劉亞月，薛欣怡，黎卓怡，馬小翔，梁金月，胡雪瓊，張 翼,2,3

化學(xué)誘導(dǎo)對(duì)2株海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性的影響

劉亞月1,3，薛欣怡1，黎卓怡1，馬小翔1，梁金月1，胡雪瓊1,3，張 翼1,2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室//廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心//水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//湛江市腦健康海洋藥物與營養(yǎng)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院海洋醫(yī)藥研發(fā)中心, 廣東 深圳 518120；3. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 大連工業(yè)大學(xué), 遼寧 大連 116034）

【目的】以2株海洋真菌為研究對(duì)象，探究不同種類及濃度的化學(xué)表觀遺傳修飾劑對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性和生物活性的影響。【方法】基于化學(xué)表觀遺傳修飾策略，采用兩種不同的化學(xué)表觀遺傳修飾劑5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azaC)和丁酸鈉，分別對(duì)sp. 019和ZN4-5-4兩株海洋來源真菌進(jìn)行表觀遺傳修飾。通過觀察真菌在培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)變化，并根據(jù)薄層層析(TLC)指紋圖譜、高效液相色譜(HPLC)圖譜、乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH)自由基清除和鹵蟲致死活性篩選模型等技術(shù)手段，從中篩選出代謝產(chǎn)物豐富、AChE抑制活性與抗氧化活性產(chǎn)物豐富且毒性小的發(fā)酵培養(yǎng)條件?！窘Y(jié)果】添加1 mmol/mL的丁酸鈉誘導(dǎo)劑可使菌株019和ZN4-5-4的次生代謝產(chǎn)物的種類增加，且同時(shí)能提高該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE的抑制活性和DPPH自由基清除活性。因此，確定菌株019和ZN4-5-4的最優(yōu)發(fā)酵條件均是添加濃度為1 mmol/mL丁酸鈉的PDB培養(yǎng)基?！窘Y(jié)論】化學(xué)表觀遺傳修飾策略指導(dǎo)下，添加誘導(dǎo)劑5-azaC或者丁酸鈉對(duì)2株海洋真菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有影響。

海洋真菌；化學(xué)誘導(dǎo)；乙酰膽堿酯酶抑制活性；抗氧化；鹵蟲致死活性

海洋真菌作為海洋生物類群的重要組成部分，其次生代謝產(chǎn)物具有多樣的結(jié)構(gòu)類型和顯著的藥理活性，已成為海洋天然藥物研究重要生物資源和研究熱點(diǎn)[1]。海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物分離得到的新化合物多具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌活性和抗心腦血管疾病、抗氧化、酶抑制劑等顯著的藥理活性[2]。從中分離得到二蓖麻酚單醚化合物，其中化合物versiorcinols A顯示中等強(qiáng)度的抑菌活性[3]。從海洋藻類內(nèi)生真菌EH 399中分離獲得六個(gè)化合物均對(duì)大腸桿菌、黃褐微球菌和哈維弧菌顯示一定的抗菌活性，其中cladosporol H對(duì)A549、Huh7和LM3細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，cladosporol C則對(duì)H446細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性[4]。但是現(xiàn)有的研究只涉及海洋天然資源中的一小部分。海洋中大量的微生物，尤其是內(nèi)生微生物中活性先導(dǎo)化合物的篩選工作尚少，具有巨大的開發(fā)潛力?；瘜W(xué)表觀遺傳修飾是指通過添加一些小分子的化學(xué)表觀遺傳修飾劑，特異性地改變化學(xué)表觀遺傳修飾酶的活性，激活某些未表達(dá)次生代謝產(chǎn)物的沉默基因簇，誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)骨架或生物活性更豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，真菌中存在大量編碼化合物的基因，目前從中分離得到的化合物數(shù)量遠(yuǎn)少于真菌擁有的這些基因所能編碼的化合物數(shù)量，這證明其中很多基因都處于沉默狀態(tài)。激活沉默基因，可以使微生物表達(dá)出新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，增加微生物的化學(xué)多樣性，從而有可能產(chǎn)生數(shù)量更多、結(jié)構(gòu)類型更豐富的代謝產(chǎn)物，對(duì)進(jìn)一步研究海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重要意義[7-9]?；瘜W(xué)表觀遺傳修飾是目前激活沉默基因表達(dá)的有效方法之一，具有成本低、效率高和易操作等優(yōu)點(diǎn)。既可應(yīng)用于模式真菌的研究，也可以用于修飾遺傳背景不清楚的真菌，不受實(shí)驗(yàn)條件限制，能夠在大部分實(shí)驗(yàn)室中完成[6]。

