林金水，張 恒，高倩倩，王 鳳，裴永福，成娟麗*，張向前

(1 陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[延安大學(xué)]，陜西延安 716000；2 延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安 716000)

抗生素的發(fā)現(xiàn)揭開(kāi)了人類與病原菌戰(zhàn)爭(zhēng)的歷史，并被視為現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的支柱，然而隨著病原菌對(duì)抗生素耐藥性的出現(xiàn)，這場(chǎng)戰(zhàn)爭(zhēng)勝利的天平慢慢傾向病原菌，對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]，而2016年的聯(lián)合國(guó)首腦會(huì)議承諾將共同努力遏制耐藥菌的蔓延則更進(jìn)一步說(shuō)明了這個(gè)問(wèn)題的嚴(yán)重性[1]。威脅人類健康的病原菌主要來(lái)自于糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的耐藥菌株，它們被合并簡(jiǎn)稱為“ESKAPEE”病原體[1]，具有多重耐藥性、泛耐藥性甚至全耐藥性[2-4]。而新型抗生素來(lái)源的枯竭使目前的形勢(shì)更加惡化[1,5]。這就要求我們另辟蹊徑，采用新的策略來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。藥用植物和芳香植物被譽(yù)為生物活性化合物的儲(chǔ)藏庫(kù)，其提取物是解決病原菌耐藥性的有效途徑之一[1, 6-8]。這種植物提取物可以分為兩類，一是自身具有抗耐藥菌的作用，如蜀葵、山月桂、百里香和五味子等的活性提取成分對(duì)耐藥菌有良好的殺菌活性[9-10]；二是本身抗菌活性不明顯，但具有顯著增強(qiáng)抗生素療效的作用，即抗菌增效作用[11-13]。例如，存在于蘿芙木屬植物中的吲哚類生物堿成分——利血平可通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞的Bmr外排泵來(lái)增強(qiáng)四環(huán)素殺菌活性[14]；來(lái)源于黃連的黃連素和諾氟沙星聯(lián)合使用時(shí)，可通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞的外排泵NorA而增強(qiáng)諾氟沙星的殺菌作用[13]；當(dāng)馬齒莧的乙醇提取物和野青樹(shù)葉子的丙酮提取物或者氯仿提取物分別與紅霉素聯(lián)合使用時(shí)，都能顯著增強(qiáng)紅霉素對(duì)耐藥菌的殺菌能力[15-16]。此外，植物源活性提取物還可通過(guò)調(diào)節(jié)宿主的免疫能力來(lái)抵抗耐藥菌的感染，它可影響傷口愈合過(guò)程的各個(gè)階段，包括凝血、炎癥、纖維增生、上皮的形成、膠原化和傷口收縮等[17-18]。例如，南非植物馬拉馬豆中的多酚可以抑制耐藥菌的感染和促進(jìn)傷口愈合[19]；從谷物中提取的β-葡聚糖類具有潛在的抗感染、促進(jìn)傷口愈合和免疫調(diào)節(jié)特性[20]。因此，植物提取物是抗耐藥菌活性成分重要來(lái)源之一。

酸棗[ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chow]是鼠李科棗屬植物，酸棗果作為重要食品和/或傳統(tǒng)藥物具有悠久的歷史。研究表明酸棗果含有大量的生物活性化合物，如抗壞血酸、三萜酸、酚酸、氨基酸、皂苷、α-生育酚、生物堿、胡蘿卜素、腦苷脂、黃酮類化合物、多糖和礦物質(zhì)成分[21]。雖然這些活性成分具有廣泛的藥理作用，如能夠增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗炎、抗衰老、抗肥胖、抗腫瘤、抗糖尿病、護(hù)肝、抗癌和胃腸道保護(hù)等作用[22-25]。然而對(duì)于酸棗果在抗菌作用方面的關(guān)注較少。多數(shù)報(bào)道紅棗及其他品種的棗果具有抗菌作用。如來(lái)自伊朗的紅棗果乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和煙曲霉具有廣譜的抗菌活性[26]；來(lái)自于阿爾及利亞蓮棗果的甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌顯示出抗菌活性[27]；以及來(lái)自于敘利亞蓮棗果的石油醚提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、化膿性鏈球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用[28]。而酸棗果方面僅有孫延芳等報(bào)道，分離自酸棗果的三萜皂苷具有廣譜的抗菌作用[29]。以上的研究表明棗果中普遍含有抗菌成分，而對(duì)酸棗果抗菌功能成分的研究還有待于進(jìn)一步加強(qiáng)。

