段 旭，馮雷雨，周 琪，陳銀廣

（同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海200092）

污泥處理是我國水污染防治行業(yè)的重點(diǎn)，同時也是污水處理的短板［1］。厭氧發(fā)酵兼具廢物減量和資源回收的雙重優(yōu)勢，成為我國優(yōu)先推薦的污泥處理技術(shù)。其中，厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸因可獲得用于脫氮除磷、產(chǎn)油、產(chǎn)電、產(chǎn)可降解塑料的短鏈脂肪酸（SCFAs）而逐漸成為備受關(guān)注的發(fā)酵方式［2-5］。

部分工業(yè)廢水?dāng)y帶持久性有機(jī)污染物進(jìn)入城市污水處理廠［6］，這些有機(jī)污染物如壬基酚（NP）、多環(huán)芳烴（PAHs）等在污水處理過程中被吸附并積累于污泥上［7-8］。NP為一種可模仿人體內(nèi)雌激素作用并具內(nèi)分泌干擾性質(zhì)的有機(jī)污染物，毒性較高且難以降解，早在2000年便被指定為優(yōu)先控制污染物［9］。NP在剩余污泥中的含量可高達(dá)上千mg·kg-1干污泥［10-12］。剩余污泥中大量持久性有機(jī)污染物為污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程增加了不確定性。

污泥厭氧發(fā)酵是各司其職的微生物利用復(fù)雜底物通過一系列反應(yīng)最終生成所需產(chǎn)物的微生物發(fā)酵過程［13］。采用基因組學(xué)等分子生物學(xué)手段研究NP對污泥厭氧發(fā)酵的影響可在微生物種群結(jié)構(gòu)和功能方面深度理解污泥厭氧發(fā)酵影響機(jī)理。研究了NP對污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，在此基礎(chǔ)上，利用宏基因組學(xué)技術(shù)，從有機(jī)物轉(zhuǎn)化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面揭示NP對污泥厭氧產(chǎn)酸的影響機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用剩余污泥取自上海市某污水處理廠的回流污泥泵房。實(shí)驗(yàn)過程中，先將取回的新鮮剩余污泥于4℃下沉降24 h，棄去上清液，再經(jīng)2.0 mm×2.0 mm篩過濾去除其中的大顆粒雜質(zhì)。沉降過篩后污泥的主要性質(zhì)如表1所示。

表1 剩余污泥性質(zhì)Tab.1 Characteristics of waste activated sludge

實(shí)驗(yàn)所用NP（正壬基酚，純度為98%）購置于阿達(dá)瑪斯試劑公司（上海），將NP溶解于甲醇（色譜級）中配制成1 000 mg·L-1的儲備液，在棕色試劑瓶中4℃避光保存并待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置與運(yùn)行

NP影響污泥厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的原料為NP儲備污泥，具體制備過程如下：在相同規(guī)格的6個5 L玻璃瓶中加入相同體積的濃縮沉淀后剩余污泥，向各瓶中加入不同體積的NP儲備液，并用甲醇補(bǔ)足NP儲備液加入后的體積差，使得各瓶中NP含量分別為0、50、100、200、500、1 000 mg·kg-1干污泥。將污泥與NP混合體系置于機(jī)械攪拌器上以150 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌24 h，使NP均勻吸附于污泥之上，然后在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸反應(yīng)器為規(guī)格相同的600 mL血清瓶，瓶中分別加入NP含量為0、50、100、200、500、1 000 mg·kg-1干污泥的儲備污泥240 mL，控制厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸系統(tǒng)中的pH值為10.0。氮?dú)獯祾? min以排出瓶中氧氣保證厭氧條件，用橡膠塞密封后，將血清瓶置于恒溫空氣搖床中，于150 rpm、（35±1）℃條件下振蕩反應(yīng)。反應(yīng)過程中，每日從厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器中排出30 mL發(fā)酵液，并補(bǔ)充相同體積的新鮮儲備污泥，控制產(chǎn)酸反應(yīng)器中的污泥停留時間為8 d。反應(yīng)器長期運(yùn)行，每隔2 d取樣測定反應(yīng)器中的SCFAs產(chǎn)量，待SCFAs產(chǎn)量基本穩(wěn)定后（20 d）取污泥樣品進(jìn)行宏基因組測序分析，每一實(shí)驗(yàn)條件下設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 測試指標(biāo)與方法