本研究中以2株海洋真菌為研究對(duì)象，探究不同種類及濃度的化學(xué)表觀遺傳修飾劑對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性和生物活性的影響。分別選用丁酸鈉和5-azaC作為誘導(dǎo)劑對(duì)兩株海洋真菌進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)調(diào)控，選出各菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富、抗AD相關(guān)活性明顯且毒性小的最優(yōu)發(fā)酵條件，以期為后續(xù)深入挖掘2株真菌的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 海洋真菌sp. 019采集于湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)的紅樹植物楊葉肖槿()，經(jīng)ITS rDNA全序列分析確定為青霉菌(Genbank登錄號(hào)：MN826202)；海洋真菌ZN4-5-4 (簡稱：ZN)則是采集于瓊州海峽的沉積泥，經(jīng)ITS rDNA全序列分析確定為曲霉菌(Genbank登錄號(hào)：MN826203)。目前兩株真菌菌株均保存于廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDB培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，海鹽3 g，加入純水至1 L，于1×105Pa滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：誘導(dǎo)劑5-azaC和丁酸鈉分別配成5個(gè)濃度梯度的貯液（250 mmol/L、25 mmol/L、250 μmol/L、25 μmol/L、2.5 μmol/L）。其中5-azaC用DMSO溶解，丁酸鈉用無菌水溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜除菌后待用。AChE (C3389)、碘代硫代乙酰膽堿 (Acetylthiocholine iodide, ATCI，DA0048)、牛血清蛋白 (Bovine serum albumin, BSA，A1933)、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH，D9132)，均購自Sigma-Aldrich；5, 5′-二硫代二硝基苯甲酸 (Dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB，D8130)，購自Ruibio公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器：GF254硅膠高效薄層層析板購自德國默克公司。鹽水蝦幼蟲卵購自中國愛家水族館。1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Epoch2酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BüChi公司；多功能紫外透射儀WFH-201B，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株誘導(dǎo)前種子的制備 將待誘導(dǎo)的兩株海洋真菌放進(jìn)28 ℃、濕度為80%的霉菌培養(yǎng)箱中活化過夜；在無菌條件下，將菌種接種到預(yù)先裝有15 mL滅菌馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基的平板中；于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待菌落孢子生長茂盛備用。

1.2.2 菌株的化學(xué)誘導(dǎo) 將上述培養(yǎng)好的菌株用0.85%的無菌生理鹽水洗滌、搖勻，形成孢子懸液。采用12孔板，每孔加入2 mL PDB培養(yǎng)基和200 μL孢子懸液，28 ℃培養(yǎng)3 d后，分別加入化學(xué)誘導(dǎo)劑，并設(shè)置5個(gè)誘導(dǎo)劑終濃度梯度 (10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L和1 μmol/L)，每組設(shè)置2個(gè)平行；將12孔板置于28 ℃、濕度為80%的霉菌培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d，觀察菌株生長狀態(tài)的變化并拍照記錄。

1.2.3 菌株次生代謝產(chǎn)物的提取 從12孔板中取出菌絲體和發(fā)酵液，3 000 r/min離心、濃縮干燥4 h，加入200 μL甲醇，功率500 W超聲提取30 min，10 000 r/min離心30 min，取出上清液備用。減壓濃縮、干燥、稱量，得到粗提取物的質(zhì)量(mg)。

