江阿力·帕孜力別克，米熱阿依克孜·馬木提，趙莉，魯皓

1.新疆醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830001）；2.石河子大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)系，新疆維吾爾自治區(qū) 石河子（832000）；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830000）

牙周-牙髓聯(lián)合病變（combined periodontal-endodontic lesions）是發(fā)生在牙周病或根尖周病晚期，導(dǎo)致廣泛牙周組織破壞及牙髓病變的綜合征，是牙齒缺失的重要原因之一［1］。1999年國際牙科會議分類為：牙髓源性牙周牙髓聯(lián)合病變、牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變和并存型牙周牙髓聯(lián)合病變［2］。這一分類為病因型分類，缺乏直觀指標(biāo)，臨床上原發(fā)病變較長時間得不到治療時，分型鑒別診斷有一定難度。從臨床治療效果看，牙髓源性的牙周牙髓聯(lián)合病變，僅通過根管治療即可表現(xiàn)為組織愈合，與牙周源性的病變預(yù)后大不相同。牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患者往往會因診斷不及時或治療不規(guī)范而病情惡化，最終導(dǎo)致患牙拔除。

牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變是臨床上較常見的一個分型，由于深牙周袋內(nèi)的細(xì)菌、毒素通過根尖孔或近根尖處的側(cè)支根管進(jìn)入牙髓，導(dǎo)致牙髓組織發(fā)生病變［3］。目前很多研究已證明牙周牙髓聯(lián)合病變中，牙周和牙髓感染病損中細(xì)菌菌群具有相似性。然而對牙周和牙髓組織感染部位細(xì)菌數(shù)量及其相關(guān)性方面的研究極少，本實驗應(yīng)用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRTPCR）技術(shù)，對牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變和重度牙周炎患者分別進(jìn)行了常見病原菌的檢測，并分析牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變致病菌分布狀況及其相關(guān)性，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2020年6月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診的牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變者43例，共43顆牙作為實驗組，其中男26例，女17例；年齡17～75歲，平均（37.65±11.48）歲。另選重度牙周炎者41例，共41顆牙作為對照組，其中男20例，女21例；年齡15～72歲，平均（36.32±10.76）歲。記錄所有研究對象的基本資料、口腔衛(wèi)生狀況、牙齦狀況、牙周探診及牙松動度，拍攝曲面斷層片。兩組患者的性別、年齡、口腔衛(wèi)生情況等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本實驗通過新疆自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：KY20180118157），所有患者已簽署的知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

實驗組納入標(biāo)準(zhǔn)參考《牙周病學(xué)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］：①有長期的牙周炎病史，近期出現(xiàn)牙髓炎癥狀，牙冠、牙根完整，無引發(fā)牙髓炎的深齲、牙隱裂等牙體硬組織疾?。虎谏钸_(dá)根尖區(qū)的牙周袋或嚴(yán)重的牙齦退縮；③松動度達(dá)Ⅱ度以上；④溫度檢測可激發(fā)劇痛或無反應(yīng)等異常反應(yīng)；⑤X線片示病變位點牙槽骨吸收≥根長2/3；⑥臨床診斷為逆行性牙髓炎者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患牙有外傷史；②有糖尿病、心血管疾病、高血壓等全身系統(tǒng)性疾??；③治療前6個月進(jìn)行過牙周治療；④長期服藥史或近1個月內(nèi)服用過抗生素；⑤口腔?？茩z查和影像學(xué)表現(xiàn)確診為牙根縱裂的患者；⑥正畸治療史；⑦牙髓治療史。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)［5］：①探診深度＞6 mm；②附著喪失≥5 mm；③牙槽骨吸收超過根長的1/2；④牙齒松動；⑤炎癥較明顯，可伴有牙周膿腫；⑥后牙有Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病變。診斷為重度牙周炎的患者需要2顆及以上患牙具有上述前3項特征；如僅有2顆患牙，這2顆患牙須不是相鄰患牙，且至少位于不同的象限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①高血壓、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等全身系統(tǒng)性疾病者；②孕婦和哺乳期患者；③半年內(nèi)有牙周治療史或3個月之內(nèi)有服用抗生素、激素類藥物的患者；④吸煙者。

