魏嘉怡，史芳芳，周明冬

（1江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830088；3新疆農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護站，新疆 烏魯木齊 830006）

草莓（Fragaria×ananassaDuch.）屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，因其色澤鮮艷，果實柔軟多汁，香味濃郁，酸甜可口，富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和維生素C，并含有可抑制癌細(xì)胞生長的有效成分[1]，而深受國內(nèi)外消費者喜愛。近年來，隨草莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，草莓連作病害現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，其中草莓枯萎病是主要的土傳病害之一。草莓枯萎病是由尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporumf.sp.fragariae）從草莓根部侵染引起的系統(tǒng)性病害[2]，會導(dǎo)致草莓根部壞死，生長不良，葉無光澤，最后引起葉片萎蔫直至植株枯萎死亡。該病害會使草莓產(chǎn)量和品質(zhì)大幅降低，嚴(yán)重危害草莓產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康、穩(wěn)定地發(fā)展[3]。

目前，國內(nèi)草莓枯萎病的防治方法有農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治和生物防治等。農(nóng)業(yè)防治包括作物輪作、脫毒種苗移栽以及選育抗病品種等，但因生產(chǎn)成本高、勞動強度大等因素，并未得到廣泛應(yīng)用；物理防治主要是高溫土壤消毒技術(shù)，即利用草莓病原菌在高溫環(huán)境下難以生長的特點，通過高溫暴曬土壤達到消毒殺菌的目的；化學(xué)防治則是使用一些化學(xué)試劑來控制病原菌的生長，但其不僅會給消費者的食品安全帶來威脅，而且大量使用農(nóng)藥還會對環(huán)境造成不良影響，所以不宜推廣使用。因此，生產(chǎn)中需要尋找一些對植物無害或有益、卻能抑制土壤中病原生物生長代謝的生物，利用生物防治來減少病蟲害的發(fā)生或降低病害的發(fā)展速率，這無疑是最好的選擇。生物防治對環(huán)境中的有益微生物影響不大，不僅遏制病蟲害再猖獗，而且還具有防治成本低、增產(chǎn)增收、不污染環(huán)境等優(yōu)點，最重要的是對人畜植物無害[4]。因此，利用微生物及其代謝產(chǎn)物代替化學(xué)試劑防治草莓枯萎病已成為主要發(fā)展方向。本文采用菌絲生長速率法，測定12種生物殺菌劑對草莓枯萎病的室內(nèi)抑菌活性，篩選出防治草莓枯萎病的最適殺菌劑類型、配置及濃度，為草莓枯萎病的防治和新型生物藥劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）[5]，用于草莓枯萎病的分離、保存以及毒力測定。

1.1.2 供試菌株

草莓枯萎病菌采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所草莓種苗繁育基地。在實驗室進行分離、鑒定后，按柯赫氏法則驗證并將菌株接種到PDA斜面上，于4℃醫(yī)用恒溫箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 參試藥劑

1.1.3 .1粉劑型生物殺菌劑

（1）1×109CFU·g-1膠凍樣類芽孢桿菌（Bacillus jelly）·枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），又名稼碧樂（復(fù)合型）。（2）1×1011CFU·g-1枯草芽孢桿菌，又名冠藍（單一型）。（3）6%春雷霉素（kasugamycin）（抗生素型）。（4）1×109CFU·g-1枯草芽孢桿菌·膠凍樣類芽孢桿菌，又名菌益（復(fù)合型）。以上4種菌劑均由武漢科諾生物科技股份有限公司生產(chǎn)。（5）1×106個孢子·g-1寡雄腐霉菌（Pythium oligadrum）（單一型），捷克生物制劑股份有限公司生產(chǎn)。（6）3×108CFU·g-1哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（單一型），美國拜沃股份有限公司生產(chǎn)。（7）1×109個孢子·g-1枯草芽孢桿菌·粉紅粘帚霉（Gliocladium roseum），（復(fù)合型）北京啟高生物科技有限公司生產(chǎn)。（8）1×1011個芽孢·g-1枯草芽孢桿菌，又名青葉子（單一型），河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 .2水劑型生物殺菌劑

（1）5×108CFU·g-1多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）。（2）1×1010個孢子·g-1解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。（3）3%春雷霉素·5×108個孢子·g-1枯草芽孢桿菌。以上3種菌劑均由武漢科諾生物科技股份有限公司生產(chǎn)。（4）5×109個孢子·mL-1枯草芽孢桿菌，中國農(nóng)科院植保所研制生產(chǎn)。

1.1.4 儀器設(shè)備

電子天平（感量0.1mg）、DHP—9080B電熱恒溫培養(yǎng)箱、直徑90mm的培養(yǎng)皿、三角瓶、移液器、接種刀、鑷子、50mL離心管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液配制及濃度設(shè)置