1.2.4 菌株次生代謝產(chǎn)物的TLC和HPLC圖像分析 將上述獲得的各粗提物用甲醇統(tǒng)一配制成10 mg/mL的濃縮液，分別采用GF254TLC硅膠薄層層析板和HPLC對(duì)各粗提物的化學(xué)多樣性進(jìn)行分析。選擇氯仿(CHCl3)：甲醇(MO)= 7∶1 (∶)二元溶劑體系作為TLC分析的展開劑，分別記錄254和365 nm波長下代謝產(chǎn)物的紫外圖像。HPLC分析中，進(jìn)樣量為10 μL，洗脫條件為：0 ～ 15 min，50% ～ 100% 的甲醇-水；15 ～ 25 min，100%甲醇； 25 ～ 27 min，100% ～ 50% 的甲醇-水；27 ～ 30 min，50%的甲醇-水，流速0.6 mL/min。DAD檢測器信號(hào)采集波長為190 ～ 400 nm，檢測波長為254 nm。

1.2.5 菌株次生代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性測定

通過優(yōu)化的Ellman’s比色法[10]測定粗提物對(duì)AChE的體外抑制活性。

初篩：往96孔板中每孔加100 μL用甲醇溶解的質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣品，等待樣品中有機(jī)溶劑揮干。再依次往96孔板中每孔加入1 μL的DMSO，49 μL PBS、10 μL 0.2 U/mL AChE和20 μL DTNB，將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱保溫10 min。然后往每個(gè)孔加入20 μL ATCh，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)箱孵育。20 min后，通過酶標(biāo)儀測定405nm 處的光密度值405nm，鹽酸化多奈哌齊作為陽性對(duì)照[11]。通過下述公式計(jì)算化合物對(duì)AChE的抑制率。

抑制率=[（control?blank）?（sample?sample blank）]/（control?blank）。 （1）

其中sample blank為加入樣品和BSA，但不加入AChE的光密度，sample為加入樣品和AChE的光密度，control為加入AChE但不加入樣品的光密度，blank為加入BSA但不加入樣品和AChE的光密度。

復(fù)篩：經(jīng)上述初篩后，選擇AChE抑制率大于50%的樣品進(jìn)行活性復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。采用倍半梯度稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后，按照上述方法測定各粗提物的IC50值，IC50值是化合物對(duì)AChE抑制為50%所對(duì)應(yīng)的濃度。將抑制率和濃度對(duì)數(shù) (lnC)導(dǎo)入Origin 9.1軟件。通過三次多項(xiàng)式回歸方程擬合得到濃度對(duì)數(shù)曲線，并計(jì)算得到ln(IC50)。最后使用Microsoft Excel計(jì)算得到IC50。

1.2.6 菌株次生代謝產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性測定 使用Sharma和Bhat[12]描述的DPPH自由基清除法，在96孔板中測定粗提物的抗氧化能力。

初篩：總反應(yīng)體系為100 μL，sample為含有50 μL的0.16 mmol/L DPPH和50 μL溶解濃度為5 mg/mL粗提物的DMSO。與此同時(shí)，50 μL 0.16 mmol/L DPPH和50 μL DMSO用作對(duì)照(control)，50 μL MeOH和50 μL溶解不同濃度化合物的DMSO作為樣品本底(sample blank)，50 μL MeOH和50L DMSO 作為對(duì)照(blank)，將96孔板放置在暗處30 min。通過酶標(biāo)儀測定λ517nm處的光密度517nm。維生素C作為陽性對(duì)照[13]。通過下述公式計(jì)算化合物的清除率。

清除率= [（control?blank）?（sample?sample blank）]/（control?blank）。 （2）

復(fù)篩：經(jīng)上述初篩后，選擇DPPH自由基清除率大于50%的樣品進(jìn)行活性復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。采用倍半梯度稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后，按照上述方法測定各粗提物的EC50值，EC50值是化合物對(duì)DPPH自由基清除率為50%所對(duì)應(yīng)的濃度。將清除率和濃度對(duì)數(shù) (lnC)導(dǎo)入Origin 9.1軟件。通過三次多項(xiàng)式回歸方程擬合得到濃度對(duì)數(shù)曲線，并計(jì)算得到ln (EC50)。最后使用Microsoft Excel計(jì)算得到EC50。

