付鴻博，于斯嘉，袁盛勇，李 杰，楊永超，岳 龍，羅振興

（1.紅河學院 a.生物科學與農(nóng)學學院；b.云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南 蒙自661199；2.吉林省東遼縣農(nóng)業(yè)技術推廣總站，吉林 東遼 136600；3.白城市林業(yè)科學研究院，吉林 白城 137000）

植物生長素在植物的生長發(fā)育過程中至關重要[1]，生長素也是最先被發(fā)現(xiàn)的植物激素，它對植物頂端優(yōu)勢、根系和果實的生長發(fā)育均有重要的影響[2-3]。GH3(Gretchen Hagen 3)基因家族是一類主要的生長素原初反應[4]，可以使吲哚-3-乙酸(IAA)與某些特定的氨基酸形成共軛化合物[5]，從而影響IAA含量，進而對植物生長發(fā)育起到調控作用。首個GH3基因從大豆中鑒定后，陸續(xù)在多種植物中鑒定出GH3基因[6]。隨著GH3基因在不同植物中逐漸被克隆后，其功能分析也逐漸受到關注[7]。GH3基因在植物生長發(fā)育、脅迫響應及影響果實成熟等方面均具有重要的作用。擬南芥AtGH3.11基因編碼的蛋白參與了遠紅光對基因的影響，與植物光形態(tài)建成密切相關[8]，過表達擬南芥GH3基因后葉片的生長狀況和形態(tài)都有所變化[9]，AtGH3.9影響植物初生根的發(fā)育[10]。水稻中GH3基因影響了茉莉酸甲酯的表達[11]，在光形態(tài)建成過程中能同時調控光信號和茉莉酸信號途徑。印度芥菜的BjGH3.1的表達量變化影響了葉片和根系的生長[12]。水稻OsGH3-2調節(jié)生長素和脫落酸水平，提高了抗旱性和抗寒性[13]。過表達擬南芥AtGH3.5基因提高植物系統(tǒng)抗病性，提示GH3基因介導GH3與生長素信號通路的相互作用[14]。在辣椒果實中，GH3蛋白的活性與果實成熟有關，在心包膜和胎盤中高度表達，GH3基因受乙烯誘導，過表達辣椒GH3基因刺激番茄果實提早成熟[15]。

‘棗’是棗屬(Ziziphus)植物的總稱，為鼠李科(Rhamnaceae)植物中最重要的一個屬，在我國，‘棗’(Ziziphus jujuba)主要指棗屬植物之中的一個栽培種，為落葉喬木或灌木。我國棗演化歷史悠久，種質資源豐富，最早起源于黃河中下游地區(qū)，除高海拔和高緯度等地區(qū)外均有分布[16]。目前關于棗生長發(fā)育及果實品質與相關激素的研究主要集中在外源激素調控[17]和內(nèi)源激素含量的變化[18]，關于激素相關分子機制的研究較少。本研究通過生物信息學的方法對棗GH3基因家族做了比較完整的分析，為進一步研究棗GH3基因功能奠定了重要的基礎。

1 材料與方法

1.1 棗GH3基因家族成員鑒定

棗基因組數(shù)據(jù)下載于NCBI數(shù)據(jù)庫，隱馬爾可夫模型(PF03321)下載于Pfam數(shù)據(jù)庫，利用Hmmer 3.0構建本地蛋白數(shù)據(jù)庫并進行搜索，對候選GH3基因的結構域利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行驗證，最終確定得到19個棗GH3基因家族成員。

1.2 棗GH3基因的生物信息學及表達分析

利用在線數(shù)據(jù)庫ProtParam, PSORT II Prediction和SOMPA對最終確定的棗GH3基因家族成員的理化性質、亞細胞定位和二級結構進行分析。利用MEGA 7采用Neighbor-Joining法(Bootstrap replications=1000)對所鑒定到的ZjGH3和擬南芥GH3蛋白進行系統(tǒng)進化樹構建。根據(jù)基因位置信息對棗GH3基因結構和染色體定位進行分析，利用在線數(shù)據(jù)庫MEME和PlantCARE對motif基序和啟動子元件進行分析。利用課題組前期測得的轉錄組數(shù)據(jù)，將棗GH3基因在‘壺瓶棗’果實發(fā)育的三個時期白熟期(H1)，半紅期(H2)和全紅期(H3)的表達情況進行分析。利用TBtools軟件進行可視化繪圖。

