，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已發(fā)布公告，明確禁止在飼料中添加抗生素。因此，近年來(lái)，尋找替代抗生素的天然飼料添加劑，在動(dòng)物生產(chǎn)及改善瘤胃微生物發(fā)酵方面具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物提取物是采用適當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒ǎ灾参餅樵咸崛』蚣庸ざ傻暮幸环N或多種有效成分的混合物[2]。研究表明，植物提取物具有高效、天然、無(wú)毒副作用的特性，且含有多種具有抗菌活性的次級(jí)化合物，如皂苷、生物堿、黃酮類化合物等[3]，這些次生代謝產(chǎn)物可調(diào)控并改善反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)酵模式，提高飼料消化率及飼料中蛋白質(zhì)的利用率，改善動(dòng)物健康，從而成為化學(xué)飼料添加劑的天然替代品[4]。其中，黃酮類化合物是普遍存在于豆科植物中的多酚類次生代謝化合物，具有抗氧化、抗菌、預(yù)防瘤胃酸中毒等作用，可以促進(jìn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能和機(jī)體健康。研究表明，黃酮類化合物能對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物的主要消化酶活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)瘤胃消化代謝發(fā)揮調(diào)控作用[5]。還有研究表明，異黃酮類化合物可以升高反芻動(dòng)物的血液睪酮水平，改善瘤胃的微生物代謝，從而來(lái)促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)[6]。

【本研究的切入點(diǎn)】葛根素（Puerarin，Pue）是葛根的主要活性成分，屬異黃酮物質(zhì)，由豆科植物葛及野葛的根中提取而得?，F(xiàn)代藥理研究表明，葛根素具有提高免疫力、改善微循環(huán)及心臟保護(hù)等作用。龔志剛等[7]研究報(bào)道，在糖尿病大鼠體內(nèi)補(bǔ)充葛根素能夠改善其抗氧化能力，清除自由基，降低糖尿病大鼠血糖。李奕萱等[8]也有研究表明葛根素注射液可以降低模型小鼠的高血糖和高血脂。尚含樂(lè)等[9]研究表明葛根素可以提高肉牛在高溫環(huán)境下中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的表觀消化率，促進(jìn)肉牛脂肪的代謝。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于葛根素對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵功能的影響的報(bào)道很少，所以本試驗(yàn)以4 頭瘤胃瘺管牛為研究對(duì)象，采用體外培養(yǎng)法，探究不同水平葛根素對(duì)肉牛瘤胃體外發(fā)酵特性及養(yǎng)分降解率的影響，旨在篩選葛根素的適宜添加濃度，為開(kāi)發(fā)葛根素作為飼料添加劑在肉牛生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、飼糧及飼養(yǎng)管理

選用4頭健康的安裝有瘤胃瘺管的錦江黃牛（體質(zhì)量大約250 kg），作為試驗(yàn)中瘤胃液的供體。肉牛單欄飼養(yǎng)，每天飼喂2 次（08：00，18：00），自由飲水?；A(chǔ)飼糧精粗比為5∶5。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis）

1.2 試驗(yàn)材料

葛根素采購(gòu)于西安某生物公司，其中葛根素含量經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)為98%。

1.3 樣品的采集與制備

于晨飼前1 h，每頭牛取等量瘤胃內(nèi)容物樣品，混合后用4 層紗布快速過(guò)濾至預(yù)熱處理后的保溫瓶，用緩沖液（2∶1，V/V）稀釋，該緩沖溶液按Menke和Steingass[10]的描述制備。稀釋后迅速分裝至提前預(yù)熱好的發(fā)酵瓶中（發(fā)酵瓶中裝有粉碎過(guò)40目的基礎(chǔ)飼糧0.4 g及對(duì)應(yīng)比例的葛根素），每個(gè)發(fā)酵瓶中加40 mL混合液，將其置于（39±0.50）℃的水浴搖床中進(jìn)行體外發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h。

根據(jù)基礎(chǔ)日糧中中葛根素添加量的不同，將試驗(yàn)分為6 組，葛根素的添加水平分別為0（對(duì)照）、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)。

1.4 測(cè)量指標(biāo)與方法

從培養(yǎng)開(kāi)始，每隔2 h記錄1次產(chǎn)氣量，累計(jì)24 h的產(chǎn)氣量之和即為總的產(chǎn)氣量。培養(yǎng)24 h后采集樣品，立即用S-320型酸度計(jì)測(cè)定體外瘤胃液的pH。然后將培養(yǎng)液用400目尼龍袋過(guò)濾（尼龍網(wǎng)的質(zhì)量已知），用蒸餾水將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的殘余物沖入尼龍袋上，封好口后將尼龍袋放入65 ℃烘箱中烘8 h，干燥器中冷卻30 min后稱質(zhì)量。氨氮濃度用比色法測(cè)定。VFA 采用氣相色譜儀器測(cè)定。瘤胃微生物蛋白（MCP）用考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定。飼糧及瘤胃液殘?jiān)写值鞍踪|(zhì)（CP）、干物質(zhì)（DM）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）等指標(biāo)，其測(cè)定方法參照張麗英主編的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》進(jìn)行。