1.2.7 菌株次生代謝產(chǎn)物的鹵蟲致死活性測定[14]采用96孔板法，使用鹽水蝦幼蟲測試化合物的致死能力。每孔加199 μL含鹵蟲幼體的溶液（每孔約含20只鹵蟲），制成測試培養(yǎng)板。將粗提物用DMSO配制成10 mg/mL的溶液，加入1 μL到每個(gè)培養(yǎng)板孔中，每個(gè)粗提物樣品設(shè)置成50 μg/mL終濃度，設(shè)3個(gè)平行樣。在28 ℃的培養(yǎng)箱中保持光照培養(yǎng)24 h后，記錄每個(gè)孔中死亡幼蟲的數(shù)量和總數(shù)。同時(shí)，用DMSO和秋水仙堿[15]分別作為陰性和陽性對(duì)照。鹵蟲致死活性采用鹵蟲致死率表示：

鹵蟲致死率= [(加藥組致死率-對(duì)照組致死率)/對(duì)照組存活率]。 （3）

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株誘導(dǎo)前后表觀形態(tài)對(duì)比

采用12孔板對(duì)2株海洋真菌進(jìn)行微量培養(yǎng)，結(jié)果如圖1所示。添加誘導(dǎo)劑5-azaC進(jìn)行誘導(dǎo)前后，菌株019和ZN的表觀生長形態(tài)相比空白組均發(fā)生了顯著變化。如圖1(B1)所示，添加誘導(dǎo)劑5-azaC進(jìn)行誘導(dǎo)前后，菌株019的菌絲體由黑褐色變成棕色，菌液變?yōu)辄S色。并且隨著誘導(dǎo)劑濃度增加，菌液顏色逐步加深。菌株ZN的菌絲體則由棕色變成白色，菌液變?yōu)榱咙S色（圖1(C1)）。由此可以推斷，誘導(dǎo)劑5-azaC的加入對(duì)菌株019和ZN的次生代謝產(chǎn)物可能產(chǎn)生了影響。而添加丁酸鈉進(jìn)行誘導(dǎo)前后，2株菌株的菌絲體顏色雖未表現(xiàn)出明顯變化，但菌絲體厚度和菌液顏色深淺隨著加入誘導(dǎo)劑濃度不同也表現(xiàn)出一定變化。

B1、B2、C1和C2分別代表菌株019和ZN在添加化學(xué)誘導(dǎo)劑5-azaC和丁酸鈉的PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d生長形態(tài)；依次是B1為019添加5-azaC，B2為019添加丁酸鈉，C1為ZN添加 5-azaC，C2為ZN添加丁酸鈉；12孔板中每個(gè)孔添加的誘導(dǎo)劑濃度如圖A所示

2.2 菌株誘導(dǎo)前后次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量分析對(duì)比

微量培養(yǎng)14 d后，用甲醇對(duì)2株菌株的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)前后，2株菌株的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量均發(fā)生了相應(yīng)變化。以菌株019為例，在添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)后，菌株次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量明顯增加；尤其是在添加誘導(dǎo)劑5-azaC濃度為10 μmol/L和1 μmol/L的PDB培養(yǎng)基條件下的產(chǎn)量增加顯著 (0.000 1)，大于同等濃度下添加誘導(dǎo)劑丁酸鈉誘導(dǎo)后的產(chǎn)量。菌株ZN則是隨誘導(dǎo)劑加入，代謝產(chǎn)物質(zhì)量逐漸增加，當(dāng)添加濃度為10 μmol/L 5-azaC的PDB培養(yǎng)基條件下的產(chǎn)量增加最明顯。但是隨著添加誘導(dǎo)劑5-azaC濃度進(jìn)一步增大，次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量卻明顯下降?？赏茰y高濃度的誘導(dǎo)劑5-azaC的加入對(duì)菌株ZN的代謝產(chǎn)生了抑制作用。

