王嘉琪，彭浩然，何燕華，趙蘭娟，任浩，王文，戚中田，趙平，唐海琳

海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系生物醫(yī)學(xué)防護教研室上海市醫(yī)學(xué)生物防護重點實驗室，上海 200433

基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）屬于披膜病毒科甲病毒屬，是單股正鏈RNA 病毒，基因組全長約12 000 bp，是我國重要的輸入性傳染病病原體。CHIKV 最早于1953 年從非洲坦桑尼亞一位發(fā)熱患者標本中分離得到［1］，主要通過蚊媒傳播。CHIKV 包括西非（West African）、東中南非（Eastern-Central-Southern African，ECSA）和亞洲（Asian）型3 種亞型，其中 ECSA 型 CHIKV 在 2005 年出現(xiàn)印度洋型分支（Indian Ocean Lineage，IOL）［2］。西非型CHIKV 主要在西非地區(qū)小規(guī)模流行，對人類危害小。ECSA 型CHIKV 在2004 年以前主要在東非、中非及南非地區(qū)流行，2004 年從肯尼亞傳入印度洋法屬留尼汪島（Reunion island），并導(dǎo)致有史以來規(guī)模最大的一次暴發(fā)，病例超過26. 6 萬例［3］；在該次大暴發(fā)中，CHIKV 基因發(fā)生突變，傳播能力增強，2005年12 月擴散至印度及東南亞國家，造成印度超過100 萬人感染［4］；2014 年繼續(xù)擴散至南美巴西［5］，當(dāng)前仍在印度、東南亞、歐洲及南美等國家或地區(qū)流行［6-9］。亞洲型CHIKV 在1954 年首次發(fā)現(xiàn)于菲律賓并一直在東南亞國家流行，2013 年擴散至加勒比海地區(qū)，在中美洲大暴發(fā)，病例超過137. 9 萬［10］。近年來，我國福建、浙江等地持續(xù)發(fā)生輸入性病例，并導(dǎo)致本地病例［11-14］。

CHIKV 感染的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、皮疹等，嚴重者發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有嚴重后遺癥，甚至死亡［15-16］，目前國際上尚無特效藥和疫苗。滅活疫苗技術(shù)成熟，安全性高，是疫苗研發(fā)優(yōu)先選擇的技術(shù)。滅活疫苗研發(fā)成功的前提是能夠進行大規(guī)模病毒生產(chǎn)以及滅活病毒具有足夠的免疫原性和保護效果。本文對無血清條件下CHIKV 的培養(yǎng)及其滅活病毒在小鼠模型上的保護效果進行研究。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 60 只同系雌性清潔級 C57BL ／ 6 小鼠，6 周齡，體重16 ~ 18 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（蘇）-2018-0008。置生物安全三級實驗室（P3 實驗室）培育。本實驗均以科研為目的進行對小鼠養(yǎng)殖和使用，符合國家動物倫理規(guī)定。

1. 2 病毒及細胞 感染性克隆Ross 毒株（AF49-0259）和 LR2006 毒株（EU224268）由本實驗室構(gòu)建［17］。Ross 毒株是 1953 年最早分離的毒株，將其滴鼻接種小鼠能導(dǎo)致小鼠發(fā)病，用于CHIKV 疫苗和藥物作用評價。LR2006 毒株引起2005 年印度洋地區(qū)大流行，用于滅活病毒制備。所有操作均在P3 實驗室進行。Vero 細胞購自上海富衡生物科技有限公司（編號：FH0374）。

1. 3 主要試劑及儀器 VP-SFM 和DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國 Gibico 公司；RNA 抽提試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScrip RT reagent Kit）和SYBR Premix Ex Taq 購自日本 TaKaRa 公司；鼠多抗CHIKV E1 和鼠抗GAPDH 購自美國RD 公司；兔多抗CHIKV E2 購自中國愛博泰克（Abclonal）生物科技有限公司；HRP 標記的兔抗IgG、鼠抗IgG 以及Alexa Fluor?488 標記的山羊抗小鼠 IgG 購自美國Invitrogen 公司；甲醛購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；β-丙內(nèi)酯、氫氧化鋁佐劑、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒和RIPA 裂解緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；全自動細胞成像及分析系統(tǒng)購自美國BioTek公司；300 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems 公司。

