王齊月， 彭明剛， 黎國清， 王澤華， 楊曉新

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022 2武漢大學附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)婦產(chǎn)科，武漢 430060

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，由于早期診斷困難以及化療耐藥，患者的5年生存率僅為35%左右。即使在美國等發(fā)達國家，卵巢癌的5年生存率也僅為47%[1]。順鉑或卡鉑聯(lián)合紫杉醇的化療方案是上皮性卵巢癌化療的首選，其初次化療的緩解率可達80%，但仍有相當一部分患者對化療耐藥；而且，即使是初次化療完全緩解的患者，也可能出現(xiàn)復發(fā)，并伴隨著無鉑間期的縮短，最終發(fā)展為耐藥復發(fā)[2]。因此，亟需研究與卵巢癌化療耐藥及復發(fā)相關的分子標記物，以預測其化療反應性，推動上皮性卵巢癌的個體化治療。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白修飾在卵巢癌耐藥中發(fā)揮重要作用，如組蛋白甲基化和去乙?；ㄟ^調(diào)控染色質(zhì)的開放狀態(tài)以及DNA甲基化修飾，抑制轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結合，從而調(diào)控基因表達，調(diào)節(jié)腫瘤細胞對化療的反應性[3]。組蛋白乙?；接山M蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙?；刚{(diào)控。組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)屬于Ⅰ型組蛋白去乙酰化酶，可催化乙酰基團從組蛋白賴氨酸殘基上脫落[4]。有研究發(fā)現(xiàn)HDAC1高表達與卵巢內(nèi)膜癌和內(nèi)膜樣癌患者的不良預后相關[5]，且在卵巢癌細胞系A2780中抑制HDAC1表達可增加其對順鉑的敏感性[6]。然而上皮性卵巢癌中約70%是高級別漿液性癌，內(nèi)膜樣癌較少，僅占約10%[7]，且A2780細胞也不屬于漿液性癌細胞[8]。因此，有必要進一步研究上皮性卵巢癌組織中HDAC1表達與化療耐藥的相關性，明確其作為化療反應性和生存預測指標的可能性。

1 材料與方法

1.1 卵巢癌組織芯片

卵巢癌組織蠟塊來自武漢協(xié)和醫(yī)院組織標本庫，選取2008年至2013年間在武漢協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)手術切除的上皮性卵巢癌樣本，術前未行任何化療或放療，術后接受紫杉醇/卡鉑3周方案化療，臨床資料完整?；熌退幗M患者定義為初次化療出現(xiàn)以下情況：①化療過程中因疾病進展而中斷化療；②完成6個療程化療，但未達完全緩解；③完成化療并達完全緩解，化療完成后6個月之內(nèi)復發(fā)?；熋舾薪M患者定義為：初次化療后完全緩解，且化療完成后6個月之內(nèi)血生化、影像學、臨床檢查均未提示復發(fā)者。共42例符合要求的卵巢癌組織納入組織芯片，其中敏感組27例，耐藥組15例。包埋好的組織芯片蠟塊行4 μm連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色確認組織為卵巢癌后行HDAC1免疫組化染色。組織樣本及患者資料的使用通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2 HDAC1免疫組化染色

組織芯片石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，依次在100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、蒸餾水中浸泡5 min，然后用PBS溶液沖洗。切片加EDTA緩沖液進行微波抗原修復。在3%過氧化氫溶液中室溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶?？乖忾]用5% BSA，室溫孵育20 min。完成封閉后的切片加抗HDAC1多克隆兔抗(Proteintech Group，美國，貨號10197-1-AP，稀釋度1∶100)，4 ℃過夜；加150μL二抗孵育后用DAB顯色，蘇木精復染。每個組織隨機選取3個視野在高倍鏡下觀察，對陽性細胞比例和染色深淺進行評分。陽性細胞比例評分：0～5%，0分；6%～33%，1分；34%～67%，2分；68%～100%，3分。染色深淺評分：無陽性染色，0分；淡黃色，1分；黃色或淺棕色，2分；深棕色，3分。每個組織的HDAC1免疫組化評分為以上兩項評分的乘積。兩位研究者獨立評分，意見分歧時，討論達成一致。

1.3 統(tǒng)計分析

用SPSS 13.0軟件進行分析。敏感組和耐藥組患者年齡以及HDAC1免疫組織化學評分的比較采用秩和檢驗，其它臨床病理特征的比較采用卡方檢驗。用Kaplan-Meier法繪制HDAC1高表達和低表達組的無進展生存曲線和總生存曲線，并用Log-rank法檢測組間差異。所有檢驗為雙側，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 公共數(shù)據(jù)分析

在GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)中搜索卵巢癌高通量mRNA測序數(shù)據(jù)集，比較HDAC1在化療敏感腫瘤和化療耐藥腫瘤中的表達及其在漿液性卵巢癌和正常對照組織中的表達。Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站(http：//kmplot.com/analysis)分析HDAC1表達與卵巢癌患者無進展生存期和總生存期的相關性[9]。在cBioPortal在線數(shù)據(jù)庫(http：//www.cbioportal.org/)中分析卵巢癌中HDAC1的基因組突變情況及其與基因表達水平的相關性。

2 結果

2.1 HDAC1在上皮性卵巢癌中的表達

為了檢測HDAC1的表達與卵巢癌化療耐藥的相關性，我們在42例卵巢癌患者的組織芯片中用免疫組織化學法檢測了HDAC1的表達水平?？梢婈栃匀旧饕挥诩毎耍螲DAC1的亞細胞定位。27例化療敏感患者和15例耐藥患者的年齡、FIGO分期、分化程度以及病理類型的差異無統(tǒng)計學意義(表1)，而耐藥組卵巢癌組織中HDAC1的蛋白表達水平顯著高于化療敏感組(P<0.01，圖1)。

表1 卵巢癌患者的臨床病理特征Table 1 The clinicopathological characteristics of ovarian cancer patients

A：染色全景；B：化療耐藥組和敏感組卵巢癌的染色代表性圖片(×40)；C：化療耐藥組和敏感組卵巢癌的染色評分箱圖圖1 卵巢癌組織芯片HDAC1免疫組織化學染色Fig.1 Immunohistochemistry staining for HDAC1 in ovarian cancer tissue arrays

2.2 HDAC1表達與上皮性卵巢癌預后的關系

為進一步明確HDAC1與患者生存的相關性，我們將42名患者按照HDAC1表達水平的高低分組：免疫組織化學染色評分>3為高表達組，≤3為低表達組。生存分析顯示，HDAC1高表達組患者的無進展生存期和總生存期均顯著劣于低表達組患者(P無進展生存<0.01，P總生存=0.021，圖2)，提示HDAC1高表達預示患者的不良預后。

A：無進展生存期；B：總生存期；刪失表示無事件(復發(fā)或死亡)發(fā)生圖2 不同HDAC1表達水平卵巢癌患者的生存分析Fig.2 Analysis of the survival in ovarian cancer patients with different expression levels of HDAC1

2.3 公共數(shù)據(jù)分析HDAC1表達與卵巢癌的關系

為了在其它樣本中驗證上述結果，我們分析了GEO數(shù)據(jù)庫中卵巢癌相關數(shù)據(jù)。在GSE12470數(shù)據(jù)集中，HDAC1在漿液性卵巢癌(n=43)中的表達較正常腹膜組織(n=10)顯著升高(P<0.01，圖3A)。GSE54388數(shù)據(jù)集分析也顯示了類似的結果，即與正常卵巢上皮相比，HDAC1在漿液性卵巢癌中高表達(P<0.05，圖3B)。GSE41499數(shù)據(jù)集分析顯示，在原代卵巢癌細胞中，鉑耐藥細胞中HDAC1的表達顯著高于鉑敏感細胞(P<0.05，圖3C)。Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析顯示HDAC1表達與卵巢癌患者(n=1435)無進展生存期以及總生存期均呈顯著負相關，高HDAC1表達組患者的復發(fā)和死亡風險分別升高27%(HR：1.27，95%CI：1.12～1.44，圖3D)和25%(HR：1.25，95%CI：1.10～1.42，圖3E)。

A：在GSE12470數(shù)據(jù)集中比較10個正常腹膜和43個漿液性卵巢癌組織之間HDAC1的表達差異；B：在GSE54388數(shù)據(jù)集中比較6個卵巢正常表面上皮和16個漿液性卵巢癌組織之間HDAC1的表達差異；C：在GSE41499數(shù)據(jù)集中比較4對鉑敏感和鉑耐藥的原代卵巢癌細胞之間HDAC1的表達差異；D：Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析HDAC1表達與卵巢癌患者無進展生存期的相關性；E：Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析HDAC1表達與卵巢癌患者總生存期的相關性；*P<0.05，**P<0.01圖3 公共數(shù)據(jù)集分析HDAC1在卵巢癌中的表達Fig.3 Analysis of HDAC expression in ovarian cancer using public data sets

為了初步探索HDAC1在卵巢癌中高表達的可能機制，我們在cBioPortal在線數(shù)據(jù)庫(http：//www.cbioportal.org/)中分析了卵巢癌患者HDAC1的基因組變異情況。結果顯示，約4%卵巢癌發(fā)生HDAC1基因組變異，以擴增為主，此外還有少量結構變異、剪接突變、錯義突變、深度缺失等(圖4A)，且基因擴增與HDAC1在腫瘤中的異常高表達相關(圖4B)。