TSS、VSS、COD的檢測依據(jù)《水和廢水分析檢測方法》［14-15］；蛋白質(zhì)含量采用Folin-酚試劑法進(jìn)行測定；多糖采用蒽酮比色法測定；采用索式提取法提取脂類，儀器為FOSS全自動索氏抽儀（Soxtec 2050）；采用島津GC-2014型氣相色譜儀測定SCFAs，毛細(xì)管色譜柱型號為DB-WAXETR（30 m×530μm×1.0μm），氮?dú)怏w積流量為30 mL·min-1，空氣體積流量為400 mL·min-1。

1.4 宏基因組測序

利用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Biotek，美國）試劑盒、TBS-380、NanoDrop200、1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行樣品DNA抽提以及濃度、純度、完整性檢測。將DNA片段化，篩選約400 bp的片段用于構(gòu)建宏基因組文庫。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq（Bioo Scientific，美國）建庫，構(gòu)建完成后進(jìn)行橋式聚合酶鏈反應(yīng)和測序，宏基因組測序使用Illumina NovaSeq/Hiseq Xten（Illumina，美國）測序平臺，使用軟件SeqPrep（https：//github.com/jstjohn/SeqPrep）對reads 3’端和5’端的adapter序列進(jìn)行質(zhì)量 剪 切；使 用 軟 件Sickle（https：//github.com/najoshi/sickle）去除剪切后長度小于50 bp、平均堿基質(zhì)量值低于20以及含N堿基的reads，保留高質(zhì)量的pair-end reads和single-end reads；使用基于succinct de Bruijn graphs原理的拼接軟件MEGAHIT（https：//github.com/voutcn/megahit）對優(yōu)化序列進(jìn)行拼接組裝。在拼接結(jié)果中篩選≥300 bp的contigs作為最終的組裝結(jié)果。使用MetaGene（http：//metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/）對拼接結(jié)果中的contigs進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測。選擇核酸長度≥100 bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列。使用SOAPaligner軟件（http：//soap.genomics.org.cn/）分別將每個樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進(jìn)行比對（95%identity），統(tǒng)計基因在對應(yīng)樣品中的豐度信息，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行物種與功能注釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 NP對污泥厭氧發(fā)酵反應(yīng)器產(chǎn)酸性能的影響

污泥厭氧產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器運(yùn)行約20 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定后反應(yīng)器中SCFAs產(chǎn)量隨NP含量變化如圖1a所示。在NP含量范圍內(nèi)（0～1 000 mg·kg-1干污泥），實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)酸量較之于空白組整體表現(xiàn)為促進(jìn)作用，但促進(jìn)程度不同。隨NP含量的升高，SCFAs產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0、50、100、200、500、1 000 mg·kg-1干污泥NP反應(yīng)器中的SCFAs積累量分別為2 856、3 687、4 575、5 620、4 867、4 013 mg COD·L-1。當(dāng)NP含量為200 mg·kg-1干污泥時，SCFAs積累量達(dá)到最大值，約為空白組SCFAs積累量的2倍。作為雌激素類物質(zhì)，NP對生物細(xì)胞、組織和器官的影響多有報道，通常呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。如低劑量NP可促進(jìn)小鼠子宮和土壤白符跳的生長，NP劑量進(jìn)一步提高后其毒性增強(qiáng)［16-17］。與NP影響生物的規(guī)律類似，其對產(chǎn)酸過程的影響同樣與含量相關(guān)，低含量NP對發(fā)酵產(chǎn)酸具有較高的促進(jìn)作用，隨NP含量的提高促進(jìn)作用降低。