2 結果與分析

2.1 棗GH3基因家族成員進化樹分析

為了解棗GH3蛋白的進化關系，利用MEGA 7對所鑒定得到的19個ZjGH3基因家族成員與擬南芥GH3蛋白進行了系統(tǒng)進化樹分析（圖1），結果顯示，根據(jù)擬南芥的分類依據(jù)可將棗GH3基因家族成員分成三大類，其中Clade1包括了5個成員，Clade2和Clade3均包括了7個成員。

圖1 棗和擬南芥GH3基因家族成員的系統(tǒng)進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of GH3 family members from Z.jujuba and Arabidopsis thaliana

2.2 棗GH3基因家族成員的多序列比對及基因結構分析

根據(jù)棗GH3蛋白序列單獨構建了進化樹（圖2A），分類結果與同擬南芥分析時的結果一致，同樣可分為三大類，包括Clade1～Clade3。通過分析棗GH3蛋白結構域發(fā)現(xiàn)（圖2C），19個棗GH3基因家族成員包括了GH3保守結構域，進一步說明19個GH3基因均屬于GH3基因家族成員。為了進一步了解棗GH3基因信息和蛋白特征，對其motif基序（圖2B）和基因結構（圖2D）進行分析，結果表明motif3和motif6保守度最高，只在ZjGH3-4中沒有被預測到，在其他18個ZjGH3中均被預測到，同時發(fā)現(xiàn)ZjGH3-10只包括了motif3和motif6。其次為motif1和motif4，motif1在ZjGH3-1和ZjGH3-10未被預測到，motif4在ZjGH3-9和ZjGH3-10未被預測到?；蚪Y構分析結果表明，所有家族成員的基因結構都較為簡單，包括2到5個外顯子且均有UTR組成。Clade2中ZjGH3-4含有兩個外顯子，其他的6個基因家族成員均含有3個外顯子。Clade1中的5個家族成員的外顯子數(shù)量有差異，ZjGH3-9和ZjGH3-10含有2個外顯子，ZjGH3-13含有3個外顯子，ZjGH3-14含有4個外顯子，ZjGH3-15含有5個外顯子。Clade3中的7個成員的外顯子數(shù)量在3-5個，但外顯子的分布格局相對一致。

圖2 棗GH3基因家族的進化樹(A)、motif基序(B)、保守結構域(C)和基因結構(D)分析Fig.2 Analysis of phylogenetic relationships (A), motif structure (B), conserved domain (C) and gene structure (D) in ZjGH3 gene family

2.3 棗GH3基因家族成員的理化性質分析

對所鑒定的棗GH3基因家族成員進行理化性質和二級結構分析后發(fā)現(xiàn)（表1），ZjGH3基因家族成員所編碼的氨基酸長度范圍較大，為149 aa(ZjGH3-10)～629 aa(ZjGH3-15)，除ZjGH3-1、ZjGH3-4、ZjGH3-10、ZjGH3-13和ZjGH3-16五個家族成員外，其余14個家族成員所編碼的氨基酸長度基本均在600 aa左右。分子量在17.35～71.24 kD之間。等電點在5.21 (ZjGH3-13)～8.90 (ZjGH3-1)，其中ZjGH3-1、ZjGH3-2、ZjGH3-3和ZjGH3-4的等電點大于7，均為堿性蛋白，其余的家族成員均為酸性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)范圍在34.34 (ZjGH3-3)～56.54 (ZjGH3-10)，其中有11個為穩(wěn)定蛋白，8個為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)范圍在80.54 (ZjGH3-10)～94.91(ZjGH3-11)，親水性范圍在-0.501 (ZjGH3-10)～-0.063 (ZjGH3)，表明所有家族成員均為親水性蛋白。亞細胞定位分析后發(fā)現(xiàn)，全部家族成員被定位在細胞質（15個）和細胞核（4個）上。

表1 棗GH3基因家族成員的理化性質及二級結構Table 1 The physicochemical properties and secondary structure of the GH3 gene family of Z.jujuba