A：基因變異的種類及頻率；B：基因變異類型與基因表達水平的相關性圖4 cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析卵巢癌中HDAC1基因變異Fig.4 Analysis of HDAC1 gene variants in ovarian cancer based on cBioPortal database

3 討論

盡管近年來很多新藥被批準用于上皮性卵巢癌的治療，但總體來說患者的生存狀況并未得到顯著改善。分子分型為內(nèi)膜癌個體化治療提供了強有力的基礎[10]，而卵巢癌目前尚無可用于臨床的分子標記物。鑒于卡鉑聯(lián)合紫杉醇仍是目前一線化療方案，本研究針對性地比較了對卡鉑/紫杉醇方案化療耐藥和敏感的上皮性卵巢癌組織中HDAC1的表達，發(fā)現(xiàn)經(jīng)免疫組化檢測所得HDAC1表達水平與化療耐藥和復發(fā)呈顯著正相關，其有望被用作上皮性卵巢癌化療反應性和生存的預測指標。

在本研究所納入的卵巢癌組織中，漿液性癌占79%，符合上皮性卵巢癌病理類型分布特點[11]，同時也提示我們的結論主要適用于漿液性癌。雖然有研究報道HDAC1在卵巢內(nèi)膜樣癌中的表達可用于預測患者的不良預后[5]，但我們的樣本中僅有2例內(nèi)膜樣癌，因此無法驗證HDAC1與卵巢內(nèi)膜樣癌患者生存的相關性。此外，本研究中公共數(shù)據(jù)集的分析也顯示HDAC1在漿液性癌中表達顯著增高，且在耐藥卵巢癌細胞中表達高于敏感細胞，并與患者的不良預后相關。盡管公共數(shù)據(jù)集為mRNA表達水平數(shù)據(jù)，但我們的免疫組織化學檢測結果仍然與這些數(shù)據(jù)所呈現(xiàn)的結果表現(xiàn)出良好的一致性。且基于免疫組化的評估更有利于臨床轉(zhuǎn)化。除了相關性研究，還有一些研究闡述了HDAC1參與耐藥的機制，包括維持腫瘤干細胞功能[12]、抑制耐藥相關基因Bcl-2的表達[13]等。以上結果說明HDAC1高表達與卵巢癌耐藥相關，且有作為預測卡鉑/紫杉醇化療耐藥的分子標記進行臨床轉(zhuǎn)化的潛能。

通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析我們發(fā)現(xiàn)約4%的卵巢癌中存在HDAC1基因變異，且變異類型以基因擴增為主。雖然基因擴增會導致HDAC1表達增加，但4%的頻率不足以解釋HDAC1在卵巢癌中的高表達。有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-34a可以靶向結合HDAC1 mRNA，從而抑制其表達及卵巢癌細胞增殖[14]。在肝細胞肝癌中，DNA結合轉(zhuǎn)錄因子YY1可增強HDAC1的表達[15]?？梢?，HDAC1在卵巢癌的高表達可能是由基因水平、轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機制共同作用的結果。

除了預測預后，HDAC1用于上皮性卵巢癌患者分層管理的潛在價值可能還在于指導個體化用藥——對低HDAC1腫瘤優(yōu)先選擇卡鉑/紫杉醇化療，而對高HDAC1腫瘤可考慮更加積極的治療。此外，HDAC1抑制或許可用于高HDAC1腫瘤的聯(lián)合治療。已有幾款HDAC抑制劑被批準用于臨床治療T細胞淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤[16]，但其在卵巢癌中的療效尚不明確。在細胞和動物實驗中，HDAC抑制劑不僅展示出對順鉑的增敏作用，還可使無同源重組修復缺陷的卵巢癌對PARP抑制劑敏感[17]；在黑色素瘤中，抑制Ⅰ型HDAC可促進卵巢癌中CD8陽性T細胞的活化[18]，并增加黑色素瘤對免疫治療的反應性[19]。這些證據(jù)提示HDAC1檢測在指導上皮性卵巢癌個體化治療中可能具有較好的應用前景。

綜上所述，本研究表明高水平的HDAC1免疫組織化學染色信號與上皮性卵巢癌(尤其是漿液性癌)卡鉑/紫杉醇化療耐藥和復發(fā)顯著相關，為開展HDAC1作為腫瘤分型標記的臨床轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)，但其對于化療敏感性和患者生存的預測作用以及指導個體化治療的作用還有待在大樣本的前瞻性研究中進一步驗證。