進(jìn)一步分析發(fā)酵系統(tǒng)中SCFAs的組成（見圖1b，圖中數(shù)值為反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定后長期所測得的各SCFA的平均濃度）發(fā)現(xiàn)，乙酸、丙酸和異戊酸為3種主要SCFA，尤其是乙酸，占到總SCFAs濃度的50%。隨NP含量的改變，乙酸在不同NP反應(yīng)器中的濃度較之于空白組發(fā)生了不同程度的變化，而丙酸、丁酸和戊酸濃度并無顯著差異。空白反應(yīng)器中，乙酸濃度為1 310 mg COD·L-1，NP含量為200 mg·kg-1干污泥時，乙酸濃度提高為3 790 mg COD·L-1，約為空白反應(yīng)器的3倍。經(jīng)計算，乙酸濃度較之于空白反應(yīng)器的提高量為2 480 mg COD·L-1，SCFAs濃度較之于空白反應(yīng)器的提高量為2 764 mg COD·L-1。因此，NP反應(yīng)器中SCFAs濃度的提高主要來自于乙酸濃度的提高。

圖1 SCFAs濃度及組成隨NP含量的變化Fig.1 Change of SCFAs concentration and composition with different NP contents

綜上，NP促進(jìn)污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，促進(jìn)作用隨NP濃度的提高先增后減；NP含量為200 mg·kg-1干污泥時，SCFAs濃度達(dá)最大值，為空白反應(yīng)器的2倍之多；NP反應(yīng)器中SCFAs濃度的提高主要?dú)w因于乙酸濃度的提高。為深入探討NP影響污泥厭氧產(chǎn)酸發(fā)酵的機(jī)理，下文將選取空白反應(yīng)器和NP含量為200 mg·kg-1干污泥的反應(yīng)器（下文統(tǒng)稱NP反應(yīng)器）進(jìn)行宏基因組測序分析。

2.2 NP對污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸微生物種群結(jié)構(gòu)的影響

污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸由多種功能微生物協(xié)同完成，因此研究該系統(tǒng)中微生物種群結(jié)構(gòu)的變化對于揭示NP影響污泥發(fā)酵產(chǎn)酸的機(jī)理極為必要。由圖2a可知，在域分類學(xué)水平上，空白和NP反應(yīng)器中細(xì)菌相對豐度分別為95.15%、98.81%，古菌相對豐度分別為4.35%、0.66%。值得一提的是，水解酸化菌屬于細(xì)菌，而消耗乙酸的產(chǎn)甲烷菌屬于古菌。因此，NP反應(yīng)器中產(chǎn)酸量的提高可能與該反應(yīng)器中細(xì)菌豐度的提高和古菌豐度的降低有關(guān)。

在門分類水平上，由圖2b可知，空白和NP反應(yīng)器中檢測到的主要微生物為Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）和Actinobacteria（放線菌門）。隸屬Firmicutes的微生物具有降解復(fù)雜有機(jī)物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的能力，在空白和NP反應(yīng)器中的相對豐度分別為58.52%和50.79%。對Firmicutes組成進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該門在NP存在下豐度降低的屬為產(chǎn)乙醇食蛋白菌（Proteiniborus ethanoligenes），其為消耗底物大量產(chǎn)生醇類物質(zhì)的微生物屬［18］。Bacteroidetes通常具有水解發(fā)酵大分子有機(jī)物，使之生成乙酸及H2、CO2氣體的功能［19-20］，其在NP反應(yīng)器中的相對豐度為25.18%，顯著高于空白反應(yīng)器（14.28%）。Proteobacteria能以葡萄糖、丙酸、丁酸和乙酸為底物，為耗乙酸菌［21］，其在空白和NP反應(yīng)器中的相對豐度無顯著差異（10.74%和10.33%）。Chloroflexi在空白反應(yīng)器中的相對豐度為6.58%，高于其在NP反應(yīng)器中的數(shù)量（5.53%），該菌與產(chǎn)甲烷菌互營生長，主要在發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中發(fā)揮作用［22］。Actinobacteria可代謝產(chǎn)生抗生素，大量存在會抑制其他產(chǎn)酸菌的生長和代謝，其在空白和NP反應(yīng)器中的相對豐度分別為2.70%和2.32%［23］。以上分析表明，NP直接或間接地使消耗乙酸的細(xì)菌數(shù)量有所削減，產(chǎn)乙酸菌數(shù)量增加，即NP存在使微生物種群結(jié)構(gòu)向有利于污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的方向進(jìn)行。