1. 4 Vero 細胞在含或無血清條件下的培養(yǎng) VP-SFM使用前添加2 mmol ／ L L-谷氨酰胺。完全DMEM 培養(yǎng)基為含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，另添加非必需氨基酸、100 U ／ mL 青鏈霉素雙抗和 2 mmol ／ L L-谷氨酰胺。用完全DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero 細胞，至細胞約90%匯合時，經(jīng)0. 05%胰酶消化細胞，按2 × 105個接種 T75 細胞培養(yǎng)瓶，分別用 VP-SFM 和完全DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃和5% CO2孵箱中培養(yǎng)，24、48 和 72 h 后進行細胞計數(shù)，重復(fù) 3 次。

1. 5 CHIKV 在Vero 細胞上的增殖培養(yǎng)及病毒滅活條件的確定 將Vero 細胞按1 × 104個接種T75 細胞培養(yǎng)瓶，待細胞在VP-SFM 中生長48 h 密度約達90%時，將 CHIKV 按 0. 1 MOI 感染細胞，置 37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)48 h，待細胞病變達70%時收集病毒上清，用直徑0. 22 μm 過濾器過濾細胞殘渣，-80 ℃待用。使用空斑法檢測病毒滴度，然后分別采用不同濃度（0. 025%、0. 0125%）β-丙內(nèi)酯滅活病毒不同時間（24、48 h），確定合適的滅活時間和濃度。采用0. 025%甲醛滅活21 d，再用3. 75%焦亞硫酸鈉 1 ∶100 中和甲醛［18］。β-丙內(nèi)酯在疫苗液體中完全水解，未進行殘留處理。以未經(jīng)滅活的CHIKV 作為對照組。

1. 6 含血清或無血清條件下Vero 細胞擴增CHIKV效果的比較 將CHIKV LR2006 毒株以0. 1、0. 01和0. 001 MOI 感染 Vero 細胞，在 VP-SFM 和完全DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24、48 和 72 h 后，分別收集病毒上清，空斑法檢測病毒滴度。

1. 7 空斑法檢測病毒滴度 將不同條件下擴增的CHIKV 以 1 ∶10 稀釋 8 個梯度，各取 200 μL 加至預(yù)先種滿Vero 細胞的24 孔板上，37 ℃孵育2 h；棄病毒液，加入含4%羧甲基纖維素鈉覆蓋液，1 mL ／ 孔，37 ℃培養(yǎng)72 h；棄覆蓋液，4%甲醛結(jié)晶紫染色，干燥后計數(shù)。

1. 8 β-丙內(nèi)酯和甲醛滅活CHIKV 的活性及抗原性檢測 將0. 025% β-丙內(nèi)酯滅活48 h 和0. 025%甲醛滅活21 d 的CHIKV 接種Vero 細胞。免疫熒光法檢測病毒活性：感染 18 h 后，用甲醇于-20 ℃固定細胞 30 min；3% BSA 室溫封閉2 h；加入鼠多抗CHIKV E1（1 ∶8 400 稀釋），4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌3 次，加入抗兔Alexa Fluor?488 標記的山羊抗小鼠IgG（1 ∶1 500 稀釋），避光孵育 1. 5 h；用 DAPI 染細胞核15 min；PBS 洗滌1 次，全自動細胞成像及分析系統(tǒng)下觀察。Western blot 法檢測抗原性：將甲醛、β-丙內(nèi)酯滅活病毒及對照病毒液分別加入RIPA 細胞裂解液，經(jīng)15% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)至 PVDF膜，分別加入鼠多抗CHIKV E1、鼠抗GAPDH 和兔多抗 CHIKV E2（分別 1 ∶1 000、1 ∶3 000 和 1 ∶1 000稀釋），室溫搖床孵育 2 h；PBS-T 洗滌 3 次，加入HRP 標記的兔抗 IgG 和鼠抗 IgG（均 1 ∶5 000 稀釋），室溫搖床 1 h；PBS-T 洗滌 3 次，加入 ECL 顯色后，用化學(xué)發(fā)光儀進行檢測。以未經(jīng)滅活處理的CHIKV作為對照組。