瘤胃養(yǎng)分降解率=［（降解前日糧某養(yǎng)分含量—降解24 h后某養(yǎng)分含量）/降解前日糧某養(yǎng)分含量］×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2004 對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 23 中的單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 葛根素對(duì)肉牛瘤胃體外養(yǎng)分降解率的影響

由表2可知：與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的DM 降解率分別顯著升高了17.65%、26.47%、29.41%、23.53%、23.53%（P＜0.05）。各處理組的ADF 降解率都無(wú)顯著變化（P＞0.05）。0.04%葛根素組和0.16%葛根素組的NDF降解率分別顯著升高了30.77%、53.85%（P＜0.05），其他組無(wú)顯著變化（P＞0.05）。0.04%、0.08%和0.16%處理組的粗蛋白降解率分別顯著升高了10.64%、8.51%、8.51%（P＜0.05），0.01%、0.02%處理組的粗蛋白降解率變化不明顯（P＞0.05）。

表2 葛根素對(duì)肉牛瘤胃體外養(yǎng)分降解率的影響Tab.2 The effect of puerarin on on rumen nutrient degradability in vitro of beef cattle

2.2 葛根素對(duì)肉牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

由表3 可知，總產(chǎn)氣量和pH：試驗(yàn)組的總產(chǎn)氣量和pH 跟對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化（P＞0.05），并且pH 都維持在正常范圍內(nèi)（6～7）。菌體蛋白：添加葛根素后，試驗(yàn)組的菌體蛋白含量分別顯著升高了8.64%、11.73%、9.26%、8.64%、8.02%（P＜0.05）。氨態(tài)氮：0.02%、0.04%、0.08%和0.16%處理組的NH3-N含量顯著下降，分別比對(duì)照組降低14.20%、14.02%、9.73%、8.50%（P＜0.05）。VFA：跟對(duì)照組相比，乙酸含量分別顯著降低1.98%、2.43%、2.53%、2.43%、2.19%（P＜0.05）。0.04%處理組的丙酸顯著升高6.08%（P＜0.05），其他處理組無(wú)顯著變化（P＞0.05）。所有處理組的丁酸無(wú)顯著變化（P＞0.05）。0.02%、0.04%、0.08%和0.16%處理組的乙酸/丙酸值分別顯著下降5.59%、7.94%、6.76%、5.59%（P＜0.05）。總揮發(fā)性脂肪酸的含量無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

表3 葛根素對(duì)肉牛瘤胃體外發(fā)酵指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of puerarin on rumen fermentation indexes in vitro of beef cattle

3 討論與結(jié)論

3.1 葛根素對(duì)肉牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的影響

瘤胃養(yǎng)分降解率代表著該飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中被微生物轉(zhuǎn)化和利用的能力。一般情況下，降解率越高，動(dòng)物對(duì)飼料的利用越好[11]。本結(jié)果顯示，添加一定水平的葛根素可提高飼糧干物質(zhì)、粗蛋白、ADF的降解率，分析可能與葛根素的類雌激素作用有關(guān)。葛根素屬異黃酮類化合物，化學(xué)名稱為4，7-二羥基-8-β-D-葡糖基異黃酮，由于它們與17β-雌二醇相似，這些多酚類化合物屬于植物雌激素組，具有類雌激素的作用[12]。先前的研究表明，異黃酮植物雌激素能夠提高動(dòng)物的機(jī)體免疫力和繁殖性能、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高其飼料轉(zhuǎn)化率，影響瘤胃的代謝[13-14]。任皓威等[15]也有研究表明，飼料中的黃酮類化合物對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物主要消化酶的活性有直接影響作用，可以促進(jìn)瘤胃的消化代謝，對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生調(diào)控作用。牟曉玲等[16]研究大豆黃酮對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響，研究表明30 mg/kg和50 mg/kg大豆黃酮能顯著提高DM降解率和粗蛋白降解率。這些都與本研究結(jié)果一致。

3.2 葛根素對(duì)肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

發(fā)酵產(chǎn)氣量與瘤胃中的飼糧養(yǎng)分水平及成分有關(guān)，反芻動(dòng)物瘤胃微生物的活性越高，飼糧中可發(fā)酵養(yǎng)分含量越多，則發(fā)酵總產(chǎn)氣量越高[17]。所以瘤胃微生物的活性和飼料可發(fā)酵的程度也可以通過(guò)總產(chǎn)氣量來(lái)反映。白齊昌等[18]研究沙棘黃酮對(duì)綿羊體外產(chǎn)氣量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，沙棘黃酮添加水平越高，綿羊體外產(chǎn)氣量越多。在本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加葛根素后，瘤胃總產(chǎn)氣量無(wú)顯著變化，其原因可能是不同類型的黃酮類化合物對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物的作用效果不同。劉春龍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高水平的大豆黃酮在一定程度上降低了瘤胃產(chǎn)氣量，但低水平的大豆黃酮有增加產(chǎn)氣量的趨勢(shì)，并分析黃酮類化合物可能對(duì)瘤胃氮代謝的影響有劑量依賴性，高水平黃酮類化合物抑制消化酶的活性，低水平的黃酮類化合物能促進(jìn)瘤胃微生物的代謝。