圖2 域和門水平微生物種群結(jié)構(gòu)Fig.2 Microbial community structure at domain and phylum level

2.3 NP對厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸微生物功能的影響

NP對微生物種群結(jié)構(gòu)有顯著影響，而這些微生物在污泥厭氧發(fā)酵過程中執(zhí)掌不同功能，分工合作最終產(chǎn)生了SCFAs，了解NP作用下發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的功能可進(jìn)一步揭示NP影響污泥發(fā)酵產(chǎn)酸的機(jī)理。以宏基因組測序技術(shù)為手段，基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋和分析，與空白反應(yīng)器相比，NP反應(yīng)器中顯著提高的微生物功能主要包括3類（見圖3）：①有機(jī)物降解及乙酸生成，與單糖、氨基酸降解及乙酸生成相關(guān)的代謝，如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解以及脂肪酸降解；②物質(zhì)運(yùn)輸，與腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水解和有機(jī)物主動運(yùn)輸相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；③信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與細(xì)菌間信息交流相關(guān)的群體感應(yīng)和與細(xì)菌感知、響應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境以及細(xì)胞狀態(tài)變化相關(guān)的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。

圖3 Level 3水平代謝通路相對豐度Fig.3 Relative abundance of pathway on Level 3 level

（1）有機(jī)底物降解及乙酸的生成

厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸由葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。涉及的主要代謝途徑為以葡萄糖為底物的糖酵解、以氨基酸為底物的脫氨基作用（氨基酸代謝）和以脂肪酸為底物的β氧化。糖酵解是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸并產(chǎn)生少量ATP（能量）和還原型輔酶I（還原力）的過程，是產(chǎn)生重要前體代謝產(chǎn)物丙酮酸的主要途徑［24］。生成的丙酮酸經(jīng)丙酮酸代謝過程轉(zhuǎn)化為乙酸。除葡萄糖外，氨基酸也可經(jīng)轉(zhuǎn)氨基或脫氨基等生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為丙酮酸。例如，丙氨酸在氨基轉(zhuǎn)移酶（基因：GPT、alaA、AGXT2和AGXT）的作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，天冬氨酸在天冬氨酸脫羧酶（基因：asdA）催化下可先轉(zhuǎn)化為丙氨酸后經(jīng)由丙氨酸形成丙酮酸。脂肪水解為脂肪酸后，脂肪酸經(jīng)β氧化逐級變?yōu)楸壬弦患壣?個碳原子的脂肪酸，最終形成SCFAs。由圖4可知，NP存在下有機(jī)底物降解過程涉及的主要相關(guān)功能基因，包括pgm、pgi、pfk、fba、gap、pyk等（虛線箭頭標(biāo)記途徑上的所有基因），其相對豐度較之于空白反應(yīng)器大幅提高。

圖4 有機(jī)物降解及乙酸生成途徑相關(guān)功能基因及其相對豐度Fig.4 Functional genes related with organic substrates degradation and acetic acid production and their relative abundances

（2）物質(zhì)運(yùn)輸

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將ATP水解與離子、糖、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)、固醇等底物主動運(yùn)輸結(jié)合［25］。其中，向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將底物和營養(yǎng)物質(zhì)從外界環(huán)境轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，而向外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則可將不利于細(xì)胞生長的脂肪酸、抗生素等物質(zhì)排出至細(xì)胞外，將細(xì)胞內(nèi)非必需的外源物質(zhì)和次級代謝產(chǎn)物保持在較低的濃度［26］。NP存在下，與氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸）和單糖（木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和核糖等）運(yùn)輸相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能基因相對豐度較之于空白組均有不同程度的提高（＞10%）。此外，游離脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的大量積累將對細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞生長產(chǎn)生不利影響，NP反應(yīng)器中，與短鏈脂肪酸外排相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能基因acrB在NP存在下的相對豐度為空白組的1.1倍，即NP促進(jìn)了游離脂肪酸的外排功能。各功能基因在空白和NP反應(yīng)器中的相對豐度如圖5所示。