1.3 齦下菌斑與根管內(nèi)組織的采集與處理

實驗組與對照組采樣前清除局部齦上菌斑，無菌棉卷隔濕，探診患牙牙周袋至最深部位，將無菌刮治器置于牙周袋底部，刮取牙周袋內(nèi)齦下菌斑放入滅菌的EP管中，-80℃保存。實驗組根管內(nèi)組織的采集：局部麻醉后橡皮障隔離取樣牙，開髓，用無菌低速手機在無水狀態(tài)下揭去髓室頂，用15號K銼探查牙周袋較深側(cè)根管，疏通根管，根管長度測量儀測定基本工作長度。將無菌紙尖放入根管內(nèi)，止點為距離根尖孔0.5～2 mm處，重復(fù)3次放入同一EP管中。所有樣本均置于冰面上，并及時轉(zhuǎn)送至-80℃低溫冰箱保存。本實驗病例標(biāo)本均由同一名經(jīng)過臨床培訓(xùn)的牙體牙髓?？漆t(yī)師采集。

1.4 DNA的提取

樣本處理：將存于-80℃的樣本冰上解凍30 min，加1 mL PBS緩沖液，震蕩5 min，12 000 rpm離心3 min，留沉淀。應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（南京諾唯贊，中國）對根管內(nèi)組織和齦下菌斑標(biāo)本DNA進(jìn)行提取。提取方法嚴(yán)格參照試劑盒操作手冊。分光光度計檢測DNA濃度范圍0.02～20 ng/μL，提取的DNA樣品-20℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR技術(shù)檢出微生物

1.5.1 引物設(shè)計 對病原微生物消化性鏈球菌（Digestive streptococcus，Ds）ATCC27337、糞腸球菌（Enterococcus faecalis，Ef）ATCC29200、牙髓卟啉單胞 菌（Porphyromanus endodontics，Pe）ATCC35406、中間普氏菌（Prevotella intermedia，Pi）ATCC25611、牙 齦 卟 啉 單 胞 菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）ATCC33277、福賽斯坦納菌（Tannerella forsythia，Tf）ATCC43037、齒垢密螺旋體（Treponema denticola，Td）ATCC35405及具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）ATTC25586的特異性引物序列使用PrimerQuest進(jìn)行設(shè)計，引物擴增序列參考人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫（expanded Human Oral Microbiome Database，eHOMD）。細(xì)菌16SrRNA的引物序列信息由生物公司合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of the quantitative real-time PCR

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備 以Ds、Ef、Pe、Pi、Pg、Tf、Td和Fn的基因組DNA做模板，分別用各自的特異性引物擴增得到目的序列后，構(gòu)建含有8種細(xì)菌靶基因的重組質(zhì)粒，然后使用質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）（TIANGEN，中國）提取質(zhì)粒DNA并送上海生工測序，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性分析。擴增產(chǎn)物與GenBank中的目的細(xì)菌有100%同源性，且無其他非特異性產(chǎn)物擴增，說明該樣本含有目的細(xì)菌。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)菌基因組DNA濃度調(diào)整到1 ng/μL。以10的倍比（10-1～10-6）連續(xù)稀釋各細(xì)菌的基因組DNA，設(shè)置6個梯度，以此為模版，進(jìn)行QRT-PCR反應(yīng)。其反應(yīng)體系均為20μL：2×master mix（10.0μL），Primer（10 pm）mix（1.2μL），Template（1.0μL），ddH2O（7.8μL）。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸20 s，循環(huán)55次；72℃復(fù)性10 min；最后降溫至4℃。擴增的物質(zhì)儲存在-20℃。

1.5.4 標(biāo)本處理 將根管內(nèi)組織和齦下菌斑標(biāo)本DNA進(jìn)行Realtime PCR，每份樣本重復(fù)3次，取其平均值。Realtime PCR時，選取構(gòu)建的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品（Standard），同時設(shè)置一個無template的空白陰性對照（NTC），進(jìn)行絕對定量的分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計軟件，定量資料正態(tài)分布以（）表示，偏態(tài)分布以M（IQR）表示。定量資料組內(nèi)比較符合正態(tài)分布時采用配對樣本t檢驗，不符合時采用配對樣本非參數(shù)Wilcoxon檢驗。組間比較，符合正態(tài)分布時采用兩獨立樣本t檢驗，不符合時采用兩獨立樣本非參數(shù)U檢驗（Mann-Whitney U test）。根管內(nèi)組織和齦下菌斑細(xì)菌數(shù)量關(guān)系用斯皮爾曼秩相關(guān)分析。以α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1 實驗組根管內(nèi)組織和齦下菌斑病原菌分布比例

根管內(nèi)和齦下菌斑中均能檢出8種病原菌，根管內(nèi)分布最多的病原菌為Ds、Pe、Fn；齦下菌斑分布最多的為Pg、Fn、Tf、Td、Pe及Pi，見圖1。

