邵旭輝，丁希艷，李彥冬

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)能夠從多個分子水平調(diào)控基因表達，?；撬嵘险{(diào)基因(TUG1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的lncRNA基因，在膀胱癌、食管癌細胞中高表達[1-2]，但目前仍缺少關(guān)于TUG1在肝癌中表達及作用的相關(guān)研究報道.國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)[3]顯示：肝癌發(fā)病率位居全部惡性腫瘤的第5位，死亡率位居第2位，其發(fā)病機制仍未完全明確，探索相關(guān)分子機制對提高早期診斷率和改善臨床預(yù)后具有重要意義.本研究探討lncRNA TUG1在肝癌組織中的表達特點，并對肝癌細胞活性的影響和相關(guān)分子機制進行了研究，旨在為臨床診治提供新思路.

1 材料與方法

1.1 標本來源

標本收集于2016年3月—2020年5月北華大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療及肝臟穿刺確診的肝細胞癌患者，取其對應(yīng)的腫瘤組織、腫瘤邊緣組織以及周邊組織(無癌細胞組織)標本，另外一部分標本來源于既往實驗剩余標本，共126例，應(yīng)用原位雜交法檢測TUG1表達情況.患者均簽署知情同意書，且術(shù)前無放化療史.其中，男78例，女48例；年齡52～76歲，平均(62.91±5.08)歲；腫瘤直徑<5 cm 84例，≥5 cm 42例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期48例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例；腫瘤分化程度：高分化81例，中低分化45例.新鮮標本組織切除后放入液氮中凍存.

1.2 主要材料與試劑

肝癌細胞株HCCLM3(武漢普諾賽生命科技有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640細胞培養(yǎng)基(Sigma公司，美國)；Transwell小室(南京迅貝生物有限公司)；質(zhì)粒及通用型轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(弗元(上海)生物科技有限公司)；qRT-PCR引物序列由北京百奧思科生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成；磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B一抗和相應(yīng)的二抗(上海博湖生物有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 肝癌組織中l(wèi)ncRNA TUG1基因表達檢測

應(yīng)用原位雜交法檢測lncRNA TUG1基因表達：組織標本切片后80 ℃烘干1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫浸泡，4%多聚甲醛固定.按原位雜交檢測試劑盒說明書中的順序依次加入RNA雜交液、生物素標記的探針進行雜交反應(yīng)，以不含探針的預(yù)雜交液為陰性對照.使用全自動熒光原位雜交掃描分析系統(tǒng)讀取lncRNA TUG1基因表達水平.

1.3.2 細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染及分組

HCCLM3細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，觀察HCCLM3細胞基本覆蓋培育皿后，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗.將其分為3組：空白對照組(常規(guī)培養(yǎng))、si-NC組(常規(guī)培養(yǎng)24 h后加終濃度100 nmol/L的空載體質(zhì)粒)、si-TUG1組(常規(guī)培養(yǎng)24 h后加終濃度100 nmol/L的lncRNA TUG1表達抑制載體質(zhì)粒).

1.3.3 qRT-PCR檢測HCCLM3細胞中l(wèi)ncRNA TUG1基因表達水平

Trizol法提取空白對照組、si-NC組、si-TUG1組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進行PCR擴增；TUG1引物序列：正義鏈5′-TGTCTTCAGAGCC GAACGTA-3′，反義鏈5′-GGTAAAATCGTTGCGTC TTCG-3′；GAPDH引物序列：正義鏈5′-ACAACTT CAGTCTCCTCTGGTCC-3′，反義鏈5′-GTAACGGGA GTTGCTGGTGGAG-3′.PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，終延伸2 min，共40個循環(huán).以GAPDH為內(nèi)參計算相對表達量.

1.3.4 細胞遷移和侵襲能力檢測

細胞遷移實驗：將對數(shù)生長期空白對照組、si-NC組、si-TUG1組細胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，向Transwell小室的上室加入4×105個細胞，下室加入含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基.在37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上室中的培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，吸去上室中液體，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察、拍照.

細胞侵襲實驗：Matrigel基質(zhì)膠與無胎牛血清的培養(yǎng)基按1∶7的比例混合，在Transwell小室上室與下室之間鋪膠，按100 μL/孔均勻包被于小室底部膜，在37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中1 h成膠，其余步驟同細胞遷移實驗.每組設(shè)置10個復(fù)孔.

1.3.5 Western blot檢測細胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B蛋白表達

分別提取空白對照組、si-NC組、si-TUG1組細胞總蛋白，蛋白定量后電泳分離目標蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜后封閉；滴加兔抗人磷脂酰肌醇-3激酶單克隆抗體、兔抗人蛋白激酶B單克隆抗體(1∶300)稀釋；鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；滴加HRP滴加二抗(1∶1 000稀釋)，室溫反應(yīng)2 h；應(yīng)用E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析各條帶灰度值.

