張錚旭，程子豪，陳 曦，張成義

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是機(jī)體在受到各種嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、灼傷等感染與非感染刺激時，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞過度激活并釋放大量的炎癥因子，從而引發(fā)的一種難以控制的全身性瀑布式炎癥反應(yīng)綜合征，是機(jī)體在進(jìn)行自我修復(fù)過程中出現(xiàn)過度應(yīng)激反應(yīng)的一種臨床過程，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官功能障礙[1-2].有研究[3-4]表明：SIRS患者存在著嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，部分患者治療后期病情或出現(xiàn)突然加重情況，并危及生命.

毛櫻桃果實中富含維生素、有機(jī)酸和黃酮等物質(zhì)，藥用價值較高[5].黃酮是一種廣泛存在于植物中的天然物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗真菌和抗炎等作用[6-7].本課題組前期研究[5，8]顯示：毛櫻桃總黃酮(Prunustomentosathunb total flavones，PTF)具有明確的抗炎作用，但對酵母多糖(zymosan，ZYM)誘導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)綜合征小鼠是否具有保護(hù)作用尚不清楚.因此，本研究旨在觀察PTF對酵母多糖誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征小鼠的影響，從而為PTF抗SIRS研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗動物、主要儀器和試劑

清潔級ICR雄性小鼠(長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司)60只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g.毛櫻桃總黃酮(北華大學(xué)藥學(xué)院實驗室自制)；酵母多糖(Sigma公司，美國)；無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司)；TNF-α、IL-1β及IL-6酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，美國).

1.2 SIRS動物模型的建立

將酵母多糖粉劑加入生理鹽水(100 mg/mL)中高頻振蕩30 min，形成均勻懸液，再放入100 ℃水浴鍋中消毒滅菌80 min，冷卻后置于4 ℃冰箱備用.造模前將酵母多糖混懸液加熱至40 ℃，搖晃均勻后使用.末次給藥1 h后，采用腹腔注射酵母多糖混懸液法制作小鼠SIRS模型，空白組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水.SIRS動物造模成功標(biāo)準(zhǔn)：直腸溫度較正?；騻吧呋蚪档? ℃；白細(xì)胞總數(shù)超過對照值的2倍或減少50%；臟器有病理學(xué)改變；相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)生改變[9-10].

1.3 動物分組與給藥

將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組，即空白組、模型組、地塞米松組(0.125 mg/kg)、PTF低、中、高劑量組(100、200、400 mg/kg)，每組10只.地塞米松和PTF各劑量給藥組預(yù)防性灌胃給藥7 d，末次給藥前1 d各組動物禁食不禁水.給藥1 h后，模型組、地塞米松組及PTF各劑量給藥組小鼠腹腔注射酵母多糖混懸液500 mg/kg，空白組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水.

1.4 小鼠體溫與白細(xì)胞檢測

給藥期間及末次給藥前測量小鼠肛溫，造模24 h后，再次測量小鼠肛溫；然后麻醉小鼠并眼球取血，取全血20 μL，置于裝有180 μL白細(xì)胞稀釋液的EP管中，混勻，進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù).

1.5 小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子含量檢測

取小鼠全血，在室溫靜置30 min，4 ℃離心，3 000 r/min離心15 min后取血清，按照酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量.取血清，用酶標(biāo)儀檢測SOD活性和MDA的含量.

1.6 HE染色后小鼠病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

將小鼠麻醉處死后，取肺組織、腎組織及肝組織固定于10%的甲醛中，石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠的肺組織、腎組織和肝組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn).

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PTF對SIRS模型小鼠體溫的影響

與空白組比較，模型組小鼠體溫顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PTF中、高劑量組和地塞米松組小鼠的體溫均顯著升高(均P<0.01)；造模前各組小鼠體溫比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).見表1.

表1 PTF對SIRS小鼠體溫的影響Tab.1 Effect of PTF on body temperature in mice with SIRS

2.2 PTF對SIRS模型小鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響

與空白組比較，模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.001)；與模型組比較，PTF中、高劑量組和地塞米松組均可顯著提高SIRS模型小鼠白細(xì)胞數(shù)量(均P<0.05).見圖1.

2.3 PTF對SIRS模型小鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6的含量顯著提高(P<0.001)；與模型組比較，PTF中、高劑量組和地塞米松組均可顯著降低SIRS模型小鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6的含量(均P<0.05).見圖2～4.