2.3 菌株誘導(dǎo)前后次級(jí)代謝產(chǎn)物的TLC和HPLC圖像分析對(duì)比

利用TLC和HPLC對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)前后不同菌株的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)：對(duì)菌株019而言，觀察其TLC圖像可知，5-azaC誘導(dǎo)組 (1 μmol/L除外)相比對(duì)照組的代謝產(chǎn)物在波長254 nm和365 nm下吸收斑點(diǎn)明顯不同（圖3(B1)）；丁酸鈉誘導(dǎo)組相比對(duì)照組的代謝產(chǎn)物沒有明顯區(qū)別，但是在添加誘導(dǎo)劑濃度為100 μmol/L時(shí)，其主產(chǎn)物吸收斑點(diǎn)的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這意味著在該培養(yǎng)條件下，菌株019代謝某些化合物的能力增強(qiáng)（圖3(B2)）。進(jìn)一步觀察其HPLC圖像可知，在254 nm波長下添加不同濃度的5-azaC誘導(dǎo)組相比對(duì)照組的吸收峰明顯增多（圖4(B1)）；而低濃度丁酸鈉誘導(dǎo)組相比對(duì)照組的代謝產(chǎn)物主吸收峰沒有明顯區(qū)別，但是隨著添加誘導(dǎo)劑濃度增大，在濃度為10 mmol/L和1 mmol/L時(shí)，其吸收峰的個(gè)數(shù)明顯增多，這意味著誘導(dǎo)劑的加入明顯改變了菌株019的次生代謝產(chǎn)物，菌株的代謝產(chǎn)物更豐富（圖4(B2)）。而對(duì)菌株ZN而言，觀察其TLC圖像可知，高濃度的5-azaC誘導(dǎo)組和丁酸鈉誘導(dǎo)組相比對(duì)照組的代謝產(chǎn)物在波長254 nm和365 nm下吸收斑點(diǎn)都有所增加（圖3(C1、C2)）。進(jìn)一步分析其HPLC圖像可得出相同結(jié)論，在添加誘導(dǎo)劑濃度為1 μmol/L和10 μmol/L時(shí)，不管是添加5-azaC還是丁酸鈉，菌株代謝產(chǎn)物均沒有明顯變化。但隨著添加誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)一步增大，菌株的吸收峰明顯增多，部分代謝產(chǎn)物的峰吸收強(qiáng)度也有一定增強(qiáng)（圖4(C1、C2)）。這表明對(duì)菌株ZN而言，高濃度誘導(dǎo)劑的加入更能刺激菌株次生代謝產(chǎn)物的變化。由此推測，在以上特定誘導(dǎo)條件下，菌株可能產(chǎn)生了新的代謝產(chǎn)物。

樣品的編號(hào)為xxx-y-z，xxx代表菌株編號(hào)簡稱；y代表添加誘導(dǎo)劑的類型，1代表添加誘導(dǎo)劑5-azaC，2代表添加誘導(dǎo)劑丁酸鈉，z代表添加誘導(dǎo)劑濃度，1-6分別表示10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、空白; “****”表示與空白組比較，P < 0.0001

2.4 菌株誘導(dǎo)前后次級(jí)代謝產(chǎn)物生物活性分析對(duì)比

各菌株粗提物的AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性如圖5。對(duì)菌株019而言，無論是添加誘導(dǎo)劑5-azaC或丁酸鈉誘導(dǎo)后，菌株次生代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性均明顯增強(qiáng)。尤其是添加誘導(dǎo)劑5-azaC誘導(dǎo)后，其代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性均大于40%，其中添加濃度為1 mmol/L的5-azaC誘導(dǎo)組菌株次生代謝產(chǎn)物的AChE抑制率高達(dá) 96.4%，而空白組不顯示抑制活性。添加誘導(dǎo)劑丁酸鈉(1 mmol/L)誘導(dǎo)后，其菌株次生代謝產(chǎn)物的AChE抑制率為95.6%，但其鹵蟲致死率也高達(dá)63.6%。對(duì)菌株ZN而言，添加誘導(dǎo)劑5-azaC誘導(dǎo)后，菌株次生代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性相比對(duì)照組明顯減弱甚至消失；同時(shí)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲致死活性有所增強(qiáng)(濃度為10 μmol/L時(shí)，抑制率為60.0%)；而添加誘導(dǎo)劑丁酸鈉(10 mmol/L、1 mmol/L和100 μmol/L)誘導(dǎo)后，菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性明顯增強(qiáng)。