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA TUG1在肝癌組織中的表達分析

qRT-PCR檢測顯示：lncRNA TUG1在肝癌組織中的相對表達量為1.86±0.29，明顯高于癌旁正常組織中的相對表達量0.93±0.21，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.052，P=0.003).

2.2 肝癌組織中l(wèi)ncRNA TUG1基因表達與臨床病理特征的關(guān)系

肝癌組織中l(wèi)ncRNA TUG1基因高表達率在不同年齡、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度的肺癌患者之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001).見表1.

表1 肝癌組織中l(wèi)ncRNA TUG1基因表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between lncRNA TUG1 gene expression and clinic opathological features in hepatocellular carcinoma

2.3 各組肝癌細胞lncRNA TUG1基因表達水平

si-TUG1組肝癌細胞lncRNA TUG1基因相對表達量為0.95±0.17，明顯低于si-NC組、空白對照組的肝癌細胞lncRNA TUG1基因相對表達量(1.84±0.21、1.89±0.25)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.095、15.817，均P<0.001).

2.4 下調(diào)lncRNA TUG1基因表達對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響

肝癌細胞遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)在各組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；其中si-TUG1組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)明顯高于空白對照組、si-NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001).見圖1、表2.

a.空白對照組遷移細胞；b.si-NC組遷移細胞；c.si-TUG1組遷移細胞；d.空白對照組侵襲細胞；e.si-NC組侵襲細胞；f.si-TUG1組侵襲細胞.圖1 各組肝癌細胞遷移和侵襲情況(×200)Fig.1 Migration and invasion of hepatoma cells in each group(×200)

表2 各組肝癌細胞Transwell小室穿膜細胞數(shù)Tab.2 Number of transmembrane cells of liver cancer cells Transwell in each group

2.5 下調(diào)lncRNA TUG1對肝癌細胞磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B表達的影響

肝癌細胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表達量在各組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中si-TUG1組肝癌細胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表達量明顯低于空白對照組、si-NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).見圖2、表3.

圖2 各組肝癌細胞磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B表達的Western blot電泳Fig.2 Western blot electrophoresis of phosphatidy- linositol-3 kinase and protein kinase B expre- ssion of hepatoma cells in each group

表3 各組磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表達量Tab.3 Expression of phosphatidylinositol-3 kinase and protein kinase B in each group

3 討 論

我國肝癌的發(fā)病率和死亡率高于全球平均水平，快速進展和高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率是肝癌患者不良預(yù)后的主要原因[4].多種基因在惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用，其中，lncRNA是近年來研究的熱點之一.lncRNA是一類長度超過200個氨基酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平調(diào)控相關(guān)基因的表達，介導(dǎo)人體多種病理生理過程.目前，關(guān)于lncRNA在前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌中表達及作用的研究較多[5-8]，也有少量關(guān)于lncRNA在肝癌中表達及作用的研究報道[9]，但不夠全面，缺少關(guān)于lncRNA TUG1基因在肝癌中作用的系統(tǒng)研究.

lncRNA TUG1基因最先通過全基因組測序技術(shù)從小鼠腎臟細胞中篩選得到，之后發(fā)現(xiàn)在膀胱癌、食管癌細胞中高表達.本研究探討了lncRNA TUG1基因在肝癌組織中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系，顯示肝癌組織中l(wèi)ncRNA TUG1基因高表達率在不同年齡、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度的患者之間有明顯差異.提示lncRNA TUG1基因在肝癌發(fā)生與進展中可能發(fā)揮促癌基因的作用，其表達水平與臨床病理特征明顯相關(guān).進一步通過體外細胞學(xué)實驗驗證lncRNA TUG1基因表達對肝癌細胞的影響及相關(guān)分子機制，結(jié)果顯示：下調(diào)肝癌細胞中l(wèi)ncRNA TUG1基因表達后細胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，提示lncRNA TUG1基因高表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān).

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路是一個經(jīng)典的凋亡抑制信號傳遞通路，參與介導(dǎo)胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生與進展[10].磷脂酰肌醇-3激酶活化后能夠激活下游的蛋白激酶B，活化后的蛋白激酶B能夠介導(dǎo)下游多種凋亡基因的表達，導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因失活，抑制腫瘤細胞凋亡[11].本研究結(jié)果顯示：si-TUG1組肝癌細胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表達量明顯低于空白對照組、si-NC組.提示下調(diào)肝癌細胞中l(wèi)ncRNA TUG1基因表達能夠抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路，進而抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力.

綜上所述，lncRNA TUG1基因在肝癌組織中高表達，且與患者的臨床病理特征密切相關(guān).抑制lncRNA TUG1基因表達能夠降低肝癌細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能與影響磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路有關(guān).隨著對lncRNA TUG1在肝癌中作用機制的深入研究，能夠為肝癌的防治提供新的方向，其作為肝癌診斷的腫瘤標志物以及治療的新靶點，有望提高肝癌的早期診斷率和預(yù)后水平.