李文浩，金夏陽，任 越，肖立成，魏廷虎，桑 巴，郭衛(wèi)興，張雁平*

（1.青海大學(xué) 畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000；3.青海省玉樹市畜牧獸醫(yī)工作站，青海 玉樹 815000）

【研究意義】牦牛遺傳資源是青藏高原及其毗鄰地區(qū)其它畜種資源無可替代的種質(zhì)資源之一，是我國畜禽遺傳資源庫中不可或缺的寶貴資源。然而，牦牛受分布地區(qū)特殊的自然環(huán)境條件以及長期自然選擇和人工選育的影響，分布范圍較窄，屬“區(qū)域物種”。因此，和其他家畜（如黃牛、綿羊、豬等）相比，牦牛的研究和開發(fā)利用相對比較滯后，至今，仍然是一個以自然選擇大于人工選擇的牛種[1]。人們對牦牛遺傳資源的現(xiàn)狀、起源和馴化、分化程度、多樣性豐富程度及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等問題的研究還不夠深入，這極大地限制了牦牛遺傳資源的合理保護和開發(fā)利用?；诂F(xiàn)代分子遺傳學(xué)的原理和方法，利用測序技術(shù)發(fā)展帶來的機遇，對牦牛遺傳資源進行分子評估和系統(tǒng)綜合分析，并提出合理的保護和開發(fā)利用對策，對促進牦牛業(yè)的良性發(fā)展和推進民族地區(qū)的畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義，有助于牦牛遺傳資源的合理保護和開發(fā)利用。玉樹牦牛產(chǎn)于青海省玉樹藏族自治州，屬青藏高原腹地的三江源頭，平均海拔4 200 m 以上，是“世界屋脊”青藏高原的主要組成部分，也是世界牦牛的主產(chǎn)區(qū)之一，不僅具有牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展得天獨厚的自然資源，還擁有中國數(shù)量最多、品質(zhì)最好的牦牛資源，數(shù)量占30%以上，位居全國第一[2-5]。【前人研究進展】近年來，眾多學(xué)者基于USP9Y基因（Ubiquitin-Specific Protease 9 gene on the Y）在不同動物父系遺傳多樣性、起源和進化研究中進行了大量研究[6-10]。而對于牦牛USP9Y基因的研究中，Ma 等[11]使用5 種Y-SNP 標(biāo)記（USP9Y，SRY，UTY，AMELY和OFD1Y）對9 個品種的322 頭牦牛進行了Y 染色體單倍型多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究，表明青海牦牛具有2 個不同的父系遺傳譜系，個體間存在顯著差異，青海牦牛群體的遺傳結(jié)構(gòu)較弱。Y 單倍型總體多樣性為0.538±0.028，表明青海牦牛具有較高的父系遺傳多樣性。Li 等[12]根據(jù)USP9Y、UTY19和SRY4等標(biāo)記對65 頭公牦牛Y 染色體多態(tài)性進行分析，發(fā)現(xiàn)牦牛擁有2 個高度分化的父系支系（即YH1和YH2 vs.YH3）。Ma 等[13]基于USP9Y，SRY4，UTY19，AMELY3，OFD1Y10和INRA189Y染色體特異性標(biāo)記對8 頭公野牦牛進行分析，結(jié)果顯示野牦牛具有豐富的父系遺傳多樣性，其Y 染色體單倍型多樣性（Hd）為0.821±0.101，野牦牛擁有2 個父系遺傳分支。而對于牦牛ND1基因的研究僅見于Shi等[14]對2 個高低海拔的牛屬群體（70 頭西藏牦牛和70 頭宣漢牛）的ND1基因進行測序分析，結(jié)果表明MT-ND1和MT-ND2被認(rèn)為是適應(yīng)高海拔環(huán)境的候選基因?！颈狙芯壳腥朦c】綜上所述，目前基于USP9Y和ND1基因已在牦牛群體內(nèi)部進行不同方面的研究[6-14]，但是尚未見基于2 種標(biāo)記結(jié)合對玉樹牦牛群體的多態(tài)性研究。鑒于此，本研究以分布在青海玉樹地區(qū)的牦牛群體為研究對象，選擇USP9Y和ND1基因并對其PCR 擴增產(chǎn)物直接測序檢測多態(tài)位點，探討USP9Y和ND1基因在玉樹牦牛群體中的多態(tài)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對玉樹牦牛內(nèi)部的遺傳信息基于育種建議，為進一步對牦牛保護性開發(fā)利用牦牛遺傳資源及選育新品種提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

隨機采集青海省玉樹市100 頭牦牛（公牦牛40 份、母牦牛60 份）血樣帶回實驗室，采用“兩步法”從FTA 卡中提取基因組DNA，提取方法參照Zhou 等[15]，后對基因組DNA 進行質(zhì)量與濃度檢測，合格的基因組DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成與PCR擴增

