燕 輝，王雪芹，代智光

（河南科技大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

近年來(lái)，隨著礦山開(kāi)采、金屬冶煉與城市交通的迅速發(fā)展及農(nóng)藥化肥的大量施用，重金屬污染物隨著工業(yè)三廢與農(nóng)藥化肥被不斷地釋放到外界環(huán)境，最終導(dǎo)致了重金屬元素在土壤中的大量積累［1-2］。鎘是一種對(duì)動(dòng)植物毒害極大的重金屬元素［3］，它進(jìn)入土壤后主要累積在土壤表層，極少向下遷移［4-5］，從而導(dǎo)致土壤質(zhì)量不斷降低；同時(shí)，鎘元素具有較高的生物有效性［6］，它極易被植物根系吸收，進(jìn)而在植物體內(nèi)不斷積累，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。若鎘離子經(jīng)過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，則會(huì)對(duì)人體健康造成極大威脅。目前，土壤鎘污染已經(jīng)成為限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和危害人類生命健康的重要環(huán)境問(wèn)題［7-8］。

大豆（Glycine maxMerr）富含植物蛋白、不飽和脂肪酸和膳食纖維，是我國(guó)重要的油料作物、糧食作物和飼料作物［3］，在穩(wěn)定糧食產(chǎn)量和保障糧食安全方面發(fā)揮著極其重要的作用。近年來(lái)，隨著土壤中鎘元素的不斷積累，鎘污染對(duì)大豆生產(chǎn)的負(fù)面影響也在持續(xù)增加。為提高大豆的抗鎘性，廣大學(xué)者開(kāi)展了大量基礎(chǔ)性研究工作［3，9-10］。但受當(dāng)前大豆響應(yīng)鎘脅迫生理機(jī)制的研究不夠全面的影響，提高大豆抗鎘性的研究成果收效甚微。因此，要穩(wěn)定我國(guó)大豆產(chǎn)量、保障我國(guó)糧食安全，首先就必須探明大豆響應(yīng)鎘脅迫的生理機(jī)制。為此，本研究對(duì)鎘脅迫下大豆葉片鎘離子含量、內(nèi)源激素、光合碳同化及生長(zhǎng)參數(shù)的變化進(jìn)行了分析，進(jìn)而為提高大豆抗鎘性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)

將大豆種子播于已經(jīng)裝滿基質(zhì)的穴盤，并于種子發(fā)芽后選取生長(zhǎng)勢(shì)均勻且發(fā)育良好的幼苗，移植到已裝相同質(zhì)量基質(zhì)的試驗(yàn)盆內(nèi)。在整個(gè)試驗(yàn)期間保證充足的水分供應(yīng)，以維持大豆幼苗正常的生長(zhǎng)發(fā)育。幼苗生長(zhǎng)2周后，分別使用100 mL添加0與200 μmol·L-1CdSO4的溶液對(duì)大豆幼苗進(jìn)行脅迫處理。在處理1、3、6與9 d后，分別各選取4株幼苗，測(cè)定葉片鎘含量、光合參數(shù)、內(nèi)源激素與生長(zhǎng)參數(shù)等指標(biāo)。

1.2 觀測(cè)項(xiàng)目與方法

1.2.1 光合參數(shù)測(cè)定

鎘脅迫1、3、6與9 d后，采用配置了紅藍(lán)光源（Li-6400-02B）的Licor-6400光 合 儀（LiCor Inc. Lincoln，Nebraska，USA）對(duì) 大 豆 葉 片 的 光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度等光合參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)紅藍(lán)光源設(shè)置為1000 μmol·m-2·s-1，樣 品 室CO2濃 度 設(shè) 置 為400 μmol·mol-1。

1.2.2 生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定

鎘脅迫1、3、6與9 d后，分別使用刻度尺測(cè)定大豆幼苗的株高，隨后迅速將幼苗從基質(zhì)中挖出，將根系剪掉并置于溫度為105℃的烘箱中，烘干后稱重。同時(shí)，迅速將大豆葉片從枝條摘掉并拍照。使用AutoCAD計(jì)算葉面積。

1.2.3 葉片鎘含量測(cè)定

用液氮將葉片研磨成粉末。將天平稱重后的一定量葉片粉末、硝酸（10 mL）與高氯酸（1 mL）先后倒入三角瓶，靜置一夜后，將三角瓶置于約100℃的電熱板，消煮至瓶中溶液約0.5 mL。用25 mL容量瓶定容消煮液，并用原子吸收光譜儀測(cè)定葉片中鎘離子含量。

1.2.4 葉片內(nèi)源激素含量測(cè)定

稱取一定量大豆葉片粉末，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定其中脫落酸（ABA）與玉米素核苷（ZR，細(xì)胞分裂素的一種）的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘離子含量變化