Figure 1 Proportion of pathogen distribution in root canal tissue and subgingival plaque in in patients with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin圖1 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患者根管內(nèi)組織和齦下菌斑病原菌分布比例

2.2 實驗組根管內(nèi)組織與其齦下菌斑病原菌數(shù)量及實驗組與對照組齦下菌班病原菌數(shù)量比較

采用配對樣本非參數(shù)Wilcoxon檢驗比較實驗組根管內(nèi)組織與齦下菌斑病原菌數(shù)量，結(jié)果顯示，Ds、Pe數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.263、P＝0.277），其余6種病原菌數(shù)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。對實驗組與對照組齦下菌斑標(biāo)本病原菌數(shù)量進(jìn)行兩獨立樣本非參數(shù)U檢驗（Mann-Whitney U test）發(fā)現(xiàn)Ds數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.241），其余7種病原菌數(shù)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙根管內(nèi)組織和齦下菌斑病原菌數(shù)量比較Table 2 Number of pathogens in root canal tissues and subgingival plaque in teeth with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin M（IQR）

表3 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙和重度牙周炎患牙齦下菌斑病原菌數(shù)量比較Table 3 Comparison of the number of subgingival plaque pathogens between teeth with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin and teeth with severe periodontitis M（IQR）

2.3 斯皮爾曼秩相關(guān)分析實驗組根管內(nèi)組織與其齦下菌斑細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系

結(jié)果顯示實驗組根管內(nèi)組織與齦下菌斑中Ef（r＝0.347，P＜0.05）、Pe（r＝0.363，P＜0.05）、Pg（r＝0.437，P＜0.01）、Td（r＝0.471，P＜0.01）、Tf（r＝0.679，P＜0.01）數(shù)量呈正相關(guān)，見表4。

表4 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙根管內(nèi)組織與其齦下菌斑細(xì)菌數(shù)量的相關(guān)性分析Table 4 Relationship between the number of bacteria in root canal tissues and subgingival plaque in teeth with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin

3討論

牙髓組織與牙周組織解剖結(jié)構(gòu)互通，兩者的病變常發(fā)生交叉感染，因而導(dǎo)致聯(lián)合病變的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致單純牙髓炎和牙周病的微生物屬于不同的菌種，而且不同的感染微生物對組織的破壞機制的不同會導(dǎo)致疾病的臨床表現(xiàn)也不盡相同［6］。此外，不同深度牙周袋中的微生物也會受到局部環(huán)境影響，而深牙周袋是常見的導(dǎo)致牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變的牙周病損［7］。

牙周可疑致病菌主要有Pg，Td，Tf，F(xiàn)n，Pi等［8］。本實驗應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對以上8種病原菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示實驗組根管內(nèi)及兩組齦下菌斑中均能檢測到這些細(xì)菌。實驗組根管內(nèi)分布最多的病原菌為Ds、Pe、Fn；齦下菌斑分布最多的為Pg、Fn、Tf、Td、Pe及Pi。說明牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙牙周組織和牙髓組織中的菌群結(jié)構(gòu)和組成具有相似性但數(shù)量上存在差異性。楊萬娟等［9］檢測牙周炎患者齦下菌斑菌群發(fā)現(xiàn)，廣泛型侵襲性牙周炎（generalized aggressive periodontitis，GAgP）和重度慢性牙周炎（severe chronic periodontitis，SCP）患者的優(yōu)勢菌群相似，均包括擬桿菌門、卟啉單胞菌屬和Pe等。本實驗兩組齦下菌斑檢出的病原菌組成與其結(jié)果相似，Ef占的比重最小。Ef首先從持續(xù)性根尖周炎中被分離出，隨后在很多其他的牙髓感染中被依次檢出，在難治性根尖周炎根管中的發(fā)現(xiàn)率較高。

Pereira等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在牙周牙髓聯(lián)合病變患者的牙髓組織中可檢出主要存在于牙周的Pi，Pg等。國內(nèi)外學(xué)者通過PCR-DGGE凝膠電泳分析后認(rèn)為根管內(nèi)的微生物與牙周袋內(nèi)的非常相似［11-12］。本實驗在這些研究的基礎(chǔ)上檢測了牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變者根管及牙周袋內(nèi)病原微生物數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)根管內(nèi)除了Ds和Pe外，其余6種常見病原菌與齦下菌斑病原菌數(shù)量均有顯著差異，推測牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變根管內(nèi)樣本因髓腔處于相對封閉狀態(tài)，病原微生物僅通過根尖孔和牙本質(zhì)小管進(jìn)入根管系統(tǒng)，因此細(xì)菌檢出量較少，而牙周袋較封閉的根管系統(tǒng)更加開放，從而有更多的病原微生物進(jìn)入牙周袋內(nèi)。