經(jīng)初篩后，抑制率或者清除率大于50%的樣品活性復(fù)篩結(jié)果如表1所示。菌株019添加5-azaC (1 mmol/L)的誘導(dǎo)組其次生代謝產(chǎn)物顯示較強(qiáng)的AChE抑制活性(IC50為31.9 μg/mL)。但在添加誘導(dǎo)劑丁酸鈉(1 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)后其次生代謝產(chǎn)物同時(shí)顯示較強(qiáng)的AChE抑制活性(IC50值為32.2 μg/mL)和清除活性(EC50為80.6 μg/mL)。因此，選擇具有雙重活性的丁酸鈉誘導(dǎo)組(1 mmol/L)作為最優(yōu)發(fā)酵條件。菌株ZN4-5-4在添加誘導(dǎo)劑丁酸鈉(1 mmol/L和100 μmol/L)的PDB培養(yǎng)基條件下的次級(jí)代謝產(chǎn)物也具有顯著的AChE抑制活性，IC50值均為24.9 μg/mL。結(jié)合兩個(gè)條件下菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量因素，選擇產(chǎn)量更多的丁酸鈉誘導(dǎo)組(1 mmol/L)作為最優(yōu)發(fā)酵條件。

254 nm和365 nm表示測定時(shí)選用的紫外波長條件；10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L表示添加誘導(dǎo)劑的濃度；B1、B2、C1和C2分別代表菌株019和ZN添加化學(xué)誘導(dǎo)劑5-azaC和丁酸鈉的次級(jí)代謝產(chǎn)物在254 nm波長下的TLC指紋圖譜；B3、B4、C3和C4分別代表菌株019和ZN添加化學(xué)誘導(dǎo)劑5-azaC和丁酸鈉的次級(jí)代謝產(chǎn)物在365 nm波長下的TLC指紋圖譜；依次是B1、B3為019添加5-azaC，B2、B4為019添加丁酸鈉，C1、C3為ZN添加 5-azaC，C2、C4為ZN添加丁酸鈉。

圖4 誘導(dǎo)前后菌株019和ZN發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖譜

圖5 誘導(dǎo)前后菌株粗提物的AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性生物活性

表1 部分樣品的IC50、EC50和LD50活性值

注：a, b, c表示陽性對(duì)照。“-”表示沒有測試。

Note: a/b/c means positive control，“-”means not test.

3 討論

大多數(shù)微生物在傳統(tǒng)單一的條件下培養(yǎng)只能表現(xiàn)出有限的生物活性。而將實(shí)驗(yàn)室條件下生長的微生物的代謝產(chǎn)物種類與自然環(huán)境下生長微生物的代謝產(chǎn)物種類進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)許多代謝產(chǎn)物的表達(dá)被抑制了[16]。因此，如何采用科學(xué)合理的方法來削弱環(huán)境對(duì)于微生物內(nèi)部表達(dá)基因的抑制作用是獲得新型次生代謝產(chǎn)物表達(dá)的核心問題。大量科學(xué)研究表明，化學(xué)表觀遺傳修飾策略能夠很好達(dá)到發(fā)掘菌株潛能、獲得新型代謝產(chǎn)物的目的[17-19]。如王曉茹等[20]在真菌的培養(yǎng)基中加入濃度為 50 μmol/L的DNA甲基化酶抑制劑 5-azaC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的菌株在生長過程中各自的菌絲體形貌上出現(xiàn)了很大差別，最后通過對(duì)其次生代謝產(chǎn)物采用高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)在激活后該菌與對(duì)照組相比產(chǎn)生了 10 個(gè)新色譜峰。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，得到了 2 個(gè)新的萜類化合物atlantinone A和 atlantinone B。楊靜明等報(bào)道[21]采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉處理一株珊瑚來源的土曲霉C23-3，可以顯著提高其丁內(nèi)酯類代謝產(chǎn)物的差異性。在本研究中，同時(shí)選用去甲基化酶抑制劑5-azaC和組蛋白乙酰化酶抑制劑丁酸鈉兩種誘導(dǎo)劑進(jìn)行研究，并設(shè)立5個(gè)濃度梯度(10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L和1 μmol/L)對(duì)sp. 019和ZN4-5-4兩株海洋來源真菌進(jìn)行表觀遺傳修飾，發(fā)現(xiàn)不同種類及濃度的化學(xué)表觀遺傳修飾劑對(duì)不同海洋來源真菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和生物活性影響不同。

在菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和化學(xué)多樣性方面，添加誘導(dǎo)劑能在一定程度上增加菌株次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。如本研究中，添加濃度為10 μmol/L和1 μmol/L的誘導(dǎo)劑5-azaC對(duì)菌株019和ZN次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量具有顯著的增加作用（增長率> 46.7%）。同時(shí)結(jié)合菌株的TLC和HPLC圖像可知，菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類和個(gè)數(shù)也隨著誘導(dǎo)劑的加入逐漸增多。如在添加濃度為10 mmol/L、1 mmol/L和100 μmol/L的誘導(dǎo)劑的情況下，菌株019和ZN的次生代謝產(chǎn)物種類明顯增多。通過這些現(xiàn)象推測，誘導(dǎo)劑5-azaC和丁酸鈉的加入可在一定程度上激活或者增強(qiáng)菌株的某些沉默基因，使得菌株的次生代謝產(chǎn)物的種類增加或者產(chǎn)量增加。

在菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物生物活性方面，添加不同誘導(dǎo)劑對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物活性影響不一。如本研究中，添加5-azaC對(duì)菌株019中抗AChE抑制和鹵蟲致死活性成分的產(chǎn)生具有顯著激活作用，但是對(duì)菌株ZN中抗AChE活性成分的產(chǎn)生具有顯著抑制作用。而添加丁酸鈉可明顯提高菌株019和ZN次生代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種誘導(dǎo)激活作用并不具備濃度依賴性，如在用5-azaC激活的菌株019次生代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)中，在低于濃度為1 mmol/L時(shí)，菌株的抗AChE活性隨著丁酸鈉濃度增大而增強(qiáng)，當(dāng)濃度超過1 mmol/L時(shí)，菌株019次生代謝產(chǎn)物的抗AChE活性隨著5-azaC濃度升高而減小。可能的原因有：一是隨著誘導(dǎo)劑5-azaC的加入，菌株019細(xì)胞內(nèi)編碼AChE抑制活性組分的沉默基因被激活，并且隨著濃度增加，這種激活作用越明顯，從而導(dǎo)致大量抗AChE活性的代謝產(chǎn)物被合成了出來，使得粗提物的AChE抑制活性增強(qiáng)。但當(dāng)濃度增大到一定的時(shí)候，由于對(duì)主產(chǎn)物的基因激活作用達(dá)到飽和，且可能有其他新的基因被激活，導(dǎo)致新的代謝產(chǎn)物被合成，最終導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的抗AChE活性降低。二有可能是由于DNA甲基化酶抑制劑被過多加入，從而導(dǎo)致DNA甲基化酶被過多抑制，導(dǎo)致生物體內(nèi)代謝平衡紊亂，從而影響了真菌正常生長代謝過程，最終導(dǎo)致菌株019代謝產(chǎn)物的抗AChE活性的降低。由此可以得出，不同表觀遺傳修飾劑對(duì)于不同真菌的抗AChE活性代謝產(chǎn)物的激活是有濃度限制的，這個(gè)濃度可認(rèn)為是表觀遺傳修飾劑作用的最佳濃度。