對二級結構預測后發(fā)現(xiàn)，全部家族成員均有α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲構成，其中β-折疊的比例最低，分布范圍在（4.01%～6.49%），α-螺旋（35.29%～59.06）和無規(guī)則卷曲（28.86%～44.35）的占比最高，除ZjGH3-10以外的其他家族成員的α-螺旋和無規(guī)則卷曲的比例相差較小，基本均在40%左右。說明ZjGH3家族成員的二級結構主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成且行使主要功能。

2.4 棗GH3基因啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE在線工具對棗GH3基因前2.0 kb序列的啟動子順式作用元件進行分析(圖3)。結果表明，ZjGH3基因家族含有類型豐富的啟動子元件且分布不規(guī)律。所有基因都分析到了光響應元件（G-box、Box II、TCCC-motif和I-box等），ZjGH3-17和ZjGH3-13基因均分析到了超過15個光響應元件，為所有基因所有元件中數(shù)量最多的。與結合MYB位點的元件包括MRE、MBS和CCAAT-box，三大類中的基因基本都分析到了上述三個元件，但數(shù)量較少。與激素相關的響應元件包括茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、赤霉素響應元件（P-box）、生長素響應元件（TGA-element和AuxRE）和脫落酸響應元件（ABRE），19個ZjGH3基因中只有ZjGH3-12和ZjGH3-18兩個基因沒有與茉莉酸甲酯響應相關的元件，ZjGH3-16與茉莉酸甲酯響應相關的元件數(shù)量較多，共10個。Clade1和Clade3兩大類中的12個家族成員都有與脫落酸響應相關的元件。與生長素響應的元件較少，只在ZjGH3-16、ZjGH3-17、ZjGH3-9和ZjGH3-10四個基因中分析到。與植物生長發(fā)育響應的相關元件中，Clade3分類中只有ZjGH3-11和ZjGH3-12分析到與玉米醇溶蛋白相關的元件（O2-site）。與種子特異性調控相關的元件（RY-element）只在Clade2分類中ZjGH3-4基因的啟動子區(qū)域被分析得到。與脅迫響應相關的元件中，無氧誘導元件（ARE）只在ZjGH3-4和ZjGH3-7基因的啟動子區(qū)域沒有被分析到，機械損傷（WUN-motif）、防御和應激（TC-rich repeats）響應元件只在Clade3中的部分基因的啟動子區(qū)域被分析到。綜上，ZjGH3基因可能受光照、茉莉酸甲酯和無氧誘導等多種因素的調控。

圖3 棗GH3基因的啟動子分析Fig.3 Promoter analysis of ZjGH3 genes

2.5 棗GH3基因的染色體分布

為了解棗GH3基因家族成員在棗染色體上的分布情況，通過繪制染色體定位圖可以發(fā)現(xiàn)（圖4），19個棗GH3基因家族成員中有15個基因被定位到棗的12條染色體中的Chr4、Chr8、Chr9、Chr10、Chr11和Chr12共6條染色體上，其他的6條染色體沒有棗GH3基因分布。在Chr4和Chr8定位到了最多的ZjGH3基因，均包括了4個。在Chr11上只定位1個ZjGH3基因。ZjGH3-16、ZjGH3-17、ZjGH3-18和ZjGH3-19這4個基因未被定位到棗的12條染色體上。通過分析棗GH3基因發(fā)現(xiàn)，19個GH3基因中有14個基因都有基因復制事件，包括ZjGH3-2～ZjGH3-3、ZjGH3-2～ZjGH3-4和ZjGH3-5～ZjGH3-6等8對基因復制事件。