我們先前研究顯示，酸棗果的氯仿提取物具有廣譜的抗菌增效作用，并從該氯仿提取物中進(jìn)一步精制得到其低極性范圍的活性組合物Fr.2a[28]，發(fā)現(xiàn)Fr.2a不僅與多種抗生素聯(lián)用顯示出廣泛的協(xié)同抗菌作用，而且呈劑量依賴性地促進(jìn)微生物生物膜的形成，降低微生物的運(yùn)動(dòng)性和顯著抑制牛奶中微生物的生長(zhǎng)[28]。然而，由于Fr.2a的活性不及氯仿提取物，因此我們推測(cè)酸棗果氯仿提取物中其他極性范圍內(nèi)的物質(zhì)可能也具有抗菌增效活性。本研究在Fr.2a的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)酸棗果氯仿提取物中其他極性范圍的抗菌増效活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，對(duì)分離到的活性物質(zhì)進(jìn)行組成成分鑒定、抗菌增效活性評(píng)價(jià)、抗菌增效機(jī)制研究，并探討其在制備抗皮膚耐藥菌感染藥物中的應(yīng)用，旨在為酸棗果藥用產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 主要材料酸棗果氯仿提取物(先前實(shí)驗(yàn)制備[28])；銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC27853)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC15294)、糞腸球菌(EnterococcusfaecalisATCC29212)和白色念珠菌[MoniliaalbicanCMCC(F)98001]由延安大學(xué)附屬醫(yī)院提供，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)由西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；昆明小鼠(Km)購(gòu)自西安科奧生物有限公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基(1)LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、瓊脂粉 15 g/L，pH調(diào)至7.2，121 ℃滅菌20 min。(2)YPDA培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g/L、酵母提取物 10 g/L、葡萄糖 20 g/L、腺嘌呤 0.03 g/L，pH調(diào)至6.5，115 ℃滅菌30 min。(3)高鹽甘露糖培養(yǎng)基：NaCl 75 g/L、蛋白胨10 g/L、D-甘露糖 10 g/L、牛肉膏 1 g/L、0.25% 酚紅、瓊脂粉 15 g/L，pH調(diào)至7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑胰蛋白胨、酵母提取物、TSB培養(yǎng)基均購(gòu)自O(shè)XOID；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、石油醚均購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；腺嘌呤、瓊脂粉、慶大霉素(Gentamicin Gm)、妥布霉素(Tobramycin Tob)、氨芐青霉素(Ampicillin Amp)、氯霉素(Chloramphenicol Cm)、紅霉素(Erythromycin Em)、夫西地酸(Fusidic acid Fa)、制霉菌素(Nystatin Ns)、酮康唑(Ketoconazole Kcz)、兩性霉素B(Amphotericin B Am B)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；堿性磷酸酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；紅霉素軟膏購(gòu)自于新和成控股集團(tuán)有限公司；莫匹羅星軟膏購(gòu)自中美天津史克制藥有限公司；夫西地酸軟膏購(gòu)自香港澳美制藥廠有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗果氯仿提取物的分離純化及組分鑒定酸棗果氯仿提取物的制備過(guò)程按先前描述的方法執(zhí)行[28]。將得到的酸棗果氯仿提取物通過(guò)硅膠柱層析技術(shù)進(jìn)行分離純化，并利用GC-MS、核磁共振氫譜、紅外光譜對(duì)分離到的活性組分進(jìn)行組成成分分析，酸棗果氯仿提取物的分離純化流程見(jiàn)圖1。稱取260 g 200～300目硅膠作為柱填料，用石油醚濕法裝入內(nèi)徑為95 mm的色譜柱中，取5 g酸棗果氯仿提取物，用氯仿溶解后與95 g 100～200目的硅膠混勻，蒸干氯仿后，加石油醚濕法上樣；用石油醚、石油醚∶乙酸乙酯=100∶1、石油醚∶乙酸乙酯=10∶1、石油醚∶乙酸乙酯=1∶1、石油醚∶乙酸乙酯=1∶10、石油醚∶乙酸乙酯=1∶50、石油醚∶乙酸乙酯=1∶100、石油醚∶乙酸乙酯=1∶200、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫，分別收集各部分洗脫相各200 mL。依次分別命名為Fr.1A、Fr.1B、Fr.1C、Fr.1D、Fr.1E、Fr.1F、Fr.1G、Fr.1H、Fr.1I、Fr.1J，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，45 ℃真空干燥洗脫液，低溫下保存。各組分抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌増效活性成分僅存在于Fr.1G和Fr.1H。因此將 Fr.1G和Fr.1H合并且命名為Fr.A并進(jìn)一步對(duì)Fr.A進(jìn)行分離純化。稱取90 g 200～300目硅膠作為柱填料，用石油醚濕法裝入內(nèi)徑為47 mm的色譜柱中，將樣品Fr.A用乙酸乙酯充分溶解后與20 g 100～200目的硅膠混勻，蒸干乙酸乙酯后，加石油醚濕法上樣；用石油醚，石油醚∶乙酸乙酯=100∶1、石油醚∶乙酸乙酯=10∶1、石油醚∶乙酸乙酯=1∶1、石油醚∶乙酸乙酯=1∶10、石油醚∶乙酸乙酯=1∶50、石油醚∶乙酸乙酯=1∶100、石油醚∶乙酸乙酯=1∶200、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫，分別收集各洗脫相各100 mL。依次分別命名Fr.2A、Fr.2B、Fr.2C、Fr.2D、Fr.2E、Fr.2F、Fr.2G、Fr.2H、Fr.2I、Fr.2J，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，45 ℃真空干燥洗脫液，并在低溫保存。各組分抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌増效活性成分僅存在于Fr.2D和Fr.2E中，故將Fr.2D和Fr.2E合并命名為Fr.B。由于繼續(xù)對(duì)Fr.B進(jìn)行分離純化后得到的分離組分均無(wú)活性，因此無(wú)法對(duì)Fr.B繼續(xù)進(jìn)行柱色譜分離，故確定Fr.B組分為抗菌增效活性精制物。將Fr.B送上海圭譜化工科技有限公司進(jìn)行GC-MS、核磁共振氫譜和紅外光譜分析檢測(cè)。

1.2.2 酸棗果氯仿提取物分離過(guò)程中各組分的活性評(píng)價(jià)方法將過(guò)夜培養(yǎng)的供試菌株稀釋至1×106CFU/mL；經(jīng)過(guò)柱層析分離后得到的分離組分，使用無(wú)水乙醇溶解并分別配制成濃度為2 560、1 280、640、400、320、200、160、100、80、50、40、20、1、0.55和0.25 mg/mL的母液。以最大溶解度配制慶大霉素(Gm)、妥布霉素(Tob)、氨芐青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、紅霉素(Em)、夫西地酸(Fa)、制霉菌素(Ns)、酮康唑(Kcz)和兩性霉素B(Am B)的母液，其中Em、Cm、Kcz用無(wú)水乙醇配制，F(xiàn)a、Am B用DMSO配制，其他抗生素用無(wú)菌水配制，使用培養(yǎng)基將配置好的各種抗生素分別均稀釋至濃度為4 096 μg/mL的母液，過(guò)濾除菌后備用。使用一次性無(wú)菌96孔板進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。對(duì)于單獨(dú)藥敏實(shí)驗(yàn)，先向96孔板中每個(gè)孔加入100 μL LB或YPDA培養(yǎng)基，在第一個(gè)孔內(nèi)加入100 μL濃度為4 096 μg/mL的抗生素，混勻后再?gòu)闹形?00 μL到第二個(gè)孔內(nèi)，依次類推，使抗生素終濃度依次稀釋2倍，再向每孔中加入100 μL 濃度為1×106CFU/mL的菌液(由于各分離組分的水溶性較差，單獨(dú)藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)先向96孔板中每孔加入100 μL LB或YPDA培養(yǎng)基，再向每孔中加入100 μL 濃度為1×106CFU/mL菌液，然后直接向每孔中加入10 μL各分離組分的不同濃度母液)。對(duì)于聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)，在單獨(dú)藥敏實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上再在每孔中加入10 μL處理好的組分。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照為100 μL菌液加100 μL培養(yǎng)基，陰性對(duì)照為200 μL培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)中加入的無(wú)水乙醇不影響微生物的生長(zhǎng)及抗生素對(duì)微生物的抑制作用)。將96孔板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。用“-”表示陰性，孔清亮，用“+”表示陽(yáng)性，孔混濁。MIC為能夠抑制微生物生長(zhǎng)、繁殖的最低藥物濃度,即用肉眼觀察，無(wú)微生物生長(zhǎng)的藥物最低濃度孔。FIC[28]是指在2種或多種藥物同時(shí)使用的情況下，各種藥物的聯(lián)合用藥時(shí)的最小抑菌濃度(MIC)與單獨(dú)用藥時(shí)的MIC的比值之和。FIC≤0.5認(rèn)為藥物之間具有協(xié)同作用；FIC在0.5～4.0之間則認(rèn)為藥物之間無(wú)相關(guān)作用；FIC>4.0則認(rèn)為藥物之間具有拮抗作用。