1. 9 小鼠免疫及抗體中和試驗 分別將甲醛、β-丙內(nèi)酯滅活病毒（2 × 107PFU ／ mL）與等體積 2%明礬［Al（OH）3］混合，室溫 1 h；皮下接種至 6 周齡C57BL ／ 6 雌性小鼠，1 mL ／ 只，共 15 只，為試驗組，第1 次免疫14 d 后進行相同劑量的第2 次加強免疫?？瞻捉M為PBS 與等體積2%明礬混合，其他同試驗組。免疫小鼠第28 天經(jīng)眼球采血，分離血清，與500 PFU CHIKV 按 1 ∶80、1 ∶160、1 ∶320、1 ∶640、1 ∶1 280 和 1 ∶25 60 比例混合，37 ℃孵育 1 h；加至預(yù)先接種Vero 細胞的96 孔板中，每個梯度3 個復(fù)孔，37 ℃孵育 18 h；甲醇固定，加入兔抗 CHIKV E1（1 ∶8 400 稀釋），100 μL ／ 孔；加入 Alexa Fluor?488 標記的山羊抗小鼠 IgG（1 ∶1 500 稀釋），100 μL ／ 孔，避光孵育 1. 5 h；加入DAPI，利用全自動細胞成像及分析系統(tǒng)進行免疫熒光檢測，對每個孔進行熒光計數(shù)，每個混合濃度重復(fù)3 孔。對照組為500 PFU CHIKV 與免疫 PBS 小鼠血清 1 ∶80 混合。

1. 10 兩種滅活病毒對小鼠攻毒免疫效果的評價免疫后28 d，用異氟烷麻醉小鼠，滴鼻接種CHIKV Ross 毒株，劑量為 106PFU ／ 只，以未免疫小鼠作為對照組。接種當(dāng)天及接種后每天稱量小鼠體重，并在第6 天處死小鼠，取小鼠腦組織，采用組織研磨器將腦組織研磨充分。qPCR 法檢測腦組織中CHIKV載量：用TRIzol 提取樣本RNA，酶標儀檢測RNA 濃度和純度，按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒方法在7300 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)進行擴增。CHIKV 上游引物：5′-ACGCARTTGAGCGAAGCAC-3′，下游引物：5′-CTGAAGACATTGGYCCCAC-5′；內(nèi)參 GAPDH上游引物：5′-ATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTT-3′，下游引物 5′-TGGCAGTGATGGCATGGACTGTGGT-3′。引物由Invitrogen 公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共 40 個循環(huán)。不接種Ross 毒株小鼠作為空白組。

1. 11 小鼠腦組織病理檢測 取石蠟包埋的小鼠腦組織切片，HE 染色。DHISTECH PANNORAMIC 全景切片掃描儀拍照觀察組織形態(tài)變化。

1. 12 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 7 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異比較采用異方差雙尾t 檢驗分析，RT-qPCR 定量值統(tǒng)計學(xué)差異分析前經(jīng)取對數(shù)處理。多組間比較采用One-way ANOVA 檢驗。以P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 Vero 細胞無血清培養(yǎng)的傳代穩(wěn)定性 Vero 細胞在VP-SFM 中培養(yǎng)至第4 和5 天，細胞變圓、聚集，部分漂?。粚⑵〖毎^續(xù)傳代，細胞貼壁生長，3 d 后開始懸浮；繼續(xù)傳代3 次，細胞貼壁生長，不再懸??；連續(xù)傳至20 代，細胞形態(tài)在無血清和含血清培養(yǎng)基中無明顯差異。見圖1。VP-SFM 培養(yǎng)的Vero 細胞保持對數(shù)生長，72 h 細胞計數(shù)顯示，無血清培養(yǎng)較含血清培養(yǎng)生長慢（t = 8. 222，P < 0. 01），見圖2。