圖4 棗GH3基因在染色體上的分布Fig.4 Chromosome location of the ZjGH3 genes

2.6 棗GH3基因的表達分析

通過對不同發(fā)育時期‘壺瓶棗’果實中GH3基因的表達情況分析發(fā)現(xiàn)（圖5），19個棗GH3基因在棗果實發(fā)育的H1(白熟期)、H2(半紅期)和H3(全紅期)三個時期中的一個或多個時期均有表達，不存在三個時期均不表達的基因。ZjGH3-2和ZjGH3-3基因在H1表達，在H2不表達，在H3又表達，但在H1和H3兩個時期表達量極低(FPKM＜1)。ZjGH3-13基因在H1不表達，在H2和H3兩個時期表達，但表達量低(FPKM＜1)。ZjGH3-1基因在H1和H2兩個時期表達量低(FPKM＜1)，在H3不表達。ZjGH3-10、ZjGH3-14、ZjGH3-15、ZjGH3-18和ZjGH3-19五個基因在棗果實發(fā)育的3個時期均表達，但表達量較低(FPKM＜1)。ZjGH3-5、ZjGH3-6、ZjGH3-7、ZjGH3-8、ZjGH3-11和ZjGH3-12六個基因從H1到H3時期表達量逐漸降低，ZjGH3-5、ZjGH3-6、ZjGH3-7和ZjGH3-8四個基因表達量較高，ZjGH3-11和ZjGH3-12基因表達量較低。ZjGH3-4、ZjGH3-16和ZjGH3-17三個基因的表達量隨果實的發(fā)育從H1到H3時期均表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，ZjGH3-4基因在H1時期不表達，到H2時期開始表達，但在H2和H3兩個時期表達量均較低(FPKM＜0.1)，ZjGH3-16和ZjGH3-17兩個基因的表達量在三個時期均較高，且從H1到H3基因表達量升高的幅度較大。

圖5 不同發(fā)育時期棗果實中GH3基因表達分析Fig.5 Expression analysis of GH3 genes during fruit development stages

3 討 論

GH3基因家族是一類重要的生長素響應基因，且具有GH3蛋白保守結構域，編碼生長素酰胺合成酶催化自由態(tài)IAA與氨基酸偶聯(lián)反應轉換為結合態(tài)生長素，使之失活，以維持植物體內(nèi)自由態(tài)生長素的動態(tài)平衡[14]。通過對GH3基因家族成員的全面分析，有助于揭示GH3基因在植物生長發(fā)育過程中的作用機制，對于棗生長發(fā)育的調控具有重要意義。目前，在眾多植物中已經(jīng)對GH3基因家族成員進行鑒定，包括桃（8個）[19]、茶樹（20個）[20]、蘋果（15個）[21]、番茄（15個）[22]，在桃的研究中，8個桃GH3基因所編碼的氨基酸長度在574～614 aa，且全都為酸性蛋白[19]。在茶樹的研究中，20個茶樹GH3基因所編碼的氨基酸長度在246～774 aa，且大部分為酸性的親水性蛋白，并被定位在細胞質和細胞核上[20]。本研究共鑒定得到19個棗GH3基因，基因數(shù)量與他物種相比較多。通過對棗GH3基因理化性質分析后發(fā)現(xiàn)19個棗GH3基因所編碼的氨基酸長度在149～629 aa，但大部分家族成員所編碼的氨基酸長度基本均在600 aa左右，且為酸性的穩(wěn)定蛋白，并被定位在細胞質上，所有成員均為親水性蛋白。本研究結果基本與前人的研究結果一致?；蛑貜褪录谛禄驍U展和新功能中發(fā)揮著不可或缺的作用，它包括了染色體的大片段復制和串聯(lián)重復事件。棗的19個GH3基因雖然不存在大片段復制事件，但是包含了8對串聯(lián)重復事件，這是棗GH3基因家族數(shù)量擴張的重要原因。啟動子對基因的轉錄起始具有重要作用，啟動子區(qū)域含有一系列基本作用元件，它們能夠反映基因的潛在功能，由此可以推斷出該基因的作用?；虻谋磉_或轉錄由上游的啟動子區(qū)域來完成，起始位點位于上游幾百或幾千bp[23]。啟動子順式作用元件分析有利于預測其在各種刺激或激素下的表達情況。通過對棗19個GH3基因家族成員的啟動子分析發(fā)現(xiàn)，所有基因均含有與激素相關的順式作用元件，多數(shù)基因含有茉莉酸甲酯響應元件(CGTCA-motif和TGACGmotif)、赤霉素響應元件(P-box)和脫落酸響應元件(ABRE)，少數(shù)基因含有生長素響應元件(TGAelement和AuxRE)。這也說明棗GH3基因廣泛參與激素相關的響應，表明在許多激素信號通路中起到了重要作用。同時這結果也與水稻和棉花的研究結果一致[24]。導致這一結果的原因可能是生長素響應元件的存在和缺失與大多數(shù)GH3基因的誘導或缺失存在著重要的關系[25]。同時還分析得到響應生長發(fā)育和脅迫等相關的順式作用元件，包括低溫、機械損傷和分生組織、柵欄葉肉組織等。在茶樹的研究中發(fā)現(xiàn)，20個茶樹GH3基因也分析得到與防御和應急、干旱、低溫和機械損傷等脅迫響應元件以及胚乳、分生組織等表達的生長發(fā)育元件[20]。

