李 凡，樸香花，馬 越，段顯亮

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

骨肉瘤是一種起源于骨間葉細(xì)胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其特征為增殖的腫瘤細(xì)胞直接形成未成熟骨或骨樣組織，好發(fā)于兒童與青少年，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，發(fā)病早期就容易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，5 a生存率很低，嚴(yán)重威脅著患者健康和生命[1-3].目前，手術(shù)切除結(jié)合輔助化療仍是骨肉瘤的主要治療手段，雖然患者的保肢率及存活率有所提高，但仍有部分患者治療效果欠佳，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，預(yù)后不理想.因此，探討骨肉瘤發(fā)病機(jī)制及治療骨肉瘤的新方法對(duì)改善患者預(yù)后和延長(zhǎng)生存期具有重要意義.

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，VEGFR-TKI)可以逆轉(zhuǎn)免疫療法藥物的局部微環(huán)境，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性[4]，其代表藥物為舒尼替尼.舒尼替尼是目前最新的靶向治療藥物，也是雙通道、多靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑，主要應(yīng)用在骨肉瘤的治療上.有研究[5-6]顯示：舒尼替尼在多種腫瘤中均發(fā)揮著較好的抗癌作用.還有研究[7-8]顯示：程序性死亡受體蛋白-1(PD-1)及其配體(PD-L1)抑制劑在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中高表達(dá)，PD-L1分布在癌細(xì)胞表面，通過(guò)T細(xì)胞表面上的PD-1抑制T細(xì)胞免疫活性，可以幫助腫瘤細(xì)胞躲避免疫細(xì)胞攻擊.本研究主要探討可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性的藥物舒尼替尼利用PD-1及其PD-L1抑制劑治療轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材 料

骨肉瘤KRIB、U2OS、143B、MG63.2、LM-7和SAOS-2細(xì)胞(美國(guó)生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心(ATCC)，美國(guó))；Eagle培養(yǎng)基、10%的胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美國(guó))；100 U/mL青霉素和100 lg/mL鏈霉素(上海生工生物科技有限公司)；SDS-PAGE試劑盒(Bio-Rad公司，美國(guó))；CCK8(Dojindo公司，日本)；實(shí)驗(yàn)小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液、NC膜，PD-L1、p-STAT3、STAT3抗體(武漢博士德生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 CCK法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

將骨肉瘤細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜.然后將細(xì)胞置于舒尼替尼中37 ℃培養(yǎng)24 h，應(yīng)用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力.

1.2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)

將骨肉瘤細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，細(xì)胞接種量為每孔6×104細(xì)胞，Transwell小室孔徑為8 μm.Transwell小室細(xì)胞在1%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，下室中加入500 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)基.培養(yǎng)24 h后，Transwell小室底部細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，再用 4 ℃甲醇固定30 min，然后將固定的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色.在顯微鏡下評(píng)估遷移的細(xì)胞群，每孔分成5個(gè)視野，計(jì)算遷移細(xì)胞個(gè)數(shù).實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次.

1.2.3 Western blot 法檢測(cè)PD-L1、 p-STAT3、 STAT3含量

將骨肉瘤KRIB、U2OS、143B、MG 63.2、LM-7和SAOS-2細(xì)胞置于Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)添加10%胎牛血、100 U/mL青霉素和100 lg/mL鏈霉素，然后收集各組細(xì)胞.采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，再用10%的SDS/PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到NC膜上.在脫脂牛奶中封閉1 h后，NC膜在4 ℃(1∶1 000稀釋)的PD-L1、 p-STAT3、 STAT3一抗中培育過(guò)夜.第2天使用二抗培育后，用Western blot檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)PD-L1、 p-STAT3、 STAT3的含量，使用Image J軟件進(jìn)行結(jié)果的量化和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.2.4 動(dòng)物模型