1.2.1 .1粉劑型藥液

稱取0.1g粉劑型殺菌劑放于100mL三角瓶中，加入100mL無菌水溶解，8種粉劑型藥劑均用此法配制成100mg·mL-1母液。不同藥劑在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度設(shè)置為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0mg·mL-1共8個梯度。其中母液及各濃度試驗藥液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1 .2水劑型藥液

用200mL移液器取50mL水劑型殺菌劑于100mL三角瓶中，加入50mL無菌水溶解，4種水劑型藥劑均用此法配制成100mL·mL-1母液。不同藥劑在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度設(shè)置為0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1和1.000000mL·mL-1共7個梯度。其中母液及各濃度試驗藥液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 敏感性檢測

采用菌絲生長速率法進行檢測，將保存的草莓枯萎病菌接種到PDA平皿中，在30℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，然后放置在4℃醫(yī)用恒溫箱中保存。試驗時在菌落邊緣用接種刀切取直徑5mm的菌餅，分別轉(zhuǎn)移到按2倍比稀釋配制的含藥PDA平皿中和空白對照PDA平皿中，在30℃電熱恒溫箱中培養(yǎng)96h，待對照中菌落長至與平皿直徑一樣時，采用十字交叉法量取菌落直徑（如圖1所示）。計算菌落直徑均值，按下列公式計算菌絲生長平均抑制率[6]。菌落生長平均抑制率=

圖1 1×109CFU·g-1膠凍樣類芽孢桿菌·枯草芽孢桿菌抑菌實驗Figure 1 Anti-bacterial experiments of Bacillus jelly·Bacillus subtilis（1×109CFU·g-1）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物殺菌劑對草莓枯萎病菌絲生長的影響

2.1.1 粉劑型藥劑對草莓枯萎病菌絲生長的影響

如表1所列可知，稼碧樂、冠藍、6%春雷霉素、菌益、1×106個孢子·g-1寡雄腐霉菌、3×108CFU·g-1哈茨木霉、1×109個孢子·g-1枯草芽孢桿菌·粉紅粘帚霉、青葉子在含藥PDA培養(yǎng)基中處理濃度為0.5～100.0mg·mL-1時，對草莓枯萎病菌絲生長的抑制率分別為76.47%～54.12%、82.35%～70.59%、24.12%～11.76%、88.24%～58.82%、52.94%～25.88%、82.35%～10.59%、69.41%～25.88%和76.47%～67.06%。

續(xù)上表

2.1.2 水劑型藥劑對草莓枯萎病菌絲生長的影響

如表2所列可知，5×108CFU·g-1多粘類芽孢桿菌、1×1010個孢子·g-1解淀粉芽孢桿菌、3%春雷霉素·5×108個孢子·g-1枯草芽孢桿菌、5×109個孢子·mL-1枯草芽孢桿菌在含藥PDA培養(yǎng)基上處理濃度為0.000001～1.000000mg·mL-1時，對草莓枯萎病菌絲生長的抑制率分別為64.71%～14.71%、81.18%～52.94%、61.76%～8.82%和76.47～44.12%。結(jié)果表明草莓枯萎病菌對不同的水劑殺菌劑敏感性差異較大。

表2 不同濃度水劑型生物殺菌劑對草莓枯萎病菌菌絲生長的抑制效果Table 2 Effect of different bio fungicides on Fusarium wilt of strawberry

2.2 草莓枯萎病對不同粉劑生物殺菌劑敏感性比較

將8種粉劑殺菌劑毒力試驗數(shù)據(jù)進行毒力回歸方程分析，其中春雷霉素和寡雄腐霉菌的毒力回歸方程顯著水平F值＞0.05，因此，這兩種殺菌劑建立的模型不合適，所以不做進一步分析。其余6種殺菌劑顯著水平F值均＜0.05，其毒力回歸曲線是合適的。這6種粉劑殺菌劑與草莓枯萎病菌的抑制率之間是一種不對稱的S形曲線關(guān)系，將其濃度進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后作為橫坐標(biāo)，抑制率對應(yīng)的幾率值作為縱坐標(biāo)，測得回歸方程和相關(guān)系數(shù)R，濃度與抑制率之間表現(xiàn)為一元線性回歸關(guān)系，通過相關(guān)性分析，可以檢驗線性關(guān)系的顯著性，分析比較殺菌劑對病菌的毒力。