為了進一步研究棗GH3基因的進化關系，根據(jù)擬南芥的功能對棗GH3家族成員的功能做了初步預測。AtGH3-6基因通過調控生長素濃度影響了擬南芥莖細胞的發(fā)育，其過表達株系顯示出更短的下胚軸，葉片形態(tài)也會發(fā)生顯著變化[26]。GH3-9基因通過調節(jié)生長素的濃度及活性影響了擬南芥初生根的生長與發(fā)育[27]。依據(jù)進化樹結果可知，ZjGH3-10與AtGH3-9關系最近，ZjGH3-18和ZjGH3-19與AtGH3-6被聚在一起，可依次來推測ZjGH3-10基因可能影響棗根系的生長發(fā)育，ZjGH3-18和ZjGH3-19可能對棗莖和葉片的生長有影響。近年來隨著對GH3基因研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)GH3基因對生長信號轉導途徑、生長素與其他激素信號之間的互作及在植物生長發(fā)育等方面都具有重要的作用。在桃的研究中發(fā)現(xiàn)，PpGH3-1，PpGH3-2，PpGH3-3，PpGH3-4和PpGH3-5參 與調節(jié)生長素動態(tài)平衡來控制桃果實各個時期的發(fā)育，PpGH3-3和PpGH3-4在桃果實成熟階段的表達量明顯上調，它們可能參與了桃果實的成熟[19]。在葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)，VvGH3-1基因的表達在果實成熟期增加，提示該基因可能參與了低濃度IAA誘導果實衰老的建立和維持過程，與果實生長發(fā)育密切相關[28]。在番茄的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然大多數(shù)SlGH3基因在果實成熟初期沒有作用，但是SlGH3-1和SlGH3-2在果實成熟初期的表達上調，表明這兩個基因可能在果實成熟過程中發(fā)揮作用[22]。本研究通過表達分析發(fā)現(xiàn)，ZjGH3-16和ZjGH3-17隨‘壺瓶棗’果實發(fā)育表達量逐漸升高，在果實成熟期(H3)表達量上調，在‘壺瓶棗’果實發(fā)育的白熟期、半紅期和全紅期呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律且表達量均較高，推測ZjGH3-16和ZjGH3-17基因可能與果實發(fā)育存在一定的關系。本研究鑒定了棗GH3基因家族成員，并對做了理化性質、分類、基因結構、保守基序、啟動子順式作用元件和表達模式進行了全面的分析，但ZjGH3基因在果實發(fā)育過程中的表達分析時只選用了‘壺瓶棗’這一個品種，雖然目前‘壺瓶棗’栽培面積很廣，但由于棗品種眾多，‘壺瓶棗’雖然具有一定的代表性，但只限于這一個品種也存在一定的局限性，并且通過表達分析后篩選出來的關鍵基因的功能沒有得到進一步驗證。基于以上結果，在未來的研究中，要在栽培面積達到一定規(guī)模，對具有代表性的多個棗品種在果實發(fā)育期進行ZjGH3基因的表達分析，對確定的候選基因進行克隆及功能驗證。

4 結 論

基于棗全基因組數(shù)據(jù)，本研究共鑒定得到19個GH3基因并將其分成了三大類，每個類別中的基因結構和保守基序較為一致。19個GH3基因共分析得到8對基因復制事件，且均為串聯(lián)重復事件，這是棗GH3基因家族成員擴張的直接原因。棗GH3基因啟動子區(qū)域有多個與激素和生長發(fā)育相關的順式元件，可能是GH3基因參與生長發(fā)育的因素并依據(jù)表達分析推測ZjGH3-16和ZjGH3-17兩個基因參與棗果實生長發(fā)育。