選擇雌性BALB/c裸鼠(長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，6～8周齡，體質(zhì)量約20 g，小鼠在無(wú)菌條件下飼養(yǎng).所有實(shí)驗(yàn)流程按照北華大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的現(xiàn)行條例和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行.首先將5×106的KHOS/NP人骨肉瘤細(xì)胞通過(guò)皮下注射方式注射到小鼠的右側(cè)腹部皮下，建立小鼠原發(fā)性骨肉瘤模型；通過(guò)小鼠尾靜脈注射5×106K7M2細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)移的骨肉瘤腫瘤模型.在注射后的第5天將模型小鼠分為4組，A組給予40 mg/kg舒尼替尼，B組給予10 mg/kg PD-L1，C組給予40 mg/kg舒尼替尼和10 mg/kg PD-L1聯(lián)合治療，D組PBS對(duì)照，上述藥物或試劑均通過(guò)腹腔內(nèi)注射給藥，1次/3 d，共4周.每5 d測(cè)量1次腫瘤的體積：腫瘤體積=(長(zhǎng)度×寬度×寬度)/2，直至小鼠死亡.對(duì)于有轉(zhuǎn)移的骨肉瘤小鼠，測(cè)量其肺組織質(zhì)量，同時(shí)染色小鼠的肺組織，以確定骨肉瘤細(xì)胞百分比.

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)染色

將單細(xì)胞腫瘤置于含5%胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析CD5、CD4、CD25和Foxp3染色對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的作用，分析CD8染色對(duì)CD8+T細(xì)胞的作用.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各骨肉瘤細(xì)胞系中PD-L1表達(dá)水平

PD-L1表達(dá)水平在各骨肉瘤細(xì)胞間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，KRIB、U2OS、143B和LM7細(xì)胞中表達(dá)水平較高，而在MG 63.2和SAOS-2細(xì)胞中表達(dá)水平較低.見(jiàn)表1.

表1 各骨肉瘤細(xì)胞系中PD-L1的表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of PD-L1 in each osteosarcoma cell line

2.2 舒尼替尼對(duì)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響

本研究結(jié)果顯示：舒尼替尼的濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L時(shí)，舒尼替尼對(duì)KRIB和LM7骨肉瘤細(xì)胞的活力影響沒(méi)有明顯差異.見(jiàn)圖1.通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：舒尼替尼可顯著降低KRIB和LM7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，舒尼替尼能有效降低骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性.見(jiàn)圖2 a、2 b.

圖1 舒尼替尼在不同濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of Sunitinib on cell activity at different concentrations

圖2 舒尼替尼對(duì)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響Fig.2 Effect of Sunitinib on metastasis and invasion of sarcoma cells

2.3 舒尼替尼調(diào)控143B和LM7細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)機(jī)制

應(yīng)用舒尼替尼治療后，通過(guò)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞基因下游STAT3信號(hào)分子，證實(shí)舒尼替尼可明顯降低KRIB和LM7細(xì)胞中STAT3的激活.本研究結(jié)果表明，舒尼替尼通過(guò)調(diào)控STAT3的失活而抑制PD-L1的表達(dá).見(jiàn)圖3 a和b.

圖3 LM7和KRIB中標(biāo)記物的表達(dá)Fig.3 Expression of markers in LM7 and KRIB

2.4 舒尼替尼對(duì)骨肉瘤荷瘤小鼠存活率的影響

本研究結(jié)果顯示：舒尼替尼和a-PD-L1抗體治療均可抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，聯(lián)合治療效果更明顯.在轉(zhuǎn)移癌模型中，應(yīng)用舒尼替尼和抗PD-L1抗體治療結(jié)果相同，骨肉瘤的平均轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著減少，小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng)，明顯優(yōu)于接受PBS治療的對(duì)照組小鼠，聯(lián)合治療療效更顯著.見(jiàn)圖4.

圖4 舒尼替尼對(duì)骨肉瘤荷瘤小鼠存活率的影響Fig.4 Effect of Sunitinib on survival rate of osteosarcoma bearing mice

2.5 舒尼替尼對(duì)骨肉瘤荷瘤小鼠免疫細(xì)胞群數(shù)量的影響

本研究結(jié)果顯示：舒尼替尼和抗PD-L1抗體處理組的CD8+T淋巴細(xì)胞比例較高，優(yōu)于對(duì)照組；舒尼替尼或抗PD-L1抗體治療組中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例低于對(duì)照組，表明舒尼替尼可減少Treg數(shù)量，減輕免疫抑制的作用.見(jiàn)圖5～6.