牙周病變中致病微生物所產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物可通過側(cè)支根管和副根管進(jìn)入牙髓組織內(nèi)，導(dǎo)致牙髓組織發(fā)生病變。齦下刮治或根面平整術(shù)后牙齒根面牙骨質(zhì)缺損也會導(dǎo)致牙本質(zhì)小管暴露，即使不存在側(cè)支根管和副根管，細(xì)菌也可通過牙本質(zhì)小管進(jìn)入牙髓組織［13］。另有研究報道中度到重度慢性牙周炎可影響牙髓組織發(fā)生病變，牙本質(zhì)小管可作為細(xì)菌在牙髓組織和牙周組織間傳播感染的通道［14］。本實驗通過對牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病患牙和重度牙周炎患牙齦下菌斑檢出的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除Ds外，其余7種病原菌數(shù)量均有顯著差異，牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變牙周袋內(nèi)細(xì)菌檢測數(shù)量顯著高于重度牙周炎患牙，與Holt等［15］研究結(jié)果一致。牙周原發(fā)病變較長時間得不到治療時，牙周袋內(nèi)致病菌數(shù)量會持續(xù)增加，可通過深牙周袋經(jīng)根尖區(qū)或側(cè)支根管進(jìn)入牙髓組織內(nèi)，使發(fā)生繼發(fā)性牙髓炎的風(fēng)險增大。盡管牙周牙髓聯(lián)合病變患牙和牙周炎患牙都有致病菌定植，但炎癥部位致病菌的量和分布有所不同，只有當(dāng)致病菌數(shù)量達(dá)到某一臨界值時才會引起牙髓組織炎癥。

Nonnenmacher等［16］研究認(rèn)為在牙周炎發(fā)展過程中牙周炎癥部位細(xì)菌數(shù)量可能是關(guān)鍵，牙周健康與牙周炎的主要區(qū)別并不是致病菌檢出率不同，而是陽性樣本中致病菌數(shù)量的差異。只有細(xì)菌存在不一定導(dǎo)致牙周炎發(fā)生，牙周炎的發(fā)生發(fā)展與宿主防御機制、細(xì)菌之間相互作用、細(xì)菌在牙周定居的數(shù)量水平等諸多因素有關(guān)。本實驗通過分析牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變者根管和齦下菌斑細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Ef、Pe、Pg、Td、Tf細(xì)菌在根管內(nèi)與牙菌斑中的數(shù)量具有高度相關(guān)性，表明這些病原菌可能在逆行性牙髓炎的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了較重要的角色。其中Pe、Pg是感染根管內(nèi)最常見的優(yōu)勢菌，Ef在原發(fā)和繼發(fā)的感染根管內(nèi)均能被檢出。Wara-aswapati等［17］的研究結(jié)果表明，在牙周炎患者齦下菌斑中Pg、Tf、Td細(xì)菌之間存在強烈的共聚積作用，細(xì)菌間的黏附具有特異性和較強的致病關(guān)聯(lián)性，提示這3種致病菌可能是逆行性牙髓炎牙髓組織感染的主要致病菌。此外，許多研究結(jié)果證實齦下菌斑中細(xì)菌數(shù)量水平與牙周袋深度之間存在相關(guān)性，隨著牙周袋加深，牙周袋內(nèi)致病菌數(shù)量相應(yīng)增加，細(xì)菌之間的致病菌協(xié)同致病作用更顯著［18］。隨著牙周炎的進(jìn)一步發(fā)展，牙槽骨的破壞常達(dá)根尖1/3，而此處常常是側(cè)枝根管、根尖分歧最常分布的區(qū)域，為牙周袋內(nèi)的微生物進(jìn)入牙髓組織提供了更多的解剖通道，侵入牙髓組織的細(xì)菌數(shù)量也增多，逐漸引發(fā)牙髓的退行性變，進(jìn)而導(dǎo)致牙髓病變［19］。而整個根管系統(tǒng)內(nèi)也是無氧環(huán)境，利于這些厭氧菌生長繁殖，在牙周和牙髓兩種組織中相互擴散和影響使病變加重［20］。

牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變常見病原菌在根管內(nèi)數(shù)量低于齦下菌斑且根管內(nèi)病原菌數(shù)量與齦下菌斑密切相關(guān)，建議牙周感染患者應(yīng)及時進(jìn)行合理的治療，以降低其發(fā)展成為牙周牙髓聯(lián)合病變的風(fēng)險。