鎘處理?xiàng)l件下，大量的鎘離子被大豆根系通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸或被動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞轿?。根系吸收的鎘離子會(huì)進(jìn)一步通過(guò)木質(zhì)部蒸騰流運(yùn)輸至冠層，導(dǎo)致鎘離子在大豆冠層大量積累。對(duì)鎘脅迫下大豆葉片鎘離子含量變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：鎘脅迫1 d后，大豆葉片鎘離子含量即較對(duì)照顯著升高；伴隨著脅迫的加劇，葉片鎘離子含量呈逐步升高趨勢(shì)；200μmol·L-1鎘離子脅迫9 d后，大豆葉片鎘離子含量達(dá)到最大值（圖1）。

2.2 鎘脅迫對(duì)光合作用的影響

分析反映光合表觀特性的氣體交換參數(shù)變化，對(duì)深入認(rèn)識(shí)作物響應(yīng)逆境脅迫的生理機(jī)制有重要的作用。本研究對(duì)鎘脅迫下氣體交換參數(shù)的變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，伴隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆幼苗葉片光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度均呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)；且在鎘脅迫9 d后達(dá)到最低值（圖2A、B、C）。而葉片胞間CO2濃度的變化趨勢(shì)與以上光合參數(shù)不同。鎘脅迫初期，伴隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，胞間CO2濃度呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)；但鎘脅迫9 d后，胞間CO2濃度又呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)（圖2D）。

2.3 鎘脅迫對(duì)內(nèi)源激素含量的影響

植物內(nèi)源激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的微量卻能起到生理調(diào)節(jié)作用的化合物。其中，脫落酸（ABA）與細(xì)胞分裂素（CK）是2種重要的植物內(nèi)源激素，在調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、光合碳同化及作物生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。對(duì)鎘脅迫條件下大豆葉片ABA、玉米素核苷（ZR，細(xì)胞分裂素的一種）及兩者拮抗效應(yīng)（ABA/ZR）進(jìn)行分析證實(shí)，葉片ABA含量在鎘脅迫1 d后即呈升高趨勢(shì)，且在鎘脅迫3 d后顯著升高；鎘脅迫9 d后，葉片ABA含量升至最高（圖3A）。與ABA不同，葉片ZR含量在鎘脅迫1 d后即呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且在鎘脅迫3 d后較對(duì)照顯著降低；鎘脅迫9 d后，葉片ZR含量降至最低值（圖3B）。葉片ABA/ZR值的變化趨勢(shì)與葉片ABA含量相似，隨著鎘脅迫程度的加劇，葉片ABA/ZR值呈現(xiàn)出逐步升高的趨勢(shì)，且在鎘脅迫9 d后升至最大值（圖3C）。

2.4 鎘脅迫下內(nèi)源激素調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)與光合碳同化的生理機(jī)制

為了探明鎘脅迫下內(nèi)源激素調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)與光合碳同化的生理機(jī)制，本研究對(duì)內(nèi)源激素ABA含量、ZR含量及ABA/ZR與鎘離子含量的關(guān)系進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步探討了ABA、ZR及ABA/ZR與氣孔導(dǎo)度及光合速率的相關(guān)性。結(jié)果表明，葉片ABA含量、ABA/ZR與鎘離子含量呈正相關(guān)（圖4A，C），ZR含量則與鎘離子含量呈負(fù)相關(guān)（圖4B）。進(jìn)一步分析ABA、ZR及ABA/ZR與氣孔導(dǎo)度及光合速率的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，ABA、ABA/ZR與氣孔導(dǎo)度及光合速率呈負(fù)相關(guān)（圖5A，B，E，F(xiàn)），而ZR與氣孔導(dǎo)度及光合速率呈正相關(guān)（圖5C，D）。這表明ABA主要起到誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的作用，而ZR則能夠促進(jìn)氣孔開(kāi)放。

2.5 鎘脅迫對(duì)生長(zhǎng)參數(shù)的影響

光合作用是作物干物質(zhì)形成的生物學(xué)基礎(chǔ)。鎘脅迫對(duì)大豆光合碳同化的限制最終導(dǎo)致其生長(zhǎng)參數(shù)的變化，其中，中短期鎘脅迫對(duì)大豆幼苗株高的影響不顯著；長(zhǎng)期鎘脅迫后，大豆幼苗株高較對(duì)照顯著降低（圖6A）。葉面積與根干重對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)與株高相似，在中短期鎘處理下呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)，在長(zhǎng)期鎘脅迫下較對(duì)照顯著降低（圖6B、C）。