圖5 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能基因及其相對豐度Fig.5 Functional genes related with ABC transporter and their relative abundances

（3）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)菌感知、響應(yīng)并適應(yīng)外界環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)變化的調(diào)控系統(tǒng)。每個雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)均由傳感器蛋白-組氨酸激酶（HK）和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（RR）組成。HK接收并響應(yīng)環(huán)境中的信號，將其自身的保守His殘基磷酸化［27］。隨后，HK攜帶磷酸基團(tuán)并將其轉(zhuǎn)移到下游的RR上，使RR轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)?；罨腞R通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞生理變化。該功能中，與SCFAs代謝和細(xì)菌生物膜、細(xì)胞膜形成途徑（遷移和生物膜形成，蹭行運(yùn)動，鞭毛馬達(dá)轉(zhuǎn)動和細(xì)胞外被膜蛋白折疊和降解）相關(guān)的功能基因相對豐度在NP存在下均有較大程度的提高（見圖6）。

圖6 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)功能基因及其相對豐度（p：磷酸；e：作用域）Fig.6 Functional genes related with two-component system and their relative abundances(p:phosphate;e:effector domain)

群體感應(yīng)（QS）是細(xì)菌共享有關(guān)細(xì)胞密度的信息并相應(yīng)地調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)，QS調(diào)控的過程包括毒力因子產(chǎn)生、生物發(fā)光、抗生素合成、細(xì)胞運(yùn)動、孢子和生物膜形成等［28］。環(huán)境脅迫因子誘發(fā)細(xì)菌分泌信號分子，當(dāng)信號分子積累到一定閾值時，將啟動菌體中特定基因的表達(dá)。NP存在下，生物膜的形成對于保護(hù)細(xì)胞免受NP侵害，增加其對環(huán)境壓力的抗性和耐受性極為重要［29］。生物膜的形成與細(xì)菌的鞭毛運(yùn)動、胞外聚合物（EPS）分泌、胞間黏附和增殖過程密切相關(guān)，涉及這些過程的功能基因相對豐度如圖7所示?？梢钥吹?，調(diào)控生物膜形成的特定功能中的合成蛋白、感應(yīng)蛋白和應(yīng)答蛋白基因相對豐度在NP反應(yīng)器中較之于空白組提高。因此，NP的存在將促進(jìn)細(xì)胞生物膜形成進(jìn)而有利于微生物的生存。

圖7 群體感應(yīng)功能基因及其相對豐度Fig.7 Functional genes related with quorum sensing and their relative abundances

有機(jī)底物運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、有機(jī)底物進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為SCFAs代謝過程的功能基因以及產(chǎn)物SCFAs外排的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能基因的相對豐度在NP刺激下提高。除產(chǎn)SCFAs的代謝功能外，NP促進(jìn)了與細(xì)胞生長和保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的生物膜和細(xì)胞膜合成相關(guān)的功能基因。

3 結(jié)語

研究了NP對剩余污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NP促進(jìn)了污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程，并且隨NP含量的提高，該促進(jìn)作用呈現(xiàn)出先增加后減少趨勢。當(dāng)NP含量為200 mg·kg-1干污泥時，NP反應(yīng)器中的SCFAs濃度達(dá)到峰值，為空白反應(yīng)器SCFAs產(chǎn)量的2倍，乙酸濃度為空白組的3倍?；诤昊蚪M測序發(fā)現(xiàn)，NP導(dǎo)致不利于SCFAs積累的古菌及耗酸微生物有所削減，產(chǎn)酸微生物大量積累。微生物代謝過程中，NP改變了與產(chǎn)酸相關(guān)的功能代謝。有機(jī)物的糖酵解等過程功能基因豐度顯著提升；葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等有機(jī)底物由胞外向胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)腁BC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、運(yùn)輸至胞內(nèi)的有機(jī)底物向SCFAs代謝轉(zhuǎn)化的雙組分系統(tǒng)以及胞內(nèi)產(chǎn)生的SCFAs外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相關(guān)基因豐度大幅提高。此外，NP引起了與細(xì)胞生長和保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)的群體感應(yīng)調(diào)控的生物膜合成相關(guān)基因豐度顯著增加。