1.2.3 時(shí)間-殺傷曲線測(cè)定時(shí)間-殺傷曲線實(shí)驗(yàn)改進(jìn)自先前描述的方法[30]。挑取單菌落于新鮮液體培養(yǎng)基中(MRSA用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，白色念珠菌用YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng))，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。按1∶100的比例轉(zhuǎn)接入新的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6，使用新鮮液體培養(yǎng)基稀釋菌液，使其菌液最終濃度為2.0×105CFU/mL，分別加入抗生素溶液，使得抗生素終濃度為Tob =64 μg/mL、Amp=256 μg/mL、Em=256 μg/mL、Cm=8 μg/mL、Gm=64 μg/mL、Fa=0.125 μg/mL、Kcz=4 μg/mL和Am B=1 μg/mL(此濃度為相應(yīng)抗生素對(duì)MRSA或白色念珠菌的MIC)或者加入含有相同濃度的抗生素與終濃度5 mg/mL的Fr.B混合溶液，37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)。每隔1 h取樣100 μL，依次十倍稀釋涂布于LB或YPDA平板上，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。繪制時(shí)間-殺傷曲線曲線：y軸為微生物菌數(shù)CFU/mL，x軸為間隔1 h的時(shí)間。

1.2.4 Fr.B對(duì)MRSA菌株細(xì)胞壁通透性的影響細(xì)胞壁通透性實(shí)驗(yàn)改進(jìn)自先前描述的方法[31]。挑取MRSA單菌落置新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。將MRSA菌液按1∶100的比例轉(zhuǎn)接入新的LB液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)分別設(shè)置加入終濃度為5 mg/mL Fr.B、1%紅霉素(Em)和5 mg/mL Fr.B+1% Em等3種處理，加入無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照組。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。37 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)，每隔2 h取樣，4 500 r/min離心10 min，取上清，即為待測(cè)液。按南京建成生物工程研究所的堿性磷酸酶試劑盒操作步驟進(jìn)行堿性磷酸酶酶活測(cè)定。

1.2.5 Fr.B對(duì)MRSA菌株培養(yǎng)液中電導(dǎo)率和核酸大分子含量的影響電導(dǎo)率和核酸大分子含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)改進(jìn)自先前描述的方法[32-33]。挑取MRSA單菌落于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。將MRSA按1∶100的比例轉(zhuǎn)接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，4 500 r/min離心10 min收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌2次，最終用PBS懸浮并使菌液的濃度為1.0×107CFU/mL，設(shè)置加入終濃度為5 mg/mL Fr.B、1% 紅霉素(Em)和5 mg/mL Fr.B+1% Em等3種處理，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照組。37 ℃、120 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取樣，4 000 r/min離心10 min，取上清，即為待測(cè)液。用5%葡萄糖將上清液稀釋20倍后，測(cè)定其電導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。用酶標(biāo)儀于260 nm下測(cè)定上清液中核酸大分子的吸光值，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 紅霉素+Fr.B最佳配比的篩選將終濃度1%、0.1%、0.01%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%與0.01% 的紅霉素和終濃度5 mg/mL的Fr.B單獨(dú)或者聯(lián)合使用，對(duì)MRSA菌株進(jìn)行時(shí)間-殺傷曲線的測(cè)定，從中篩選出Fr.B與紅霉素最合適的配比。

1.2.7 軟膏的制備及軟膏體內(nèi)活性檢測(cè)紅霉素軟膏購(gòu)自于新和成控股集團(tuán)有限公司，主要成分為1%紅霉素及輔料(凡士林和液體石蠟)。軟膏制備：(1)藥物聯(lián)用軟膏的制備：稱取21 g凡士林、8 g液體石蠟，水浴加熱約至60 ℃，使基質(zhì)完全熔化，并攪拌均勻。稱取1 g紅霉素溶于1 mL的無(wú)水乙醇中，稱取0.5 g Fr.B溶于1 mL的無(wú)水乙醇中，各準(zhǔn)備2份，備用。在50 ℃時(shí)，向基質(zhì)中分別加入配制好的Fr.B溶液或Fr.B+紅霉素溶液，使其紅霉素濃度為1%，F(xiàn)r.B濃度為0.5%，順時(shí)針攪拌至均勻，同時(shí)將混合體系溫度降至室溫。以基質(zhì)作為空白對(duì)照，基質(zhì)中加入Fr.B溶液的命名為Fr.B軟膏，基質(zhì)中加入紅霉素+Fr.B混合物溶液的命名為“抗霸”軟膏。將配制好的軟膏分裝。(2)單一藥物軟膏的制備及混用：稱取0.5 g Fr.B溶于1 mL的無(wú)水乙醇中，備用。稱取21 g凡士林、8 g液體石蠟，水浴加熱約至60 ℃，使基質(zhì)完全熔化、并攪拌均勻。在50 ℃時(shí)，向基質(zhì)中加入配制好的Fr.B溶液，使得Fr.B濃度為1%，順時(shí)針攪拌至均勻，同時(shí)將混合體系溫度降至室溫，分裝，得到1%的Fr.B軟膏。稱取21 g凡士林、8 g液體石蠟，水浴加熱約至60 ℃，使基質(zhì)完全熔化、并攪拌均勻。將市場(chǎng)銷售的1% 紅霉素軟膏與基質(zhì)1∶9混合，待基質(zhì)降溫凝固，配制成0.1% 紅霉素軟膏，分裝。使用時(shí)將上述不同軟膏按1∶1比例混合，配制成基質(zhì)+1% 紅霉素軟膏(含終濃度為0.5% 的Em)、基質(zhì)+0.1% 紅霉素軟膏(含終濃度為0.05% 的Em)、 Fr.B軟膏+1% 紅霉素軟膏(含終濃度為0.5% 的Fr.B+0.5%的Em)、Fr.B軟膏+0.1% 紅霉素軟膏(含終濃度為0.5% 的Fr.B+0.05%的Em)。

軟膏的體內(nèi)活性檢測(cè)：體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究獲得延安大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心批準(zhǔn)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按照中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理原則的指南進(jìn)行。

1) 傷口感染模型建立 用昆明小鼠(Km)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，選取體重為25～27 g的小鼠，針對(duì)藥物聯(lián)用軟膏的處理分為8組，分別為無(wú)傷口組、傷口無(wú)感染組、傷口感染組(空白對(duì)照組)、紅霉素軟膏組(含終濃度為1% 的Em)、抗霸軟膏組(含終濃度為0.5% 的Fr.B+1%的Em)、Fr.B軟膏組(含終濃度為0.5%的Fr.B)、夫西地酸軟膏組(含終濃度為2%的Fa)、莫匹羅星軟膏組(含終濃度為2%的Mu)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)每組6只小鼠)；針對(duì)單一藥物軟膏混用的處理分為7組，分別為基質(zhì)組(空白對(duì)照)、紅霉素軟膏組(含終濃度為1% 的Em)、基質(zhì)+1% 紅霉素軟膏(含終濃度為0.5% 的Em)、基質(zhì)+0.1% 紅霉素軟膏(含終濃度為0.05% 的Em)、Fr.B軟膏組(含終濃度為0.5%的Fr.B)、Fr.B軟膏+1% 紅霉素軟膏(含終濃度為0.5% 的Fr.B+0.5%的Em)、Fr.B軟膏組+0.1%紅霉素軟膏(含終濃度為0.5% 的Fr.B+0.05%的Em)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)每組6只小鼠)，飼養(yǎng)2周，讓小鼠適應(yīng)環(huán)境。制備MRSA菌懸液：將培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)MRSA菌液，4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，在PBS中洗滌2次后用PBS重新懸浮細(xì)胞并稀釋至1.0×106CFU/mL個(gè)細(xì)胞，備用。小鼠感染模型建立：使用乙醚輕微麻醉小鼠，皮下注射5%的水合氯醛(250 μL/20 g)，待小鼠完全昏迷后，對(duì)小鼠背部進(jìn)行剃毛，再使用6 %的硫化鈉徹底脫毛。使用鑷子夾取少量皮膚，用剪刀剪出傷口(10 mm×10 mm)。接著皮下注射0.8 mL的葡萄糖，以維持小鼠生命體征。最后將制備好的MRSA細(xì)胞懸浮液淋灑至小鼠傷口處，接觸感染2 h，建立感染模型，對(duì)小鼠傷口進(jìn)行拍照記錄。