注:與空白組比較,###.P<0.001;與模型組比較,*.P<0.05.圖1PTF對SIRS小鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.1Effect of PTF on white blood cell in mice with SIRS注:與空白組比較,###.P<0.001;與模型組比較,***.P<0.001.圖2PTF對SIRS小鼠血清中TNF-α含量的影響Fig.2Effect of PTF on the level of TNF-α in peripheral blood of mice with SIRS注:與空白組比較,###.P<0.001;與模型組比較,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.圖3PTF對SIRS小鼠血清中IL-1β含量的影響Fig.3Effect of PTF on the level of IL-1β in peripheral blood of mice with SIRS注:與空白組比較,###.P<0.001;與模型組比較,***.P<0.001.圖4PTF對SIRS小鼠血清中IL-6含量的影響Fig.4Effect of PTF on the level of IL-6 in peripheral blood of mice with SIRS

2.4 PTF對SIRS模型小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，PTF高劑量組和地塞米松組均可顯著提高SIRS模型小鼠血清中SOD的活性，且均可顯著降低SIRS模型小鼠血清中MDA的含量(均P<0.05).見圖5～6.

注:與空白組比較,#.P<0.05;與模型組比較,*.P<0.05.圖5PTF對SIRS小鼠血清中SOD含量的影響Fig.5Effect of PTF on the level of SOD in peripheral blood of mice with SIRS注:與空白組比較,##.P<0.01;與模型組比較,*.P<0.05.圖6PTF對SIRS小鼠血清中MDA含量的影響Fig.6Effects of PTF on the level of MDA in peripheralblood of mice with SIRS

2.5 PTF對SIRS模型小鼠臟器組織病理學(xué)影響

病理學(xué)結(jié)果顯示：空白組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管和肺泡的結(jié)構(gòu)完整正常，充氣良好；支氣管黏膜完整，無明顯充血及炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁厚薄一致.見圖7 a.模型組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，充氣量明顯減少；肺泡壁增厚、塌陷融合，肺泡大小不一且少部分肺泡萎陷；大量炎細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管管腔狹窄；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，肺間質(zhì)與肺泡腔小片狀出血.見圖7 b.PTF中、高劑量組和地塞米松組肺組織充氣量明顯增加，萎陷的肺泡數(shù)量減少，肺泡擴(kuò)張較為廣泛，炎細(xì)胞浸潤減少.見圖7 c、e、f.

a.CON；b.MOD；c.DXM；d.PTF(100 mg/kg)；e.PTF(200 mg/kg)；f.PTF(400 mg/kg).圖7 PTF對SIRS小鼠肺組織的影響Fig.7 Effect of PTF on lung issue in mice with SIRS

病理學(xué)結(jié)果顯示：空白組腎組織結(jié)構(gòu)清晰，無細(xì)胞腫脹、炎細(xì)胞浸潤及蛋白滲出.見圖8 a.模型組腎組織皮質(zhì)蒼白，腎小球萎縮，腎小管擴(kuò)張且腔內(nèi)有時可見脫落的壞死組織；漿細(xì)胞和纖維蛋白滲出，間質(zhì)可見細(xì)胞腫脹、出血和散在的淋巴細(xì)胞浸潤.見圖8 b.PTF高劑量組和地塞米松組腎小管上皮細(xì)胞腫脹程度減輕，蛋白滲出和炎細(xì)胞浸潤減少；腎間質(zhì)輕度充血、水腫，腎小管腔內(nèi)偶見脫落的壞死組織.見圖8 c、f.

a.CON；b.MOD；c.DXM；d.PTF(100 mg/kg)；e.PTF(200 mg/kg)；f.PTF(400 mg/kg).圖8 PTF對SIRS小鼠腎組織的影響Fig.8 Effect of PTF on kidney issue in mice with SIRS

病理學(xué)結(jié)果顯示：空白組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊且大小和形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，未見細(xì)胞點狀壞死和變形.見圖9 a.模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，組織中可見肝細(xì)胞細(xì)胞腫脹，壞死處可見肝血管擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞片狀壞死及大量炎細(xì)胞浸潤.見圖9 b.PTF高劑量組和地塞米松組肝臟結(jié)構(gòu)較為清晰，肝細(xì)胞排列比較整齊；細(xì)胞點狀壞死程度減輕，細(xì)胞腫脹程度明顯減輕，僅可見少量炎細(xì)胞浸潤.見圖9 c、f.

a.CON；b.MOD；c.DXM；d.PTF(100 mg/kg)；e.PTF(200 mg/kg)；f.PTF(400 mg/kg).圖9 PTF對SIRS小鼠肝組織的影響Fig.9 Effect of PTF on liver issue in mice with SIRS