圖5 各種治療方案中CD8+T細(xì)胞表達(dá)Fig.5 Expression of CD8+T cells in various treatment regimens

圖6 各種治療方案中Treg細(xì)胞表達(dá)Fig.6 Expression of Treg cells in various treatment regimens

3 討 論

目前，治療骨肉瘤最有效的方法仍然是新輔助化療結(jié)合手術(shù)切除，然而，高達(dá)40%的患者接受化療后還是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗，因此，尋找有效改善骨肉瘤預(yù)后的新途徑迫在眉睫.近年來(lái)，免疫治療取得了顯著進(jìn)展[9]，廣泛應(yīng)用于腫瘤治療，尤其對(duì)黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌和腎癌等，并作為免疫檢查點(diǎn)，可預(yù)防和維持免疫系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定[10-11].由于骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制和免疫特性，骨肉瘤被認(rèn)為是免疫療法的完美候選者.

抗血管生成靶向治療可通過(guò)降低腫瘤血管數(shù)量使腫瘤血管失活，改變腫瘤的免疫微環(huán)境.在一項(xiàng)Ⅲ期隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，28例上頜骨肉瘤患者中有1例在接受nivolumab聯(lián)合pazopanib治療后得到部分緩解[12].本研究中，2 μmol/L的舒尼替尼作用于骨肉瘤細(xì)胞后，能明顯減弱骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性.同時(shí)，在骨肉瘤組織細(xì)胞中未檢測(cè)出細(xì)胞毒性，提示舒尼替尼對(duì)骨肉瘤的轉(zhuǎn)移抑制有積極作用.STAT3轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)換器和激活器是參與腫瘤發(fā)展的常見(jiàn)腫瘤信號(hào)通路JAK/STAT的重要組成部分，阻斷STAT3可增加腫瘤組織中細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，激活先天基因免疫，激活樹突狀細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答.在本研究中，體外腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)舒尼替尼可通過(guò)靶向STAT3抑制PD-L1的表達(dá).

近年來(lái)，有研究[13]結(jié)果顯示：舒尼替尼不僅能通過(guò)靶向腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抗癌作用，還可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力.本研究結(jié)果顯示：舒尼替尼增加了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞的比例，這可能與腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)降低有關(guān)，我們將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí).舒尼替尼創(chuàng)造了一個(gè)良好的免疫微環(huán)境，與腫瘤相應(yīng)的抗體產(chǎn)生協(xié)同作用，從而提高腫瘤特異性抗原細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞水平，舒尼替尼通過(guò)直接接觸癌細(xì)胞并釋放穿孔素和顆粒酶B殺死癌細(xì)胞，因此，開發(fā)最佳的聯(lián)合免疫療法至關(guān)重要.本研究結(jié)果顯示：舒尼替尼降低了骨肉瘤中腫瘤浸潤(rùn)性Treg的比例，這一發(fā)現(xiàn)提示舒尼替尼能夠重塑腫瘤的微環(huán)境.VEGFR-TKI聯(lián)合抗PD-L1抗體在骨肉瘤治療中的作用目前還不清楚.本研究結(jié)果顯示：舒尼替尼聯(lián)合抗PD-L1抗體是一種有效的治療骨肉瘤策略，治療效果優(yōu)于單獨(dú)使用舒尼替尼.本研究結(jié)果顯示：舒尼替尼可以降低骨肉瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá).這些結(jié)果表明舒尼替尼能夠增強(qiáng)抗腫瘤活性，其不僅是通過(guò)抗血管生成作用，而且還可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸.

綜上所述，舒尼替尼通過(guò)靶向STAT3抑制PD-L1在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，并且能夠衰減轉(zhuǎn)移能力.此外，舒尼替尼可以增加CD8+T細(xì)胞的比例，降低骨肉瘤小鼠中Treg的比例，提示舒尼替尼可以重塑腫瘤微環(huán)境.我們期待針對(duì)骨肉瘤的雞尾酒免疫治療(舒尼替尼+PD-1/PD-L1抗體)能在臨床實(shí)驗(yàn)和實(shí)踐中發(fā)揮更大效能，達(dá)到很好的抗癌效果.