圖1 Vero 細胞在VP-SFM 和完全DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)形態(tài)的顯微鏡觀察（× 20）Fig. 1 Microscopy of morphology of Vero cells in VP-SFM and complete DMEM media（× 20）

圖2 VP-SFM 和完全DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Vero細胞的生長曲線Fig. 2 Growth curve of Vero cells in VP-SFM and complete DMEM media

2.2 β-丙內(nèi)酯和甲醛CHIKV 滅活效果 滅活24 h，0. 025%和0. 0125% β-丙內(nèi)酯均能檢出活病毒；滅活 48 h，0. 0125% β-丙內(nèi)酯能檢測出活病毒，而0. 025% β-丙內(nèi)酯未檢出活病毒；0. 025%甲醛滅活21 d 未檢出活病毒。見圖3。

圖3 β-丙內(nèi)酯和甲醛滅活CHIKV 的活性Fig. 3 Activity of CHIKV inactivated with β-propionolactone and formaldehyde

2. 3 含或無血清條件下Vero 細胞擴增CHIKV效果 在不同MOI 條件下，兩種培養(yǎng)基中Vero 細胞擴增CHIKV 的滴度均能達到108FPU ／ mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0. 86，P > 0. 05），相同代次的 Vero細胞在完全DMEM 培養(yǎng)基中更早出現(xiàn)病變，病毒擴增更快。見圖4 和圖5。

圖4 感染48 h 的 Vero 細胞中CHIKV 的擴增效果（× 4）Fig. 4 Propagation of CHIKV in Vero cells 48 h after infection（× 4）

圖5 CHIKV LR2006 毒株在Vero 細胞中的生長曲線Fig. 5 Growth curve of CHIKV LR2006 strain in Vero cells

2. 4 β-丙內(nèi)酯和甲醛滅活CHIKV 的活性及抗原性 0. 025% β-丙內(nèi)酯滅活48 h 和0. 025%甲醛滅活21 d 的CHIKV 接種Vero 細胞，未觀察到細胞病變，也未觀察到熒光，見圖6。Western blot 分析顯示，0. 025%甲醛滅活 21 d CHIKV 檢測出E1 和E2 蛋白，而 0. 025% β-丙內(nèi)酯滅活 48 h CHIKV 結(jié)構(gòu)蛋白含量較低，見圖7。為了比較兩種滅活方式作用效果，后續(xù)采用0. 025% β-丙內(nèi)酯滅活48 h 病毒和0. 025%甲醛滅活21 d 病毒進行小鼠免疫。

圖6 免疫熒光法檢測β-丙內(nèi)酯和甲醛滅活CHIKV 的活性（× 4）Fig. 6 IFA of activity of CHIKV inactivated with β-propionolactone and formaldehyde（× 4）

圖7 β-丙內(nèi)酯和甲醛滅活 CHIKV E1 和 E2 抗原的Western blot 分析Fig. 7 Western blotting of E1 and E2 antigens of CHIKV inactivated with β-propionolactone and formaldehyde

2. 5 免疫小鼠血清抗體中和效果 甲醛和β-丙內(nèi)酯滅活試驗組小鼠血清熒光數(shù)顯著少于對照組（F分別為 61. 78 和 34. 62，P 均 < 0. 001），有顯著中和效果。血清與 CHIKV 1︰80、1︰160、1︰320、1︰640和1︰1 280 混合的甲醛滅活試驗組小鼠血清熒光數(shù)小于對應(yīng)的β-丙內(nèi)酯滅活試驗組（t = 7. 787，P均 < 0. 001）。見圖8。

圖8 甲醛（A）和β-丙內(nèi)酯（B）滅活CHIKV 免疫小鼠血清抗體中和試驗Fig. 8 Neutralization test of serum antibody in mice immunized with CHIKV inactivated with β-propionolactone （A） and formaldehyde（B）