3 討 論

SIRS是一種危重急癥常見的炎癥反應(yīng)，是因機(jī)體在遭受感染或外源損傷時引起的過度應(yīng)激反應(yīng)，是機(jī)體在修復(fù)和生存過程中出現(xiàn)的一種病理過程.在出現(xiàn)嚴(yán)重感染時，機(jī)體大量釋放多種細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)，如IL-1β、TNF-α及IL-6等炎癥因子，可抑制單核-巨噬細(xì)胞活化，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫紊亂和炎癥失控，從而產(chǎn)生“瀑布效應(yīng)”[11-12].SIRS控制不當(dāng)會引發(fā)一系列癥狀，嚴(yán)重者通常會發(fā)展成多器官功能障礙，如肺損傷、肝損傷及腎損傷等，其中肺損傷是SIRS發(fā)生后較早出現(xiàn)同時也是最常見的并發(fā)癥[13].

酵母多糖是大分子多糖成分，來源于釀酒酵母細(xì)胞壁的物質(zhì)，低劑量酵母多糖腹腔注射動物體內(nèi)可激活酵母多糖-巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)大量的炎癥介質(zhì)，造成炎癥反應(yīng)，從而成功構(gòu)建SIRS模型，廣泛應(yīng)用于SIRS和多器官功能障礙的研究.該炎癥模型致病因素簡單明確，制備步驟便于復(fù)制，無外源性感染因素，具有明顯的全身炎癥反應(yīng)表現(xiàn)[14].本研究中，小鼠腹腔注射500 mg/kg酵母多糖混懸液后，小鼠體溫下降，白細(xì)胞總數(shù)減少，血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6含量升高，肺組織、腎組織及肝組織發(fā)生病理學(xué)改變，均提示小鼠SIRS模型成功建立.

抑制炎癥因子的大量釋放是降低SIRS病程惡化的關(guān)鍵，其中以IL-1β、TNF-α及IL-6最為重要.IL-1β、TNF-α及IL-6是機(jī)體重要的炎癥反應(yīng)指標(biāo)，參與各種炎癥反應(yīng)，是目前研究較多的炎癥因子.IL-1β的生物學(xué)效應(yīng)廣泛，是免疫宿主反應(yīng)的前炎癥細(xì)胞因子，可激活體內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，能夠提高其他炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化和游走，引起炎癥反應(yīng)，在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[15]；IL-6由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞釋放，在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，血清或血漿中的IL-6水平會顯著上升，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)；TNF-α是SIRS的始發(fā)因子，同時也是腫瘤壞死因子家族的重要成員，可激活各種炎癥細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)，是一種經(jīng)典的炎癥因子.

炎癥是機(jī)體在應(yīng)對各類感染或組織損傷時所產(chǎn)生的以刺激性防御反應(yīng)為主的過程，而氧化應(yīng)激也是炎癥反應(yīng)過程中的一個重要組成部分，其中SOD和MDA是評價機(jī)體氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo).SOD是機(jī)體內(nèi)清除超氧自由基中重要的抗氧化酶，具有抗炎、抗衰老及抗氧化等作用，其活力的高低反映了機(jī)體抗氧化能力；MDA是體內(nèi)脂質(zhì)被自由基攻擊所產(chǎn)生的過氧化終產(chǎn)物，其含量的高低可反映氧自由基含量變化和體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度.本研究結(jié)果顯示：模型組小鼠腹腔注射酵母多糖混懸液誘導(dǎo)SIRS后，小鼠血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高，SOD活性顯著下降，MDA含量顯著上升；經(jīng)過PTF預(yù)處理后，小鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低，SOD活性顯著升高，而MDA含量顯著降低，提示PTF可以有效減輕并預(yù)防酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠SIRS反應(yīng).

病理學(xué)結(jié)果顯示：模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤，充氣量明顯減少；腎組織皮質(zhì)蒼白，腎小球萎縮，可見細(xì)胞腫脹、出血和散在的淋巴細(xì)胞浸潤；肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見肝細(xì)胞片狀壞死及大量炎癥細(xì)胞浸潤.經(jīng)PTF預(yù)處理后，小鼠肺組織、腎組織及肝組織病理學(xué)病變程度均明顯減輕，提示PTF可有效減輕酵母多糖誘導(dǎo)的SIRS小鼠肺組織、腎組織及肝組織損傷.

綜上所述，PTF可有效預(yù)防并降低由酵母多糖導(dǎo)致的小鼠SIRS反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度、減少氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而對SIRS起到有效保護(hù)作用的.