參照牦牛USP9Y、ND1基因編碼序列（GenBank NM_001145509、NC_006380），利用primer3.0在線軟件設(shè)計引物。引物信息見表1。引物由西安楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成。使用時先將引物干粉稀釋成100 pmol/μL作為原液，再取出10 μL引物原液加入90 μL dd H2O，工作液的最終濃度為10 pmol/μL。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

PCR 反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)體系如下：dd H2O 7.6 μL，TaqMaster Mix 10.00 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），基因組DNA 0.8 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57°C 退火30 s（USP9Y引物）或62 ℃退火30 s（ND1引物），72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min 后4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 基因分析及SNP突變位點檢測

將40份公牦牛、60份母牦牛PCR 擴增產(chǎn)物（USP9Y和ND1）送至天津金唯智測序公司進行測序。應(yīng)用MEGA7 軟件比對等位基因序列，并下載青海牦牛相應(yīng)序列進行親緣關(guān)系的構(gòu)建，探明遺傳距離并揭示牛種內(nèi)序列遺傳變異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛USP9Y和ND1基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測

PCR 擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈照射下結(jié)果均和目的片段大小相一致，條帶單一且清晰，表明PCR擴增獲得目標(biāo)片段，可以進行測序。

圖1 牦牛USP9Y基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳Fig.1 Agarose electrophoresis of amplification products of yak USP9Y gene

2.2 USP9Y基因SNP位點的篩查與檢測

將牦牛USP9Y擴增后，PCR 擴增產(chǎn)物送天津金維智生物技術(shù)有限公司進行正反雙向測序，運用Chromas 2.3對擴增序列的測序結(jié)果與NCBI上參考目的片段序列進行比對并校正拼接，得出序列長度為210 bp；使用MEGA7.0 軟件打開測序結(jié)果圖譜尋找雙峰位點（突變位點）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在40 份公玉樹牦牛中均未發(fā)生堿基突變。

圖2 牦牛ND1基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳Fig.2 Agarose electrophoresis of amplified products of yak ND1 gene

2.3 ND1基因SNP位點的篩查與檢測

對玉樹牦牛ND1基因擴增后，運用Chromas 2.3 對擴增序列的測序結(jié)果與NCBI 上參考目的片段序列進行比對并校正拼接，得出序列長度為220 bp，并使用MEGA7.0 軟件打開測序結(jié)果圖譜尋找雙峰位點（突變位點）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉樹牦牛中均未發(fā)生堿基突變。

2.4 青海牦牛部分USP9Y基因多態(tài)位點分析

根據(jù)馬志杰[16]使用USP9Y基因標(biāo)記對中國的682 頭公牦牛（青海、甘肅、云南、新疆和西藏）以及8 頭野牦牛公牛進行多態(tài)性分析，得出在470 bp 的USP9Y基因中僅有1 個多態(tài)位點（g.249C＞T）（圖3），本實驗擴增的目的片段大小為210 bp，未檢測到該多態(tài)位點，表明玉樹牦牛USP9Y 序列前210 bp 處較為保守，無突變位點。

圖3 牦牛USP9Y基因多態(tài)位點Fig.3 Polymorphic loci of USP9Y gene in yak

圖4 基于ND1基因構(gòu)建玉樹牦牛與其他青海牦牛的遺傳關(guān)系Fig.4 The genetic relationship between Yushu yak and other Qinghai yaks was constructed based on ND1 gene

2.5 玉樹牦牛與其他牦牛部分ND1基因親緣關(guān)系分析

通過下載青海范圍內(nèi)牦牛ND1基因序列（高原、雪多、環(huán)湖、阿什旦、大通和野牦牛）并與本實驗中的玉樹牦牛的ND1序列進行構(gòu)樹，并探明其親緣關(guān)系，實驗結(jié)果顯示，玉樹牦牛與高原和雪多牦牛距離較近，而與阿什旦、環(huán)湖、大通和野牦牛遺傳距離較遠，故建議玉樹牦牛與環(huán)湖牦牛種公牛進行適當(dāng)?shù)碾s交，提高玉樹牦牛的遺傳性能。