如表3所示可知，6種供試殺菌劑基本歸為3類：青葉子和冠藍的半最大效應(yīng)濃度（EC50）均是0.0001mg·mL-1，比其他供試藥劑小，說明這2種藥劑抑菌效果最好；稼碧樂和菌益的EC50分別是0.1277和0.0921mg·mL-1，與其他供試藥劑相比較小，說明這2種藥劑抑菌效果較好；哈茨木霉和枯草芽孢桿菌·粉紅粘帚霉的EC50介于5.0312～6.9675mg·mL-1之間，說明該藥劑抑菌效果一般。

表3 草莓枯萎病菌對6種生物殺菌劑的敏感性檢測結(jié)果Table 3 Results of Fusarium wilt of strawberry to sensibility of 6 bio fungicides

3 結(jié)論與討論

草莓是多年生植物，在同塊地里連續(xù)多年種植后，會導(dǎo)致土壤中病菌大量積累，加上品種抗病性下降等影響因素，使得草莓枯萎病的發(fā)病率逐年加重，因而草莓栽培管理過程中草莓枯萎病防治一直都是重點關(guān)注問題。我國北方草莓主要種植在塑料大棚中，枯萎病普遍發(fā)生較重，主要使用多菌靈、百菌通（琥銅·鋅·乙鋁）、代森錳鋅、特克多和甲基托布津等殺菌劑進行防治，在秋季蓋棚前將植株殘體清理后施用藥劑處理根部土壤，或在植株發(fā)病后灌根[2]。宋志偉等[7]用一種復(fù)合微生物制劑對草莓黃萎病的田間防效可達76.9%～84.6%。因此，生物防治是防治草莓枯萎病較適合的方式。

本文采用菌絲生長速率法測定12種生物殺菌劑對草莓枯萎病菌的室內(nèi)抑菌活性。結(jié)果表明：（1）粉劑型殺菌劑的毒力大小順序為冠藍＞菌益＞青葉子＞稼碧樂＞1×109個孢子·g-1枯草芽孢桿菌·粉紅粘帚霉＞3×108CFU·g-1哈茨木霉＞1×106個孢子·g-1寡雄腐霉菌＞6%春雷霉素；水劑殺菌劑的毒力大小順序為1×1010個孢子·g-1解淀粉芽孢桿菌＞3%春雷霉素·5×108個孢子·g-1枯草芽孢桿菌＞5×108CFU·g-1多粘類芽孢桿菌＞5×109個孢子·mL-1枯草芽孢桿菌；結(jié)合粉劑與水劑殺菌劑試驗結(jié)果，得出12種生物殺菌劑的毒力大小順序為冠藍＞青葉子＞菌益＞1×1010個孢子·g-1解淀粉芽孢桿菌＞稼碧樂＞1×109個孢子·g-1枯草芽孢桿菌·粉紅粘帚霉＞3×108CFU·g-1哈茨木霉＞3%春雷霉素·5×108個孢子·g-1枯草芽孢桿菌＞5×109個孢子·mL-1枯草芽孢桿菌＞5×108CFU·g-1多粘類芽孢桿菌＞1×106個孢子·g-1寡雄腐霉菌＞6%春雷霉素。（2）微生物殺菌劑中冠藍比5×109個孢子·mL-1枯草芽孢桿菌的抑菌活性強，說明同種微生物殺菌劑中含孢子越多抑菌活性越強；試驗中冠藍比6%春雷霉素的抑菌活性更好，表明微生物殺菌劑比抗生素殺菌劑的效果要好；試驗中菌益比5×109個孢子·mL-1枯草芽孢桿菌的抑菌效果更好，則說明復(fù)合殺菌劑比單一殺菌劑的抑菌活性更好。近年來，枯草芽孢桿菌在促進作物生長、土壤提質(zhì)和作物微環(huán)境改良、土傳病害控制及農(nóng)業(yè)耕地污染治理等方面的作用越來越廣泛。水劑殺菌劑中效果最好的是解淀粉芽孢桿菌，與胡亞杰等[8，9]研究結(jié)果一致，它的抑制效果明顯，且較低濃度時也存在較好的抑制效果。其中，春雷霉素類抗菌素對草莓枯萎病菌的抑制效果最差，木霉類殺菌劑殺菌效果表現(xiàn)不佳，可能與其需要寄生在活體植物上才能表現(xiàn)出較好殺菌效果的特性有關(guān)。

綜上所述，1×1011個芽孢·g-1枯草芽孢桿菌效果最好，該類藥劑具有良好的應(yīng)用前景；抗生素類的生物殺菌劑效果最差。本研究僅進行殺菌劑的室內(nèi)篩選，田間栽培試驗還有待開展。另外，還應(yīng)進一步研究各類藥劑的應(yīng)用技術(shù)，從而保證草莓的綠色無公害生產(chǎn)。