2) 動(dòng)物局部治療 細(xì)菌接觸小鼠傷口感染2 h后，感染模型建立成功。接下來(lái)對(duì)小鼠進(jìn)行初步治療，除無(wú)傷口組，傷口無(wú)感染組不給予任何治療外，給其他每組小鼠傷口涂抹0.1 g相應(yīng)的軟膏，每天涂抹2次相應(yīng)藥物至小鼠傷口處，連續(xù)涂抹5 d，并每天觀察記錄小鼠生命體征。

3) 指標(biāo)測(cè)定 小鼠體重監(jiān)測(cè)：每天觀察并對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，用于評(píng)價(jià)建立的小鼠模型。傷口組織菌落計(jì)數(shù)：小鼠連續(xù)給藥4 d后，對(duì)部分小鼠安樂(lè)死，用無(wú)菌剪刀剪取傷口處皮膚組織，稱重，將其懸浮在400 μL PBS中并搞碎成勻漿，采用連續(xù)十倍稀釋法稀釋勻漿液，涂布至高鹽甘露糖培養(yǎng)基(金黃色葡萄球菌的選擇性培養(yǎng)基)上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。評(píng)估傷口愈合情況：監(jiān)測(cè)小鼠傷口愈合情況，分別在第0、2、6、10天拍攝小鼠傷口的照片，并用ImageJ軟件測(cè)量小鼠傷口面積的大小。第0天的傷口面積被認(rèn)為是100%，每只小鼠的傷口面積被測(cè)量、記錄并計(jì)算傷口面積占第0天傷口面積的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少設(shè)3個(gè)生物學(xué)平行并且獨(dú)立重復(fù)2次，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值“±”標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Student’s t-test(雙尾不配對(duì))對(duì)進(jìn)行顯著性分析。用GraphPad Prism version 5.00 軟件(GraphPad software Inc.; San Diego，CA，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖。P值<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 以抗菌增效活性為導(dǎo)向的酸棗果氯仿提取物的分離純化及組成成分分析

在Fr.2a的基礎(chǔ)上，本研究采取硅膠柱層析技術(shù)對(duì)氯仿提取物進(jìn)一步分離純化。按照?qǐng)D1方法依次洗脫得到了Fr.1A、Fr.1B、Fr.1C、Fr.1D、Fr.1E、Fr.1F、Fr.1G、Fr.1H、Fr.1I與Fr.1J等10個(gè)洗脫液，分別對(duì)它們進(jìn)行抗菌增效活性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，其中僅有5 mg/mL的Fr.1G、Fr.1H可使Amp對(duì)銅綠假單胞菌的MIC由1 024 μg/mL下降至2 μg/mL，而其他組分均不能增強(qiáng)Amp的抑菌作用。由于單獨(dú)使用時(shí)，F(xiàn)r.1G、Fr.1H對(duì)銅綠假單胞菌的MIC均為128 mg/mL，Amp對(duì)銅綠假單胞菌的MIC大于1 024 μg/mL，兩者的FIC=5/128+2/1024=0.04<0.5，從而得出Fr.1G、Fr.1H分別與Amp聯(lián)合使用時(shí)均能增強(qiáng)Amp對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用，于是將有活性的Fr.1G和Fr.1H合并，并命名為Fr.A。

對(duì)Fr.A進(jìn)行硅膠柱層析分離純化，按照?qǐng)D1洗脫順序依次洗脫，分別得到組分Fr.2A、Fr.2B、Fr.2C、Fr.2D、Fr.2E、Fr.2F、Fr.2G、Fr.2H、Fr.2I與Fr.2J，對(duì)這些組分依次進(jìn)行體外抗菌增效活性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，僅有Fr.2D、Fr.2E組分能顯著增強(qiáng)Amp對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用，10 mg/mL的Fr.2D可使Amp對(duì)銅綠假單胞菌的MIC由1 024 μg/mL下降至4 μg/mL。由于單獨(dú)使用時(shí)，F(xiàn)r.2D對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為64 mg/mL，而Amp對(duì)銅綠假單胞菌的MIC大于1024 μg/mL，由此可得到FIC=10/64+4/1024=0.16<0.5；10 mg/mL的Fr.2E可使Amp對(duì)銅綠假單胞菌的MIC由1 024 μg/mL下降至1 μg/mL；由于單獨(dú)使用時(shí)，F(xiàn)r.2E對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為64 mg/mL，而Amp對(duì)銅綠假單胞菌的MIC大于1 024 μg/mL，由此可得到FIC=10/64+1/1024=0.16<0.5。上述結(jié)果表明，F(xiàn)r.2D和Fr.2E均具有較好的抗菌增效活性，因此將Fr.2D和Fr.2E合并，并命名為Fr.B。由于繼續(xù)對(duì)Fr.B進(jìn)行分離純化后得到的分離組分均無(wú)活性，因此無(wú)法對(duì)Fr.B繼續(xù)進(jìn)行柱層析分離，故確定Fr.B組分為抗菌增效活性精制物，其產(chǎn)率高達(dá)44.86%，同時(shí)這也暗示Fr.B的抗菌增效活性可能是多種成分協(xié)同起作用的結(jié)果。

圖1 酸棗果氯仿提取物分離純化流程圖Fig.1 Flow chart of separation and purification of chloroform extracts from sour jujube fruit

為了確定Fr.B中包括哪些化學(xué)成分，本研究對(duì)Fr.B進(jìn)行GC-MS組分成分分析。經(jīng)過(guò)GC-MS分析可知(圖1)Fr.B中主要含有30.07% 反油酸、24.68% 油酸、11.54% 順-10-十六碳烯醇、10.54% 棕櫚酸、3.97% 1-二十四烯、2.89% 巖芹酸、2.12% 順-11-十八碳烯酸、2.08% 反-13-十八碳烯酸、2.06% 順, 順-13, 16二十二碳二烯酸、1.96% 二十五烷、1.44% 亞油酸、1.08% 亞油酸甲酯、1.07% 順-11-二十碳烯酸、1.05% 芥酸、0.98% 順-13-十八碳烯醛、0.85% 反-9-十八碳烯酸甲酯、0.64% 順-11二十烯酸、0.32% 順-9-十四碳烯-1-醇乙酸酯、0.32% 順, 順-9, 12-十六碳二烯酸、0.12% 1-棕櫚酸單甘油酯、0.07% 1-十三烯、0.05% 13-甲基十四烷酸甲酯、0.05% 己酸、0.03% 2-氨基丁酸和0.02% 庚酸等化學(xué)成分。