3 結(jié)論與討論

牦牛毛長皮厚，體矮身健，能夠適應(yīng)特殊的高原環(huán)境，包括缺氧、高寒和低氣壓，被稱為我國的高原之舟。長期的地域分布局限使牦牛的遺傳背景較為清晰，是探明高海拔低氧適應(yīng)性很好的模式動物。Qiu 等[17]在2012 年組裝出第一個牦牛的參考基因組，且分析得出牦牛和普通牛約在490 萬年前就已分化，在牦?；蚪M中共鑒定出85 個正向選擇基因（positive selected genes，PSGs）均與缺氧應(yīng)激和能量代謝有關(guān)，包括2 個重要的調(diào)控子（Adam17和Arg2）和1 個靶基因（Mmp3）與缺氧功能有關(guān)。Ding 等[18]通過采用反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)和western-blot 方法檢測牛和牦牛腦組織中AQP4mRNA 和蛋白的表達是否存在差異，此外也利用免疫組化技術(shù)分析了AQP4在牦牛和牛腦中的定位和表達情況。AQP4可能通過牦牛大腦低表達和維持正常生理功能在抵抗腦水腫中發(fā)揮重要作用，對高海拔與缺氧應(yīng)激有著積極作用。在對牦牛組織形態(tài)學(xué)對于高海拔與缺氧方面也有學(xué)者進行研究，Xiong 等[19]克隆了牦牛中HIF-1和HIF-2完整編碼區(qū)，確定其在幾個組織中的mRNA 表達，并與親緣關(guān)系密切的低海拔牛的表達水平進行比較，研究結(jié)果表明在牦牛中HIF-1和HIF-2的表達量明顯高于普通牛，除肺外，牦牛各器官中HIF-1的表達量均顯著高于普通牛（P＜0.05），但心臟、脾臟和腎臟中HIF-2脾的表達量顯著高于牛（P＜0.05）。

遺傳多樣性研究可以評估動物遺傳變異的程度大小，進而反映動物遺傳多樣性水平的高低，從而為動物遺傳資源的保護和選育策略制定提供科學(xué)依據(jù)。在以往對牦牛USP9Y基因多態(tài)性中，Ma 等[11]在牦牛USP9Y基因中僅發(fā)現(xiàn)1處多態(tài)位點（即g.249 C＞T），而本研究中玉樹牦牛群體中均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點；對于ND1基因，Shi 等[14]研究結(jié)果為在所有的西藏牦牛中均有MT-ND1（SNP m.3，907 C＞T），與高原適應(yīng)呈正相關(guān)（P＜0，006），而在本研究中玉樹牦牛群體中也未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點，究其原因，可能與采樣點與所取的片段長度有關(guān)，或是由于玉樹牦牛所處的位置較為封閉從而使其內(nèi)部的核苷酸多態(tài)性低，與外界牦牛的基因交流較少導(dǎo)致的，Ma等[11]認(rèn)為青海牦牛具有較為豐富的父系遺傳信息，但是本研究中顯示玉樹牦牛作為青海牦牛的代表品種，其USP9Y基因多態(tài)性低，從而導(dǎo)致其遺傳多樣性低。其他作者對牦牛母系遺傳研究結(jié)果認(rèn)為，我國牦牛遺傳多樣性豐富，有2～3 個母系起源[20-27]。但是本研究得出ND1作為線粒體基因組上的一段區(qū)域，在玉樹牦牛群體內(nèi)未檢測到多態(tài)位點，表明該區(qū)域不適于做群體遺傳多態(tài)性研究，而后續(xù)的研究應(yīng)當(dāng)多基于Cyt-b、D-loop 或是線粒體基因組來評估群體的母系遺傳多樣性。根據(jù)馬志杰[16]使用USP9Y基因標(biāo)記對中國的682頭公牦牛和8頭野牦牛公牛進行牦牛的父系遺傳多樣性分析，得出在擴增的470 bp的USP9Y基因中僅有1個多態(tài)位點（g.249 C＞T），本研究中，由于擴增片段的長度受限，未擴增出該多態(tài)位點。由于USP9Y是一個較為保守的基因序列，故今后的研究中應(yīng)當(dāng)調(diào)整引物，增加擴增長度。

牦牛種質(zhì)資源可持續(xù)利用對于高海拔地區(qū)的經(jīng)濟是必不可少的，已有不少研究者應(yīng)對不同地區(qū)不同品種的牦牛遺傳資源提出了相應(yīng)的育種建議[16,28]，目前青海公認(rèn)的牦牛品種有4 個，分別為高原牦牛、玉樹牦牛、環(huán)湖牦牛和雪多牦牛。本研究基于母系ND1基因與USP9Y基因?qū)τ駱潢笈Ｆ贩N進行多態(tài)性檢測時，發(fā)現(xiàn)該品種內(nèi)部父系與母系遺傳結(jié)構(gòu)較為單一，原因可能與該品種生活在海拔較高的地區(qū)，生存環(huán)境較為封閉，導(dǎo)致其內(nèi)部的父本較為單一，本研究結(jié)果顯示，玉樹牦牛與高原和雪多牦牛距離較近，而與阿什旦、環(huán)湖、大通和野牦牛遺傳距離較遠，鑒于此，建議應(yīng)當(dāng)適度的調(diào)用環(huán)湖種公牦?；蚱渌》莸姆N公牦牛對玉樹牦牛進行雜種優(yōu)勢的選育，使其充分的發(fā)揮其應(yīng)有的遺傳潛力。