燕飛 湯永志 朱堅勝 陳華忠 朱敏 劉均艷

盡管乙肝疫苗已得到有效推廣和應用，但全球HBV感染患者仍有約2.5億例[1]。肝臟是HBV感染的主要靶器官，慢性肝炎可最終發(fā)展為纖維化、肝硬化，甚至發(fā)生肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[2]。然而，由于感染肝細胞中存在穩(wěn)定的共價封閉環(huán)狀DNA，HBV很難實現(xiàn)完全根除[3]。研究表明，HBV感染后，機體針對HBV的先天免疫反應和CD8+T細胞反應失調(diào)，引起抗病毒免疫反應受損，是導致病毒無法清除并持續(xù)感染的重要原因[4]。慢性HBV感染患者的多種免疫功能出現(xiàn)異常，如細胞毒性T淋巴細胞功能下降、調(diào)節(jié)性T細胞功能增強、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和自然殺傷細胞功能異常等。DC是一種抗原呈遞細胞，可以通過多種模式識別受體、捕捉病毒及其成分，進而產(chǎn)生大量抗病毒細胞因子，然后進行交叉呈遞并啟動病毒特異性細胞毒性T細胞[5-6]。機體感染HBV后，DC功能下降的機制包括HBV逃避DC的識別、被DC攝取加工以及在抗原呈遞過程中發(fā)生功能障礙。不同研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)感染HBV后，DC表面共刺激因子表達降低，異源刺激能力下降[7]。Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）是DC表面最具特征性模式識別受體之一，是先天性免疫屏障的重要組成部分，對入侵病原體產(chǎn)生防御性炎癥反應。TLR家族成員包括TLR1～TLR11，其中TLR4在肝病進展中起重要作用[8-9]。單核細胞來源樹突狀細胞（monocyte-derived dendritic cells，MoDC）和髓樣樹突狀細胞（myeloid dendritic cell，mDC）均表達細胞外及細胞內(nèi)的TLR，并能識別、結(jié)合TLR的特異性配體，促進DC的成熟和炎性因子的分泌。HBeAg在HBV慢性感染過程中起重要作用，可能對HBV感染患者的免疫應答起調(diào)節(jié)作用。本研究通過分離健康者單核細胞并將其與刺激因子共培養(yǎng)誘導為MoDC后，檢測HBeAg對MoDC表面TLR4及下游絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路蛋白及功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 重組人粒細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhGMCSF；批號：P04141）、重組白細胞介素-4（recombinant interleukin-4，rhIL-4；批號：P05112）均購自美國 R&D公司，細胞增殖與毒性檢測試劑盒（批號：G3582）購自美國 Promega公司，重組 HBeAg（批號：HBV-272）購自美國 Prospec公司，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；批號：916374）購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基（批號：SH30809.01）購自美國 Hyclone 公司，F(xiàn)BS（批號：16140063）購自美國Gibco公司，人淋巴細胞分離液（批號：GHSB 85-2001）購自上海華精生物高科技有限公司，抗人 CD11c-PE（批號：MHCD11C04）、抗人FITC-人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR（批號：11-9956-42）均購自美國 Ebioscience公司，TLR4一抗（批號：ab13556）購自英國Abcam公司，磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，pERK1/2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，pJNK）蛋白、磷酸化 p38（phosphorylated p38，pp38）一抗（批號：4370、4668、9212）均購自美國 Cell Signaling公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白一抗（批號：D110016-0100）購自上海生工生物工程股份有限公司，絲裂霉素C（批號：ROCHE 107409）購自美國Sigma公司，IL-12、IL-6的 ELISA檢測試劑盒（批號：F01380、F01310）均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DC體外誘導分化與MoDC表型鑒定 將新鮮分離的健康者外周血緩慢加入盛有淋巴細胞分離液的離心管中，經(jīng)梯度離心法獲得單核細胞，用RIPA1640洗滌細胞，棄上清液獲得人外周血單個核細胞，用RIPA1640懸浮細胞后放入37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)2 h，獲得貼壁細胞，即單核細胞。加入含20% FBS的RIPA1640及rhGM-CSF 750 U/ml+rhIL-4 870 U/ml細胞培養(yǎng)液，每2 d換液并補充rhGM-CSF、rhIL-4，7 d后收集懸浮細胞。在光鏡和電鏡下觀察細胞形態(tài)，采用流式細胞術鑒定細胞表型。

1.2.2 細胞分組 將誘導培養(yǎng)至第8天的MoDC分為HBeAg組（加入濃度為5 mg/L的HBeAg）及對照組（不加HBeAg），培養(yǎng)24 h；再加入濃度為1 mg/L的LPS刺激MoDC成熟，收集培養(yǎng)至第9天懸浮細胞進行以下各項檢測。