瘤胃的pH 值對(duì)飼料在瘤胃中的消化吸收有很重要的影響，它是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)，一般情況下，瘤胃中適宜微生物生長(zhǎng)繁殖的pH 值為6～7。瘤胃內(nèi)pH 的穩(wěn)態(tài)不僅影響著動(dòng)物的機(jī)體健康，還決定了反芻動(dòng)物瘤胃最終產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和瘤胃生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性。過(guò)酸過(guò)堿的環(huán)境都有可能導(dǎo)致反芻動(dòng)物機(jī)體健康失調(diào)。本試驗(yàn)添加葛根素后，pH 沒(méi)有顯著變化，pH 在6.81～6.94 變動(dòng)，說(shuō)明添加一定水平內(nèi)的葛根素不會(huì)對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定產(chǎn)生負(fù)面影響。

瘤胃中的MCP 和NH3-N 濃度反映了反芻動(dòng)物對(duì)飼料中的氮源的分解利用情況。反芻動(dòng)物機(jī)體所需蛋白質(zhì)的主要來(lái)源是微生物蛋白。有研究表明，反芻動(dòng)物60%～70%的蛋白質(zhì)由瘤胃微生物蛋白提供[20]。任皓威[15]在研究大豆黃酮對(duì)小尾寒羊增重瘤胃代謝的影響時(shí)指出，大豆黃酮可提高小尾寒羊瘤胃MCP 含量。陳杰等[21]報(bào)道，在雄性湖羊皮下連續(xù)7 d 注射大豆黃酮后，瘤胃微生物含量極顯著升高。本研究中，各個(gè)添加水平的葛根素均顯著增高了瘤胃菌體蛋白的含量，這與上述研究結(jié)果一致。分析可能是因?yàn)楦鸶赜绊懥肆鑫肝⑸锏暮亢突钚?，從而促使它們合成更多的MCP。瘤胃液中氨態(tài)氮既是瘤胃微生物合成MCP的主要氮源，也是內(nèi)源性蛋白質(zhì)、日糧蛋白質(zhì)和非蛋白氮分解的終產(chǎn)物[22]。反芻動(dòng)物瘤胃MCP 的合成效率跟瘤胃中NH3-N 的水平息息相關(guān)。有研究表明，NH3-N 影響著瘤胃微生物的正常生長(zhǎng)，其最適濃度為6.3～27.5 mg/dL[23]。本試驗(yàn)中瘤胃液NH3-N 濃度跟對(duì)照組相比均顯著降低，這與MCP 的變化趨勢(shì)是相反的，也進(jìn)一步提示了添加葛根素可能促進(jìn)了瘤胃微生物對(duì)NH3-N 的利用。劉春龍等[24]通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，奶牛飼喂染料木黃酮4 h后，瘤胃氨態(tài)氮濃度顯著降低。

揮發(fā)性脂肪酸是瘤胃微生物發(fā)酵的最終產(chǎn)物，代表了反芻動(dòng)物代謝能量的主要來(lái)源，VFA可提供反芻動(dòng)物總能量需要的70%～80%，其產(chǎn)量和組成是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵方式和能力的直接指標(biāo)[25]。因此，VFA的減少不利于動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要。Mao 等[26]報(bào)道，飼糧中添加10 mg/L 大豆黃酮時(shí)，丙酸含量顯著升高，乙酸/丙酸下降，而總揮發(fā)性脂肪酸沒(méi)有顯著變化，并提出大豆黃酮可通過(guò)調(diào)控瘤胃微生物菌群增加丙酸的產(chǎn)量。劉艷豐等[27]研究發(fā)現(xiàn)，跟對(duì)照組相比，添加沙棘葉黃酮可使綿羊瘤胃VFA、丙酸、丁酸顯著升高。陸燕等[28]研究表明，在體外培養(yǎng)試驗(yàn)中添加植物提取物能夠改變瘤胃的發(fā)酵模式，表現(xiàn)為丙酸和丁酸濃度的顯著升高和乙酸濃度的顯著降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加葛根素后總VFA沒(méi)有顯著變化，但乙酸含量顯著降低，丙酸含量升高，乙酸/丙酸顯著下降，這表明葛根素可以調(diào)控體外瘤胃發(fā)酵模式。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加0.02%、0.04%的葛根素提高了瘤胃微生物蛋白的含量，并能對(duì)瘤胃發(fā)酵模式產(chǎn)生影響。添加0.04%的葛根素提高了干物質(zhì)、NDF 和粗蛋白的降解率。綜合考慮，在本試驗(yàn)條件下，葛根素的最適添加量為0.04%。