楊陽 ，付麗麗 ，趙愛華 ，徐苗

1. 沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）是世界上最古老，使用最廣泛的疫苗之一，主要用于結(jié)核?。╰uberculosis，TB）的預(yù)防［1-3］。BCG 接種機體后，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫，使機體獲得對結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的免疫能力［4-6］。效力評價是疫苗質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)之一，目前，BCG 效力評價方法為BCG 誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)法，根據(jù)動物對BCG 純蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）反應(yīng)大小進行評判［7］。

活菌數(shù)是皮內(nèi)注射用BCG 重要的質(zhì)控指標(biāo)之一［8-10］，活菌數(shù)與疫苗效力相關(guān)。本研究對活菌數(shù)的差異能否引起PPD 反應(yīng)大小的變化和BCG 誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平的差異進行分析，以探索新的BCG 效力評價方法。

1 材料與方法

1. 1 疫苗 皮內(nèi)注射用BCG 均為國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)，規(guī)格為 0. 25 mg ／ 支，每支 5 人份，批號分別為：201504a034、201507a052、201507a037、201503a024、201507a059。

1. 2 實驗動物 SPF 級豚鼠（同一性別，體重300 ～400 g）和 SPF 級 BALB ／c 小鼠（雌性，6 ～ 8 周齡，體重18 ～22 g）均由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0013。本實驗對實驗動物的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》（國科發(fā)財字［2006］398 號）相關(guān)規(guī)定進行。

1. 3 主要試劑 皮試用BCG-PPD：卡介菌純蛋白衍生物國家參考品（批號：230015-201501）和卡介苗活菌數(shù)檢測用參考品（以下稱參考苗）由中國食品藥品檢定研究院制備；BCG 培養(yǎng)早期濾液蛋白由中國食品藥品檢定研究院結(jié)核室制備，批號：2016-0114；小鼠IFNγ ELISPOT 試劑盒購自瑞典Mabtech 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 公司；ConA 購自美國Sigma 公司。

1. 4 不同活菌數(shù)BCG 對PPD 反應(yīng)影響的檢測 將豚鼠隨機分為6 組：5 個不同批號BCG 組和參考苗組，每組4 只。將BCG 用5 mL 生理鹽水復(fù)溶，經(jīng)豚鼠腹股溝皮下免疫，0. 5 mL ／ 只。免疫 5 周后，經(jīng)豚鼠背部脊柱兩側(cè)皮內(nèi)注射BCG-PPD，0. 2 mL ／ 只，24 h 后檢測PPD 反應(yīng)直徑大小。

1. 5 不同活菌數(shù)BCG 對小鼠脾淋巴細(xì)胞抗原特異性IFNγ 水平影響的檢測 將BALB ／ c 小鼠隨機分為6 組：5 個不同批號BCG 組和參考苗組，每組5 只。將BCG 用2. 5 mL 生理鹽水復(fù)溶，經(jīng)小鼠頭背部皮內(nèi)免疫，0. 5 mL ／ 只（即 1 ／ 5 人份），對照組注射等體積生理鹽水。分別于免疫后4、5 周，將小鼠脫頸處死，分離脾淋巴細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫斑點法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）測定淋巴細(xì)胞分泌抗原特異性IFNγ 的水平。調(diào)整細(xì)胞濃度為 2. 5 × 106個 ／ mL，加至已包被 IFNγ 抗體的96 孔板中，100 μL ／ 孔，再加入卡介苗培養(yǎng)早期濾液蛋白（終濃度 2 μg ／ mL）刺激物，50 μL ／ 孔，另設(shè)RPMI1640 培養(yǎng)基作為陰性對照，ConA（終濃度為1 μg ／ mL）作為陽性對照，每個樣本均設(shè) 2 個復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng) 48 h 后，按照 ELISPOT試劑盒說明書操作，檢測IFNγ 斑點形成細(xì)胞數(shù)（spot forming cells，SFCs）。

1. 6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異比較采用單因素方差分析，以P < 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；相關(guān)性分析采用Pearson 法，應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件作圖。