1.2.3 MoDC表面TLR4及MAPK信號通路蛋白表達檢測 采用Western blot法。收集各組培養(yǎng)9 d的MoDC，使用細胞裂解液裂解細胞、提取蛋白并測定蛋白濃度后，等量上樣，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，加入Western封閉液后，加入相應一抗，4℃孵育過夜，洗滌后加入相應二抗，室溫孵育2 h后洗滌，使用ECL發(fā)光液顯影、定影。蛋白條帶使用UVI凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantlty one軟件測定各組蛋白灰度值。

1.2.4 MoDC刺激同種異基因淋巴細胞增殖能力檢測采用同種異基因混合淋巴細胞反應試驗。采用上述方法獲得另一正常人的外周血單個核細胞并收集懸浮細胞，加入含20% FBS的RIPA1640懸浮細胞，即淋巴細胞。收集培養(yǎng)至第9天的MoDC并用絲裂霉素C處理，即刺激細胞。MoDC 與淋巴細胞按 1∶5、1∶10、1∶20的比例分別置于96孔板，每組設置3個復孔，于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μl細胞增殖與毒性檢測試劑，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，在490 nm處讀取吸光度值。刺激指數(shù)=（吸光度值HBeAg組-吸光度值本底）（/吸光度值無HBeAg組-吸光度值本底）。

1.2.5 MoDC分泌下游細胞因子（IL-12、IL-6）水平檢測 采用ELISA法。收集各組培養(yǎng)9 d的MoDC上清液，按照ELISA試劑盒操作說明書檢測IL-12、IL-6水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MoDC形態(tài)及表型鑒定 外周血單核細胞經(jīng)刺激因子誘導7 d后在光境下呈簇狀生長，大部分細胞脫落，懸浮生長，表面不規(guī)則，見圖1a（插頁）；在電鏡下細胞表面粗糙不規(guī)則，有大量長短、粗細不一的樹枝樣突起，呈現(xiàn)典型的DC形態(tài)，見圖1b（插頁）。加入rhGM-CSF、rhIL-4誘導培養(yǎng) 7 d的懸浮細胞中CD11c/HLA-DR 雙陽性表達率為（86.20±1.85）%，明顯高于未加 rhGM-CSF、rhIL-4組的（9.01±1.12）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2（插頁）。

圖1 單核細胞來源樹突狀細胞（MoDC）形態(tài)觀察（a：光鏡下所見，×400；b：電鏡下所見，×3 820）

圖2 樹突狀細胞（DC）表面CD11c/人類白細胞抗原（HLA）-DR雙標流式表型[a：單純培養(yǎng)的懸浮細胞；b：重組人粒細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）聯(lián)合重組白細胞介素-4（rhIL-4）培養(yǎng)7 d的懸浮細胞]

2.2 HBeAg對MoDC表面TLR4及MAPK信號通路蛋白表達的影響 HBeAg刺激組 TLR4、pp38、pJNK、pERK1/2蛋白表達均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3和表1。

圖3 HBeAg刺激組與對照組單核細胞來源樹突狀細胞（MoDC）表面 Toll樣受體 4（TLR4）及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路蛋白表達的電泳圖（pp38為磷酸化p38；pJNK為磷酸化c-Jun氨基末端激酶；pERK1/2為磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；GADPH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶）

表1 HBeAg刺激組與對照組MoDC表面TLR4及MAPK信號通路蛋白表達比較

2.3 HBeAg對MoDC刺激同種異基因淋巴細胞增殖能力的影響 加入不同比例的MoDC后，HBeAg刺激組MoDC刺激指數(shù)均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見表2。

表2 HBeAg刺激組與對照組加入不同比例MoDC的刺激指數(shù)比較

2.4 HBeAg對MoDC分泌 IL-12、IL-6水平的影響HBeAg刺激組MoDC分泌IL-12、IL-6水平均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 HBeAg刺激組與對照組MoDC下游細胞因子水平比較（μg/L）

3 討論

中國是HBV中度流行地區(qū)，HBV的治療是我國面臨的嚴峻挑戰(zhàn)之一。部分患者經(jīng)歷急性HBV感染后無法清除病毒，而持續(xù)感染狀態(tài)可能進一步導致慢性肝臟疾病[10]。機體感染HBV后的病情發(fā)展變化是由病毒和宿主的免疫系統(tǒng)相互決定的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染后完全清除病毒的患者表現(xiàn)出明顯的特異性T細胞及體液免疫反應，而慢性感染者則表現(xiàn)為免疫反應受損[12-13]。目前普遍認為免疫反應受損或減弱是引起HBV慢性感染的關鍵原因。肝細胞不能通過已知的信號通路有效識別HBV，提示可能存在HBV免疫逃避機制[14]。研究表明，HBV可以抑制固有免疫細胞功能，使其免疫反應減弱[15-16]。慢性HBV感染者T細胞數(shù)量減少、免疫功能低下，導致機體對HBV難以產(chǎn)生有效的免疫應答反應，被認為是HBV感染慢性化的重要機制之一[17-19]。相關研究表明，慢性HBV感染可以被功能完整的免疫系統(tǒng)清除，也可能通過激活肝細胞和免疫細胞功能來抑制HBV的復制[20]。因此在體內(nèi)激活針對HBV的特異的T淋巴細胞反應可能是改變慢性HBV感染狀態(tài)的關鍵。