為了驗(yàn)證GC-MS分析的結(jié)果，對(duì)Fr.B進(jìn)行紅外光譜分析(圖2，A)和核磁共振氫譜分析(圖2，B)。圖2，A顯示，3 453 cm-1為羥基吸收振動(dòng)吸收峰，2 923、2 853 cm-1為飽和亞甲基、甲基吸收峰，1 743 cm-1為酯基-COO-吸收峰。1 376、1 456 cm-1為CH(面內(nèi))彎曲振動(dòng)吸收峰，1 688 cm-1為羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，1 158 cm-1為和羧基相連的-CR不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。紅外光譜分析的結(jié)果說(shuō)明Fr.B主要由脂肪酸類化合物組成，這與GC-MS分析的結(jié)果一致。圖2，B顯示，化學(xué)位移0.5～2.8 ppm為典型的脂肪鏈甲基亞甲基上的氫，3.8 ppm為甲酯甲氧基上的氫，4.0～4.2 ppm為和氧相連的碳上的氫，包括和羥基相連的亞甲基和次甲基上的氫，5.3 ppm為碳碳雙鍵上的氫，7.1 ppm為氘代試劑的峰，表明Fr.B主要由脂肪酸類化合物組成，這與GC-MS分析的結(jié)果一致。紅外光譜和核磁共振氫譜分析結(jié)果證明，GC-MS分析鑒定出的Fr.B的化學(xué)組成成分的結(jié)果是可靠的。

2.2 Fr.B的廣譜抗菌增效活性及其作用機(jī)制分析

前面的研究表明Fr.B能增強(qiáng)Amp對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用。為驗(yàn)證Fr.B是否也能增強(qiáng)其他抗生素對(duì)細(xì)菌、真菌的抗菌作用。本研究將Fr.B與其他抗生素聯(lián)合使用對(duì)多種供試細(xì)菌或真菌的體外抗菌增效活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表1和表2所示。10 mg/mL Fr.B與慶大霉素(Gm)、妥布霉素(Tob)、氨芐青霉素(Amp)和紅霉素(Em)等4種抗生素分別聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)銅綠假單胞菌和糞腸球菌的FIC均小于0.5，顯示出明顯的協(xié)同抗菌作用(Fr.B對(duì)銅綠假單胞菌和糞腸球菌的MIC均為64 mg/mL)；對(duì)于大腸桿菌(Fr.B對(duì)大腸桿菌的MIC為64 mg/mL)，10 mg/mL Fr.B與Tob和Em分別聯(lián)用時(shí)顯示出協(xié)同抗菌作用(FIC均小于0.5)；對(duì)于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)(Fr.B對(duì)MRSA的MIC為16 mg/mL)，5 mg/mL Fr.B與Gm、Tob、Amp、Em、夫西地酸(Fa)和氯霉素(Cm)分別聯(lián)用時(shí)顯示出協(xié)同抗菌作用(FIC均小于0.5)；對(duì)于白色念珠菌(Fr.B對(duì)白色念珠菌的MIC為64 mg/mL)，5 mg/mL Fr.B與酮康唑(Kcz)和兩性霉素B(Am B)分別聯(lián)用時(shí)顯示出協(xié)同抗菌作用(FIC均小于0.5)。這些結(jié)果表明Fr.B顯示出廣譜抗菌增效活性。

通過(guò)聯(lián)合抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5 mg/mL的Fr.B能夠顯著增強(qiáng)多種抗生素對(duì)MRSA和白色念珠菌的抑制作用(表1和表2)。為了進(jìn)一步探究Fr.B的抗菌增效活性，我們通過(guò)時(shí)間-殺傷曲線來(lái)進(jìn)一步分析Fr.B與抗生素聯(lián)用對(duì)MRSA菌株和白色念珠菌的協(xié)同殺菌活性。Fr.B分別與Tob、Fa、Cm、Em、Amp和Gm等抗生素聯(lián)用時(shí)均能顯著增強(qiáng)它們對(duì)MRSA菌株的殺菌作用，其中對(duì)Tob、Fa、Cm、Em和Amp的増效作用尤為明顯(圖3，A)；同樣， Fr.B分別與Kcz和Am B聯(lián)合使用時(shí)也均能顯著增強(qiáng)它們對(duì)白色念珠菌的殺菌活性(圖3，B)，這與前面聯(lián)合抑菌試驗(yàn)的結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明Fr.B能協(xié)同抗生素增強(qiáng)其對(duì)MRSA菌株與白色念珠菌的殺菌作用。

A. Fr.B的紅外光譜圖；B. Fr.B的核磁共振氫譜圖圖2 Fr.B的組成成分分析A. Infrared spectrogram of Fr.B; B. Hydrogen NMR spectrogram of Fr.BFig.2 Composition analysis of Fr.B

表1 Fr.B與抗生素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)細(xì)菌的聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC)*

表2 Fr.B與抗生素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)真菌的聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC)*

接著，本研究進(jìn)一步探究了Fr.B增強(qiáng)抗生素療效的機(jī)制。由于已有研究報(bào)道脂肪酸可以引起微生物細(xì)胞通透性的變化[34]，而我們先前GC-MS的結(jié)果顯示，F(xiàn)r.B主要由脂肪酸類化合物組成，因此我們推測(cè)Fr.B可能是通過(guò)影響細(xì)胞的通透性從而起抗菌增效作用。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究檢測(cè)了Fr.B對(duì)MRSA菌株細(xì)胞通透性的影響。

堿性磷酸酶(AKP)正常情況下存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，當(dāng)細(xì)胞壁通透性增大時(shí)，會(huì)通過(guò)細(xì)胞壁流出到培養(yǎng)液中，因此培養(yǎng)液中AKP的活性可以反映細(xì)胞壁的通透性。我們通過(guò)在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中分別加入不同試劑，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，測(cè)定不同時(shí)間段培養(yǎng)液中AKP的活性，來(lái)判斷Fr.B對(duì)MRSA菌株細(xì)胞壁通透性的影響。結(jié)果如圖4，A所示，與對(duì)照組和Em組相比，F(xiàn)r.B組和Fr.B+Em組中AKP的活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增強(qiáng)，并且與Fr.B組相比，F(xiàn)r.B+Em組AKP活性得到進(jìn)一步的提高。表明Fr.B可以增強(qiáng)MRSA菌株細(xì)胞壁的通透性。