2 結(jié) 果

2. 1 不同活菌數(shù)BCG 對PPD 反應(yīng)的影響 BCG 活菌數(shù)在（1. 5 ～ 4. 6）× 106CFU ／ mg 范圍內(nèi)，其活菌數(shù)差異與誘導(dǎo)的皮膚變態(tài)反應(yīng)并無規(guī)律的變化，BCG 活菌數(shù)與PPD 反應(yīng)大小無相關(guān)性（F = 0. 820，P =0. 416），相關(guān)系數(shù)為0. 170。見圖1 和表1。

圖1 PPD 反應(yīng)大小與BCG 活菌數(shù)的相關(guān)性Fig. 1 The relationship between PPD reaction levels and viable bacteria counts in BCG

2. 2 不同活菌數(shù)BCG 對小鼠脾淋巴細(xì)胞抗原特異性IFNγ 水平的影響 各批次BCG 免疫后4 周的SFCs-IFNγ 均小于免疫后 5 周；SFCs-IFNγ 與活菌數(shù)呈正相關(guān)（F 分別為 60. 757 和 26. 289，P 分別為0. 001 和 0. 007），相關(guān)系數(shù)分別為 0. 969 和 0. 932，且兩個評價時間點趨勢一致。見圖2 和表1。

表1 不同BCG 制品PPD 反應(yīng)平均直徑及免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞IFNγ 的SFCsTab. 1 The average diameter of PPD reaction of different BCG products and the SFCs of IFNγ from murine spleen lymphocytes after BCG immunization with different numbers of viable bacteria

圖2 小鼠脾淋巴細(xì)胞抗原特異性IFNγ 的SFCs 與BCG活菌數(shù)的相關(guān)性Fig. 2 The correlation between SFCs of IFNγ from murine spleen lymphocytes and viable bacteria numbers in BCG

3 討 論

BCG 作為唯一預(yù)防TB 的疫苗至今已應(yīng)用百年，在世界各國的TB 防治中發(fā)揮了重要作用，也是我國計劃免疫疫苗中新生兒接種的第1 針。目前我國BCG 效力評價采用的是BCG 誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)方法，根據(jù)動物對PPD 反應(yīng)大小對結(jié)果進行評判［7］。本研究針對菌液濃度一致的條件，對BCG 活菌含量不同的制品進行了活菌數(shù)與PPD 反應(yīng)大小的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在活菌數(shù)為（1. 5 ～4. 6）×106CFU ／ mg 范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明確的量效關(guān)系，表明在此范圍內(nèi)結(jié)核菌素試驗不能體現(xiàn)活菌數(shù)差異給機體帶來的反應(yīng)差異。受限于樣本來源，本研究只對活菌數(shù)在（1. 5 ～ 4. 6）× 106CFU ／ mg 范圍內(nèi)的樣品進行了比較，其他活菌數(shù)范圍內(nèi)的制品也許會引起不同的PPD 反應(yīng)，尚需進行更大范圍的研究才能確認(rèn)PPD 反應(yīng)與活菌數(shù)之間的關(guān)系。

考慮到以上可能出現(xiàn)的現(xiàn)象，本研究同步進行了抗原特異性的IFNγ 水平檢測。IFN 是體內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，也是評價機體免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)［11-15］。其中，IFNγ 是機體抗感染的主要免疫因子。機體初次感染會誘導(dǎo)廣泛的IFNγ轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)，促進IFNγ 的產(chǎn)生，進而誘導(dǎo)輔助性T 細(xì)胞向Th1 方向極化，Th1 細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子從而激活巨噬細(xì)胞，將被感染的細(xì)胞清除。因此，本研究以小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IFNγ 的SFCs作為小鼠抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平的評價指標(biāo)，同時對不同活菌數(shù)BCG 誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫程度進行相關(guān)性分析。實驗結(jié)果表明，抗原特異性的IFNγ分泌量與BCG 活菌數(shù)呈正相關(guān)，即BCG 制品誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平隨活菌數(shù)增多而上升。

綜上所述，本研究證實了BCG 活菌數(shù)與其誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平具有相關(guān)性，與傳統(tǒng)的PPD 試驗相比，本研究采用的ELISPOT 法可更精確地評價BCG的效力，但細(xì)胞實驗對試驗設(shè)備、試劑、耗材及時間等要求高于傳統(tǒng)的PPD 實驗。因此，兩種方法的優(yōu)劣與質(zhì)控適應(yīng)性之間的權(quán)衡尚需進一步探討。