3 討論

3.1 鎘脅迫下的根源化學(xué)信號(hào)傳輸機(jī)制

土壤環(huán)境變化會(huì)首先影響作物根系生理特性。土壤鎘離子積累能夠?qū)ψ魑锔翟斐缮砀珊担⑦M(jìn)一步誘導(dǎo)根區(qū)內(nèi)源激素的合成發(fā)生變化［11-12］。其中，生理干旱能夠誘導(dǎo)根源ABA的大量合成［13-14］，ABA通過(guò)木質(zhì)部蒸騰流向上傳輸至冠層，并進(jìn)一步誘導(dǎo)葉片氣孔收縮，進(jìn)而降低作物光合碳同化速率［15］。生理干旱還會(huì)降低根系異戊烯?；D(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)而減少其催化合成根區(qū)ZR的量，通過(guò)蒸騰流傳輸至葉片的ZR量亦會(huì)同步降低［16］。ZR能夠拮抗ABA誘導(dǎo)的氣孔收縮，進(jìn)而維持氣孔開(kāi)度，提高作物光合碳同化速率［17］。因此，葉片氣孔的開(kāi)放程度取決于ABA與ZR的綜合作用［18］。本研究對(duì)鎘脅迫下內(nèi)源激素的復(fù)合作用（ABA/ZR）與葉片鎘離子含量、氣孔導(dǎo)度及光合速率的相關(guān)性進(jìn)行了分析，伴隨著葉片鎘離子含量的升高，葉片ABA/ZR亦呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，ABA/ZR的升高會(huì)誘導(dǎo)葉片氣孔收縮，進(jìn)而降低葉片光合速率。

3.2 鎘脅迫下的光合氣孔與非氣孔限制

一般說(shuō)來(lái)，降低作物光合碳同化的因素可分為氣孔與非氣孔兩類［19-20］。鎘脅迫初期，大豆幼苗能夠通過(guò)收縮氣孔降低葉片蒸騰，進(jìn)而抑制根區(qū)積累的鎘離子向冠層運(yùn)輸。同時(shí)，氣孔收縮亦會(huì)限制外界CO2進(jìn)入葉肉細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞胞間CO2濃度降低。當(dāng)細(xì)胞間隙CO2的量不能滿足光合碳同化需求時(shí)，即會(huì)對(duì)光合作用造成氣孔限制［21-23］。隨著鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大量鎘離子通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入根細(xì)胞，并通過(guò)木質(zhì)部蒸騰流不斷運(yùn)輸至葉肉細(xì)胞。鎘離子引起的逆境脅迫會(huì)增大葉肉細(xì)胞核膜、質(zhì)膜與細(xì)胞器膜透性，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核解體、細(xì)胞代謝紊亂、結(jié)構(gòu)受損、功能衰退［24］，由此導(dǎo)致PS II反應(yīng)中心受損，對(duì)光合碳同化造成非氣孔限制［25］。因此，作物光合碳同化在鎘脅迫條件下往往受到氣孔限制因素與非氣孔限制因素的共同作用［26］。至于哪一種因素在限制光合碳同化過(guò)程中起主導(dǎo)作用，目前主要是通過(guò)判斷氣孔導(dǎo)度、光合速率與胞間CO2濃度的變化方向來(lái)確定［27-28］。若氣孔導(dǎo)度、光合速率與胞間CO2濃度同步降低，表明氣孔因素在限制作物光合碳同化過(guò)程中起主導(dǎo)作用；反之，若氣孔導(dǎo)度與光合速率同步降低，而胞間CO2濃度升高，則表明非氣孔因素在限制作物光合過(guò)程中占主導(dǎo)［29］。本研究對(duì)鎘處理?xiàng)l件下光合碳同化的主要限制因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫1～6 d時(shí)，土壤鎘環(huán)境形成的生理干旱會(huì)刺激化學(xué)信號(hào)（如內(nèi)源激素ABA、ZR等）在根區(qū)積累；根源化學(xué)信號(hào)伴隨著木質(zhì)部蒸騰流向上運(yùn)輸至冠層，并誘導(dǎo)氣孔收縮。伴隨著氣孔導(dǎo)度的降低，光合速率與胞間CO2濃度亦呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，表明鎘脅迫下的氣孔收縮是此時(shí)光合碳同化受限制的主要原因。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，鎘脅迫9 d后，大量鎘離子進(jìn)入大豆葉肉細(xì)胞，這將會(huì)對(duì)葉肉細(xì)胞造成離子毒害，進(jìn)而降低葉片光合碳同化能力。當(dāng)大豆葉片光合碳同化消耗的CO2量低于進(jìn)入葉肉細(xì)胞的CO2量時(shí)，雖然大豆的氣孔導(dǎo)度與光合速率降低，但胞間CO2濃度呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。這表明此時(shí)非氣孔因素是限制光合碳同化的主要原因。鎘處理對(duì)光合碳同化的限制最終導(dǎo)致長(zhǎng)期鎘脅迫大豆的株高、葉面積與根干重較對(duì)照顯著降低。

4 結(jié)論

鎘脅迫造成了葉片ABA含量升高與ZR含量降低，ABA/ZR升高進(jìn)一步誘導(dǎo)氣孔收縮，限制光合碳同化正常進(jìn)行。

鎘脅迫初期，油菜葉片氣孔導(dǎo)度、光合速率與胞間CO2濃度均逐漸降低，氣孔收縮是此時(shí)光合受限的主要原因；鎘脅迫9 d后，伴隨著氣孔導(dǎo)度與光合速率的降低，胞間CO2濃度升高，非氣孔因素是此時(shí)光合受限的主要原因。

鎘脅迫對(duì)光合碳同化的限制最終導(dǎo)致了大豆株高、葉面積與根干重顯著降低。