培養(yǎng)液中電導(dǎo)率的大小可以反映細(xì)胞膜通透性的變化，而培養(yǎng)液中核酸等大分子物質(zhì)含量可以反映細(xì)胞膜的破損情況。培養(yǎng)液電導(dǎo)率越大，說(shuō)明細(xì)胞膜的通透性越好。培養(yǎng)液中核酸等大分子物質(zhì)含量越高，說(shuō)明細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重。通過(guò)向培養(yǎng)液中分別加入不同試劑，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，測(cè)定培養(yǎng)液中電導(dǎo)率和核酸分子含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，B所示，與對(duì)照組和Em組相比，F(xiàn)r.B組和Fr.B+Em組中的電導(dǎo)率顯著升高，并且Fr.B+Em的電導(dǎo)率高于Fr.B組，表明Fr.B可以增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性。此外，我們還測(cè)定了培養(yǎng)液中的核酸含量，結(jié)果如圖4，C所示，相比對(duì)照組和Em組，當(dāng)加入Fr.B或Fr.B+Em時(shí)，培養(yǎng)液中核酸分子含量顯著增大。上述結(jié)果暗示Fr.B的抗菌增效作用主要是通過(guò)破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的通透性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

2.3 Fr.B與紅霉素聯(lián)用對(duì)小鼠傷口感染模型的治療作用

2.3.1 Fr.B與紅霉素聯(lián)用制成的軟膏對(duì)小鼠傷口感染模型的治療作用許多植物源抗菌活性物質(zhì)在傷口感染中均具有良好的抗菌及促進(jìn)傷口愈合的作用[17-18]。而上述的試驗(yàn)已經(jīng)證明了Fr.B具有廣譜的抗菌増效作用，因此本研究進(jìn)一步探究Fr.B與Em聯(lián)用在傷口感染中是否也具有增強(qiáng)抗菌及促進(jìn)傷口愈合的作用。首先，本研究以MRSA為供試菌株，通過(guò)時(shí)間-殺傷曲線試驗(yàn)對(duì)Fr.B與Em聯(lián)用時(shí)的有效配比進(jìn)行了篩選。結(jié)果如圖5，A所示，5 mg/mL Fr.B、對(duì)照組以及單獨(dú)使用不同濃度的Em組，均對(duì)MRSA菌株的生長(zhǎng)并未產(chǎn)生影響，說(shuō)明MRSA菌株對(duì)它們完全耐藥，而當(dāng)Fr.B分別與1%、0.1%、0.05%、0.04%、0.03% 的Em聯(lián)用時(shí)，均能顯著增強(qiáng)Em對(duì)MRSA菌株的殺菌作用，可是更低濃度的Em與Fr.B聯(lián)用后的抑菌效果卻明顯減弱。因此，從逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性的角度考慮，選定濃度在0.03%以上的紅霉素和5 mg/mL的Fr.B聯(lián)用時(shí)均可達(dá)到理想的聯(lián)合殺菌效果。

A. Fr.B與6種抗生素聯(lián)合使用對(duì)MRSA生長(zhǎng)的影響(Tob.妥布霉素；Amp.氨芐青霉素；Em.紅霉素；Cm.氯霉素；Gm.慶大霉素；Fa.夫西地酸)； B. Fr.B與2種抗生素聯(lián)合使用對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響(Kcz.酮康唑；Am B.兩性霉素B；**.P<0.01；***. P<0.001)圖3 Fr.B與抗生素聯(lián)用對(duì)MRSA和白色念珠菌生長(zhǎng)的影響A. Effect of Fr.B combined with six antibiotics on the growth of MRSA (Tob. Tobramycin; Amp. Ampicillin; Em. Erythromycin; Cm. Chloramphenicol; Gm. Gentamicin; Fa. Fusidic acid); B. Effect of Fr.B combined with two antibiotics on the growth of Candida albicans(Kcz. Ketoconazole; Am B. Amphotericin B, **. P<0.01; ***. P<0.001)Fig.3 Effect of Fr.B combined with antibiotics on the growth of MRSA and Candida albicans

其次，我們以昆明(Km)小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以MRSA為感染菌株，建立了小鼠傷口感染模型，通過(guò)監(jiān)測(cè)小鼠體重的變化，來(lái)判斷小鼠傷口感染模型是否建立成功。結(jié)果如圖5，B所示，傷口感染組小鼠的平均體重顯著低于傷口無(wú)感染組小鼠的平均體重，表明小鼠傷口感染模型建立成功，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性。

A. Fr.B對(duì)MRSA細(xì)胞壁通透性的影響；B. Fr.B對(duì)MRSA細(xì)胞膜通透性的影響；C. Fr.B對(duì)MRSA細(xì)胞膜完整性的影響。Em.紅霉素，*，P<0.05，**，P<0.01圖4 Fr.B對(duì)MRSA細(xì)胞通透性的影響A. Effect of Fr.B on cell wall permeability of MRSA; B. Effect of Fr.B on cell membrane permeability of MRSA; C. Effect of Fr.B on cell membrane integrity of MRSA. Em. Erythromycin, *. P<0.05; **. P<0.01Fig.4 Effect of Fr.B on the cell permeability of MRSA

接著，本研究利用該小鼠傷口感染模型來(lái)評(píng)估Fr.B與Em聯(lián)用制成的軟膏(命名為抗霸軟膏)對(duì)MRSA傷口感染的治療效果。結(jié)果如圖5，C和5，D所示，小鼠傷口在處理的第2天時(shí)，對(duì)照組相比于其他組，傷口有明顯腫脹的現(xiàn)象，其傷口大小減少至(87.78±26.16)%，同時(shí)紅霉素軟膏組與夫西地酸軟膏組傷口也觀察到輕微的腫脹現(xiàn)象，使用紅霉素軟膏的傷口大小減少到(71.59±13.96)%；而夫西地酸軟膏對(duì)傷口愈合能力相對(duì)較好，第2天傷口大小已經(jīng)降低到(35.56±12.72)%，抗霸軟膏組和莫匹羅星軟膏組也均能夠達(dá)到與夫西地酸軟膏類似的效果，其傷口大小也分別降低至(36.51±11.90)%和(37.81±12.52)%，不同的是抗霸軟膏組和莫匹羅星軟膏組的傷口并未發(fā)現(xiàn)腫脹現(xiàn)象。另外，雖然Fr.B軟膏組傷口大小變化不大，僅減少至(72.11±14.11)%，但是其傷口表面并未發(fā)現(xiàn)腫脹的跡象，因此我們推測(cè)Fr.B具有消炎作用。小鼠傷口在處理的第6天時(shí)，相比空白對(duì)照組，紅霉素軟膏組傷口腫脹得到了輕微的緩解，但傷口大小并未發(fā)生明顯的變化。而使用夫西地酸軟膏治療的小鼠傷口大小在第6天減少至(17.86±3.30)%，傷口腫脹也得到了緩解。與此同時(shí)，抗霸軟膏組和莫匹羅星軟膏組傷口大小也發(fā)生明顯的變化，分別減少至(11.90±5.56)%和(14.84±0.96)%。Fr.B軟膏組的傷口雖未發(fā)生腫脹，但傷口大小僅降低至(58.16±12.87)%。在小鼠治療的第10天，抗霸軟膏組的傷口已經(jīng)完全愈合，而其他組還存在大小各不相同的傷口，其中空白對(duì)照組的傷口依然還存在輕微的腫脹，其傷口大小仍為(32.04±5.93)%，紅霉素軟膏組的傷口大小為(27.01±7.56)%，夫西地酸軟膏組和莫匹羅星軟膏組的傷口也均趨于愈合，僅剩(9.20±3.79)%和(1.05±0.48)%。因此，這兩種軟膏對(duì)傷口的愈合能力強(qiáng)于紅霉素軟膏但弱于抗霸軟膏。這些結(jié)果表明，抗霸軟膏對(duì)MRSA傷口感染的治療效果要顯著優(yōu)于紅霉素軟膏，與夫西地酸軟膏和莫匹羅星軟膏相比也有一定的優(yōu)勢(shì)。