DC具有將外源性抗原呈遞到主要組織相容性抗原（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類細胞進一步激活CD4+T細胞的獨特能力，并將這些抗原消化為短肽呈遞到MHC Ⅰ類細胞中激活CD8+T細胞[21]。成熟的DC有效啟動T細胞反應，與其表面共刺激分子（CD80、CD86）、MCH Ⅱ表達增加和分泌 IL-12、TNF-α等細胞因子增多具有密切關系。目前可以通過觀察成熟DC產(chǎn)生生物活性IL-12的能力作為判斷DC疫苗臨床有效性的一個直接指標，因為它具有在體內(nèi)激活效應T細胞的能力，可促進保護性Th1細胞的分化。有報道稱，慢性乙肝患者DC功能受損，則激活T細胞能力減弱，細胞因子分泌減少[7]，DC表面CD80、CD86、HLA-DR表達與HBV DNA呈負相關，且DC的功能與HBeAg血清學轉(zhuǎn)換密切相關[22]。因此，DC表面共刺激因子表達及分泌細胞因子能力下降，激活T細胞能力降低，可能是導致HBV慢性感染的重要原因之一。

在HBV生命周期中，HBeAg對病毒感染、復制和共價閉環(huán)DNA的形成并不是必需的，但卻被認為是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，能促進病毒的持續(xù)感染[19，23]。多項研究表明，HBeAg通過調(diào)節(jié)宿主免疫應答，在HBV慢性感染的建立和進展中發(fā)揮重要作用[24]。有研究提示HBV可能通過HBeAg引起DC功能缺陷，導致DC針對HBV免疫耐受[25]?，F(xiàn)在不同的研究顯示，HBeAg可抑制T淋巴細胞的增殖[26]，下調(diào)IFN-γ的表達來調(diào)節(jié)免疫應答[27]，使HBV感染后無法被機體清除，更利于HBV的持續(xù)感染。本實驗也得出類似結(jié)果，將健康者MoDC經(jīng)HBeAg作用后，其刺激同種異基因淋巴細胞增殖能力明顯減弱，分泌IL-12、IL-6明顯減少。

TLR是一種模式識別受體，是先天免疫的重要組成部分。John等[28]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠肝細胞表面TLR4基因后，肝臟持續(xù)暴露于來自腸道共生細菌的內(nèi)毒素中，激活CD8+T細胞的能力明顯減弱。Wu等[29]發(fā)現(xiàn)通過激活小鼠mDC表面的TLR4可以抑制HBV的復制。慢性HBV感染者DC表面與TLR4通路激活相關的共刺激因子CD40、CD80以及共刺激OX40L的表達明顯減少；與健康者相比，TLR激動劑刺激慢性HBV患者外周循環(huán)DC后，其體外成熟能力以及分泌IL-12p70和TNF-α的能力受損[30]。某動物實驗發(fā)現(xiàn)，TLR4通過MyD88依賴信號通路激活下游信號通路，包括NF-κB、MAPK和PI-3K/AKT通路，使得促炎細胞因子分泌增加，進而抑制HBV復制[31]。Nakagawa等[32]研究表明，MAPK的激活對DC的成熟及炎癥因子的分泌也有重要作用。通過激活TLR4、MAPK可減少HBV的復制，HBV可通過下調(diào)TLR表達和減弱細胞信號通路來對抗TLR4的作用。有文獻報道含有編碼HBV的重組桿狀病毒的肝細胞系存在HBeAg時，pp38和TNF-α的表達明顯降低[30]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg（-）的慢性乙肝患者與 HBeAg（-）的 HBV 攜帶者相比，自然殺傷細胞中普遍缺乏p38 MAPK激活[33]。通過HepG2.2.15細胞實驗同樣發(fā)現(xiàn)，激活ERK1/2通路可抑制HBV復制[34]。本實驗發(fā)現(xiàn)，HBeAg與MoDC共培養(yǎng)后，其表面 TLR4、pp38、pJNK、pERK1/2 蛋白表達均明顯降低，IL-12、IL-6等細胞因子分泌減少，同時刺激淋巴細胞增殖能力減弱，這提示HBeAg可通過抑制MoDC表面TLR4及下游MAPK信號通路的表達，進而抑制MoDC的免疫功能。

綜上所述，HBeAg能降低MoDC表面TLR4及下游MAPK信號通路傳導，減少IL-12、IL-6分泌，減弱其刺激淋巴細胞增殖能力。該結(jié)果為HBV免疫耐受的機制帶來了新的見解，為設計新的免疫治療策略提供了一定基礎，提示可通過改變HBV相關抗原引起的免疫功能抑制來改變DC的功能，恢復機體對病毒的有效免疫應答，進而改變HBV持續(xù)感染狀態(tài)。