2. 6 滅活CHIKV 對小鼠的保護效果 對照組小鼠接種CHIKV Ross 毒株第6 天體重平均下降13.98%，甲醛和β-丙內(nèi)酯滅活試驗組小鼠體重未下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別為 18.51 和 8.461，P<0.001）。qPCR 法檢測結(jié)果顯示，空白組、甲醛滅活試驗組和β-丙內(nèi)酯滅活試驗組小鼠腦組織中CHIKV 相對定量值顯著低于對照組（t 分別為13.12、14.38 和7.210，P 均< 0. 01）。見圖9。小鼠腦組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，對照組小鼠腦組織存在嚴重炎性細胞浸潤，β-丙內(nèi)酯和甲醛組滅活試驗組不明顯，見圖10。

圖9 β-丙內(nèi)酯和甲醛滅活CHIKV 對小鼠的保護作用Fig. 9 Protective effect of CHIKV inactivated with β-propionolactone and formaldehyde on mice

圖10 小鼠腦組織病理檢測（× 20）Fig. 10 Pathological examination of mouse brain tissue（× 20）

3 討 論

近年我國跟非洲、南亞等地交流愈加頻繁，而CHIKV 在非洲、南亞等地區(qū)高發(fā)，輸入病例一直呈高位狀態(tài)。2017 年9 月浙江衢州出現(xiàn)由輸入性病例引發(fā)的本土病例，共確診4 例，后因及時處置，疫情得到控制［13］，2019 年9—11 月由緬甸輸入云南的病例導(dǎo)致出現(xiàn)97 例本地病例［19］，河南、湖南等多個省市也出現(xiàn)首例輸入病例［20-21］。早期CHIKV 主要發(fā)生在非洲等經(jīng)濟相對落后地區(qū)，疫苗研究未受到足夠重視，隨著CHIKV 全球擴散，疫苗研究正受到廣泛關(guān)注［6，22］。

滅活疫苗技術(shù)相對減毒、重組疫苗等其他技術(shù)相對成熟，是首要考慮的技術(shù)路線。滅活疫苗研發(fā)過程包括病毒培養(yǎng)、純化、滅活和免疫原性、動物安全性、有效性評價，以及臨床試驗等多個環(huán)節(jié)。本研究重點關(guān)注病毒培養(yǎng)及滅活病毒對動物的保護效果。病毒在無血清培養(yǎng)基中復(fù)制，不含污染性血清蛋白，制備出的疫苗也不含任何動物源性潛在病原體，是滅活疫苗制備的發(fā)展方向。本研究首先比較含血清和無血清培養(yǎng)條件下CHIKV 擴增滴度，結(jié)果顯示，CHIKV 在無血清培養(yǎng)基中經(jīng)過48 ~ 72 h 復(fù)制，病毒滴度達到峰值（108PFU ／ mL），與含血清培養(yǎng)基中病毒滴度峰值無顯著差別，可進行病毒的大量擴增。

甲醛和β-丙內(nèi)酯是成熟的滅活劑，但不同病毒經(jīng)過兩種滅活劑滅活后是否仍然能夠保持抗原性尚不確定。本研究分別采用甲醛和β-丙內(nèi)酯滅活病毒，用氫氧化鋁作為佐劑，兩次皮下注射成年C57BL／6 小鼠，28 d 后用 20 倍最低致死劑量 CHIKV 對免疫后小鼠進行攻毒，結(jié)果顯示，免疫后小鼠發(fā)病不明顯，表明兩種滅活病毒均能有效誘導(dǎo)抗體，保護小鼠免受CHIKV 感染。在本研究的實驗條件下，甲醛滅活 CHIKV E1 和E2 蛋白抗原性比β-丙內(nèi)酯滅活CHIKV 強，免疫后小鼠可誘導(dǎo)出更強的中和抗體。

病毒大量擴增及滅活病毒在小鼠模型上具有保護效果是CHIKV 滅活疫苗研發(fā)的前提。除此之外，未來還需在病毒純化方法、免疫原性評價、安全性評價以及非人靈長類動物相關(guān)試驗等方面開展研究。