最后，我們?cè)谔幚淼?天時(shí)對(duì)小鼠創(chuàng)面進(jìn)行MRSA的菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖5，E所示，空白對(duì)照組小鼠每克傷口組織的菌落數(shù)為4.38×106個(gè)；紅霉素軟膏組傷口顯示出腫脹，其每克傷口組織的菌落數(shù)相比空白對(duì)照組降低幅度不大，為2.60×105個(gè)；Fr.B軟膏對(duì)MRSA菌株本身沒(méi)有殺菌作用，因?yàn)槠涮幚砗蟮拿靠藗诮M織菌落數(shù)(1.78×106個(gè))與空白對(duì)照組相似；而夫西地酸軟膏對(duì)傷口中MRSA菌株的殺菌效果與莫匹羅星軟膏類似，表現(xiàn)為夫西地酸軟膏組和莫匹羅星軟膏組每克傷口組織的菌落數(shù)分別為1.35×104和1.04×104個(gè)，均優(yōu)于空白對(duì)照組。與夫西地酸軟膏和莫匹羅星軟膏相比，抗霸軟膏組則顯示出更優(yōu)秀的對(duì)傷口中MRSA菌株的殺菌效果，其處理后的每克傷口組織菌落數(shù)僅為4.08×103個(gè)，顯著低于其他處理組。上述結(jié)果表明，F(xiàn)r.B與紅霉素聯(lián)用能顯著增強(qiáng)紅霉素對(duì)MRSA菌株的抗菌作用，使之獲得比夫西地酸和莫匹羅星更好的療效。

A. Fr.B和紅霉素的有效配比篩選；B. 小鼠傷口感染模型的建立；C. 不同時(shí)間間隔的小鼠傷口愈合情況(① 空白對(duì)照；② 紅霉素；③ Fr.B；④ 夫西地酸；⑤ 莫匹羅星；⑥ 抗霸)；D. 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠傷口愈合情況的定量分析結(jié)果；E. 不同處理下小鼠創(chuàng)面菌落計(jì)數(shù)。Em.紅霉素，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001圖5 Fr.B與紅霉素聯(lián)用制成的軟膏對(duì)小鼠傷口感染模型的治療作用A. Screening of effective ratio of Fr.B and erythromycin; B. Establishment of wound infection model in mice; C. Wound healing of mice at different time intervals [① Control; ② Erythromycin; ③ Fr.B; ④ Fusidic acid; ⑤ Mupirocin; ⑥ Kangba (Ointment made from Fr.B and erythromycin)]; D. Quantitative analysis results of wound healing in mice at different time points; E. The count of bacterial colonies on the wound surface of mice under different treatments. Em. Erythromycin, *. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001Fig.5 The rapeutic effect of ointment made from Fr. B and erythromycin on mouse wound infection model

2.3.2 Fr.B軟膏與紅霉素軟膏混用對(duì)小鼠傷口感染模型的治療作用前面研究表明Fr.B與紅霉素聯(lián)用制成的抗霸軟膏對(duì)小鼠傷口感染模型的治療效果非常顯著，為了探究分別單獨(dú)制備的Fr.B軟膏和紅霉素軟膏在混用時(shí)是否也具有顯著的治療效果，本研究利用同樣的小鼠傷口感染模型來(lái)評(píng)估不同軟膏混用時(shí)對(duì)MRSA傷口感染的治療效果。結(jié)果如圖6，A和6，B所示，小鼠傷口在處理的第2天時(shí)，基質(zhì)組傷口面積減少至(93.75±10.64)%，基質(zhì)+1%紅霉素軟膏與基質(zhì)+0.1%紅霉素軟膏的傷口面積分別減少到(84.82±10.10)%和(88.68±8.24)%，而1%紅霉素軟膏組的傷口面積減少到(66.59±16.10)%；與1%紅霉素軟膏組類似，含有Fr.B的3個(gè)處理組傷口愈合情況也比較好，結(jié)果顯示Fr.B軟膏組傷口面積降低到(68.50±5.10)%，F(xiàn)r.B軟膏+1%紅霉素軟膏組和Fr.B軟膏+0.1%紅霉素軟膏組的傷口面積分別減少到(65.29±9.94)%和(66.64±8.87)%。由此可知，F(xiàn)r.B具有一定的促傷口愈合作用，這與上述的研究結(jié)果一致。隨著繼續(xù)不同軟膏的混用治療，在處理的第6天可以觀察到，基質(zhì)組傷口面積減少到(58.40%±7.13)%，1%紅霉素軟膏組、基質(zhì)+1%紅霉素軟膏組和基質(zhì)+0.1%紅霉素軟膏組的傷口面積的變化相差不大，分別減少到(49.95±15.97)%、(43.11±4.62)%、(48.66±4.72)%，與它們相比，含有Fr.B的3個(gè)處理組傷口愈合情況較好，結(jié)果顯示Fr.B軟膏組、Fr.B軟膏+1%紅霉素軟膏組與Fr.B軟膏+0.1%紅霉素軟膏組的傷口面積分別減少到(35.12±3.42)%、(26.20±7.88)%和(30.32±3.77)%，其中Fr.B軟膏+1%紅霉素軟膏組的療效最優(yōu)。在處理的第10天，基質(zhì)組、1%紅霉素軟膏組、基質(zhì)+1%紅霉素軟膏組、基質(zhì)+0.1%紅霉素軟膏組和Fr.B軟膏組的傷口面積分別減少到(33.69±2.87)%、(28.41±13.54)%、(20.04±3.15)%、(29.35±1.35)%和(20.50±1.25)%，與它們相比，F(xiàn)r.B軟膏+1%紅霉素軟膏組和Fr.B軟膏+0.1%紅霉素軟膏組的傷口愈合情況更好，傷口面積分別減少到(5.42±4.49)%和(11.43±1.61)%，其中Fr.B軟膏+1%紅霉素軟膏組的療效依然最優(yōu)。綜上所述，含有Fr.B的治療效果比含對(duì)照基質(zhì)組的治療效果好，F(xiàn)r.B軟膏+1%紅霉素軟膏比其他含有Fr.B軟膏組的治療效果好，F(xiàn)r.B軟膏+紅霉素軟膏比單獨(dú)紅霉素軟膏的治療效果好。由此說(shuō)明即使?jié)舛葴p半，F(xiàn)r.B軟膏和紅霉素軟膏的混用也比市場(chǎng)銷售的紅霉素軟膏有更好的治療效果。