4 結(jié)論

本研究表明，不同種類及濃度的化學(xué)表觀遺傳修飾劑對(duì)不同海洋來源真菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和生物活性影響不同。綜合菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、種類、AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性結(jié)果分析可知：添加1 mmol/mL的5-azaC和丁酸鈉誘導(dǎo)劑均可使菌株019的次生代謝產(chǎn)物的種類增加；且同時(shí)能提高該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE的抑制活性和DPPH自由基清除活性。但添加1 mmol/mL的5-azaC會(huì)增大次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲致死率。而對(duì)菌株ZN4-5-4而言，添加1 mmol/mL和100 μmol/L的丁酸鈉誘導(dǎo)劑均可使該菌株次生代謝產(chǎn)物的種類增加，且同時(shí)能提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性和DPPH自由基清除活性。但添加1 mmol/mL的丁酸鈉可使菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量增大程度更多。綜上所述，由此確定了菌株019和ZN4-5-4的最優(yōu)發(fā)酵條件均為添加了濃度為1 mmol/mL丁酸鈉的PDB培養(yǎng)基。

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Influence of Chemical Induction on the Secondary Metabolites and Biological Activities of Two Marine Fungi

LIU Ya-yue1,3, XUE Xin-yi1, LI Zhuo-yi1, MA Xiao-xiang1, LIANG Jin-yue1, HU Xue-qiong1,3, ZHANG Yi1,2,3

（1.,////////////,,524088,; 2.,,518120,; 3.,,116034,）

【Objective】Based on two marine-derived fungi, this study explore the effects of different types and concentrations of chemical epigenetic modifiers on the secondary metabolites and biological activities.【Method】Based on the chemical epigenetic modification strategy, two strains of marine-derived fungi, i.e.sp. 019 andZN4-5-4, were epigenetically modified by two different chemical epigenetic modifiers, i.e. 5-azacytidine (5-azaC) and sodium butyrate. The morphological variations of the mycelia were observed. Then, based on the thin layer chromatography (TLC) fingerprints, high performance liquid chromatography, acetylcholinesterase (AChE) inhibitory, 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging, and artemia lethality activities screening models, the fermentation conditions with rich metabolites, low toxicity and rich anti-acetylcholinesterase and antioxidant products were initially screened out.【Result】The results showed that different concentrations (i.e. 10 mmol/L, 1 mmol/L, 100 μmol/L, 10 μmol/L, 1 μmol/L) of 5-azaC and sodium butyrate had significant improvementeffects on the production and biological activity of marine fungal secondary metabolites.【Conclusion】The optimal fermentation conditions for strain 019 and ZN4-5-4 were PDB medium plus 1 mmol/mL sodium butyrate. Under the chemical epigenetic modification strategy, the addition of inducer 5-azaC or sodium butyrate exerts some effects on the production of secondary metabolites of three marine fungi.

marine fungi; chemical induction; acetylcholinesterase inhibitory activity; antioxidant; artemia lethal activity

Q936

A

1673-9159（2022）01-0050-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.008

劉亞月，薛欣怡，黎卓怡，等. 化學(xué)誘導(dǎo)對(duì)2株海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（1）：50-58.

2021-09-09

國家自然科學(xué)基金（21807015）；廣東海洋大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（R18008）；廣東省揚(yáng)帆計(jì)劃引進(jìn)緊缺拔尖人才項(xiàng)目（201433009）；廣東省自然科學(xué)基金（2018A030307046）；深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究自由探索項(xiàng)目（JCYJ20170306165013264）；深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（JCYJ20190813105005619）；深圳市大鵬新區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金（KY20180203 和PT201901-05）；深圳市大鵬新區(qū)科技研發(fā)項(xiàng)目（KJYF202001-07）

劉亞月（1989－），女，博士，講師，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锘钚晕镔|(zhì)。E-mail: yayue_liu@163.com

張翼，男，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘瘜W(xué)。E-mail: hubeizhangyi@163.com

（責(zé)任編輯：劉嶺）