A. 不同時(shí)間間隔的小鼠傷口愈合情況(? 基質(zhì)；? 1%紅霉素；?基質(zhì)+1%紅霉素；?基質(zhì)+0.1%紅霉素；?Fr.B；?Fr.B+1%紅霉素；?Fr.B+0.1%紅霉素)；B. 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠傷口愈合情況的定量分析結(jié)果；C. 不同處理下小鼠創(chuàng)面菌落計(jì)數(shù)。Em.紅霉素，**.P<0.01，***.P<0.001圖6 Fr.B軟膏與紅霉素軟膏混用對(duì)小鼠傷口感染模型的治療作用A. Wound healing of mice at different time intervals (? Base material; ? 1% Erythromycin; ?Base material + 1% Erythromycin; ? Base material + 0.1% Erythromycin; ? Fr.B; ? Fr.B + 1% Erythromycin; ? Fr.B + 0.1% Erythromycin); B. Quantitative analysis results of wound healing in mice at different time points; C. The count of bacterial colonies on the wound surface of mice under different treatments. Em. Erythromycin, **. P<0.01, ***. P<0.001Fig.6 The rapeutic effect of Fr.B ointment combined with erythromycin ointment on mice wound infection model

最后，我們同樣在處理第4天時(shí)對(duì)小鼠創(chuàng)面進(jìn)行MRSA的菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖6，C所示，基質(zhì)組、Fr.B軟膏組、基質(zhì)+0.1%紅霉素軟膏組和基質(zhì)+1%紅霉素軟膏組的小鼠每克傷口菌落數(shù)分別為7.46×107、3.82×107、2.45×107和1.04×107個(gè)，均多于1%紅霉素軟膏組每克傷口組織的菌落數(shù)1.15×106個(gè)和Fr.B軟膏+0.1%紅霉素軟膏組每克傷口組織的菌落數(shù)1.19×106個(gè)，而Fr.B軟膏與1%紅霉素軟膏的混用對(duì)小鼠傷口的治療效果最佳，其每克傷口組織的菌落數(shù)僅為2.80×104個(gè)。由此表明即使?jié)舛葴p半，F(xiàn)r.B也能夠顯著增強(qiáng)紅霉素對(duì)MRSA菌株的殺菌能力且其聯(lián)合治療的效果顯著優(yōu)于原濃度的紅霉素。綜上，說(shuō)明單獨(dú)制備的Fr.B軟膏與市場(chǎng)銷售的紅霉素軟膏按一定比例混合使用時(shí)也能獲得良好的治療效果且其療效顯著優(yōu)于市場(chǎng)銷售的紅霉素軟膏。

3 結(jié)論與討論

本研究在Fr.2a[28]的基礎(chǔ)上，利用硅膠柱層析結(jié)合活性追蹤對(duì)酸棗果氯仿提取物中其他極性范圍的抗菌増效活性成分進(jìn)行了分離純化。將得到具有抗菌增效活性的精制物命名為Fr.B，經(jīng)GC-MS、紅外光譜和核磁共振氫譜分析發(fā)現(xiàn)Fr.B主要包含反油酸、油酸、順-10-十六碳烯醇、棕櫚酸等25種脂肪酸類化合物。通過(guò)Fr.B與抗生素聯(lián)合使用對(duì)供試菌株的體外抗菌增效活性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)r.B能不同程度地顯著增強(qiáng)多種抗生素對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、糞腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和白色念珠菌的抗菌效果，其中對(duì)MRSA和白色念珠菌的抗菌增效作用尤為明顯，表明Fr.B具有廣譜的抗菌增效活性，能有效逆轉(zhuǎn)耐藥菌的耐藥性。而Fr.B的這種抗菌増效活性主要通過(guò)增強(qiáng)耐藥菌的細(xì)胞通透性來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)小鼠傷口感染模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Fr.B與紅霉素聯(lián)用能顯著增強(qiáng)紅霉素對(duì)MRSA菌株的抗菌作用，以逆轉(zhuǎn)MRSA菌株對(duì)紅霉素的耐藥性，從而促進(jìn)MRSA感染傷口的快速愈合。

已有很多研究顯示游離脂肪酸具有殺菌活性[35-38]。例如，月桂酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌具有抗菌活性[39]；月桂酸和亞油酸對(duì)李斯特菌也具有很強(qiáng)的殺菌活性[40]；癸酸對(duì)食源性感染有關(guān)的陰性菌，如對(duì)空腸彎曲桿菌和大腸桿菌具有很強(qiáng)的殺菌活性[34]。游離脂肪酸除了本身具有殺菌作用外，還具有抗菌増效作用。例如，Kitahara等發(fā)現(xiàn)濃度為5 μg/mL的月桂酸能增強(qiáng)慶大霉素或亞胺培南對(duì)3種臨床MRSA菌株的抗菌作用[41]；Chan等研究顯示亞油酸和油酸可以分別協(xié)同紅霉素增強(qiáng)對(duì)MRSA的抗菌活性[16]。這些結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)由脂肪酸類化合物組成的Fr.B具有廣譜抗菌增效活性的結(jié)果相一致。目前已知的游離脂肪酸的抗菌機(jī)制主要包括以下三個(gè)方面[34]：(1)增加膜的通透性和細(xì)胞的裂解；(2)破壞電子傳遞鏈和解偶聯(lián)氧化磷酸化；(3)抑制膜結(jié)合酶活性和養(yǎng)分吸收。本研究發(fā)現(xiàn)由脂肪酸類化合物組成的Fr.B主要通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的通透性，從而可能因此增強(qiáng)抗生素對(duì)耐藥菌的抗菌作用，這與前人提出的游離脂肪酸的抗菌機(jī)制相符合。Fr.B除了具有廣譜的抗菌增效活性外，本研究在小鼠傷口感染模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Fr.B還具有消炎和促進(jìn)傷口愈合的作用，這也與其他研究報(bào)道脂肪酸具有調(diào)節(jié)傷口炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)傷口愈合的結(jié)果[42-43]相一致。Cardoso等發(fā)現(xiàn)脂肪酸可通過(guò)抑制傷口處一氧化氮的產(chǎn)生而加速小鼠傷口愈合[42]。同樣，在大鼠傷口愈合的炎癥期，脂肪酸可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α(VEGF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生以及刺激炎癥2 α/β (CINC-2α/β)中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生，從而起促炎作用而加速傷口的愈合過(guò)程[43]。綜上，作為植物天然提取物的Fr.B，因其能夠有效逆轉(zhuǎn)耐藥菌的耐藥性，而顯著增強(qiáng)抗生素在治療耐藥菌引起的傷口感染中的療效，所以其具有被開(kāi)發(fā)成治療皮膚耐藥菌感染的輔助性藥物的潛力。

致謝：特別感謝西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的劉成程副教授為本研究提供了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株。