梁倫海,劉 麗,張勝男,孟慶國(guó),趙風(fēng)蘭,柴曉云

(1. 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺(tái) 264005; 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院,上海 200433)

近幾十年以來,侵入性真菌感染,尤其是白念珠菌、新生隱球菌、曲霉菌和肺孢子菌等深部真菌感染的發(fā)病率及死亡率居高不下[1-3],高效抗真菌藥物研究越來越重要。目前,臨床上用于治療真菌感染的藥物主要有以下幾類:氮唑類(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等)、多烯類(兩性霉素B)、棘白菌素類(卡泊芬凈、米卡芬凈等)、烯丙胺類(特比萘芬、萘替芬等)和5-氟胞嘧啶[4]。其中,氮唑類抗真菌藥物應(yīng)用較為廣泛且高效[5],但隨著抗真菌藥物的廣泛使用甚至濫用,耐藥性和毒性問題日益嚴(yán)重,這大大降低了抗真菌藥物的療效。因此,開展廣譜、高效、低毒的抗真菌藥物研究迫在眉睫。

氮唑類藥物及其衍生物以其有效的抗真菌活性、廣譜性、穩(wěn)定性以及低毒性,在生化和醫(yī)藥領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[6],對(duì)其現(xiàn)有結(jié)構(gòu)修飾和改造用以發(fā)現(xiàn)新型抗真菌藥物極具發(fā)展前景。研究表明氮唑結(jié)構(gòu)中的三唑環(huán)、二鹵代苯基在抗真菌活性中非常重要[7],結(jié)合本課題組前期對(duì)氮唑類抗真菌衍生物的研究結(jié)果[8-12],以伊曲康唑中間體1為底物,保持氮唑類基本骨架不變,優(yōu)化其側(cè)鏈結(jié)構(gòu),通過引入取代苯甲酰胺側(cè)鏈,調(diào)節(jié)化合物脂水分配系數(shù),以及與靶酶的空間結(jié)合,通過衍生物體外抗真菌活性的測(cè)定,以期得到更廣譜、高效、低毒的抗真菌藥物。

1 儀器設(shè)備與試劑耗材

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

PL 203電子天平(博特勒-托利多儀器有限公司);Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI有限公司);SHB-I 循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);C-MAG HS7磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司);SHB-ⅢA紫外分析儀(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);ZF78循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);DLSB低溫冷卻液循環(huán)泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);1100型質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司),AC-300P/AC-600P 核磁共振儀(安捷倫科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基甲磺酸酯購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,疊氮化鈉購自國(guó)藥化學(xué)試劑公司,Pd/C(10%),甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、無水硫酸鈉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和4-二甲氨基吡啶均購自上海泰坦科技股份有限公司,試劑均為市售分析純。薄層層析硅膠板購自煙臺(tái)江友公司,柱層析硅膠(300～400目)購自青島海洋化工廠。

1.3 合成路線

以伊曲康唑中間體1為底物,與疊氮化鈉發(fā)生SN2親核取代反應(yīng),生成疊氮中間體2,用催化氫化的方法還原疊氮基,然后與取代苯甲酸縮合,得到目標(biāo)化合物A1—A19,合成路線和目標(biāo)化合物如圖1。

圖1 目標(biāo)化合物A1—A19的合成路線Fig.1 Synthetic route of the target compounds A1-A19

1.4 合成步驟

1.4.1 順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]疊氮甲烷(2)的合成 取250 mL茄形瓶,加入50 mLN,N-二甲基甲酰胺和順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基甲磺酸酯(1)(10.00 g, 25 mmol),攪拌使之溶解,再加入疊氮化鈉 (8.00 g, 125 mmol)。加熱至100～120 ℃,反應(yīng)10 h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)[展開劑為V(DCM)∶V(MeOH)=30∶1]。反應(yīng)畢,加入100 mL水,用二氯甲烷萃取3次,無水硫酸鈉干燥,過濾,減壓濃縮,得到淺黃色油狀物順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]疊氮甲烷(2) 8.85 g,淺黃色油狀物,收率96.0%。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.22 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.47～7.52 (m, 2H),7.24 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 1H), 4.81 (d,J=15.0 Hz, 2H), 4.14～4.21 (m, 1H), 3.87 (dd,J=6.0, 9.0 Hz, 1H), 3.65 (dd,J=6.0, 9.0 Hz, 1H), 3.16 (dd,J=6.0, 15.0 Hz, 1H), 3.08 (dd,J=6.0, 15.0 Hz, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+355.14。

1.4.2 順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲胺(3)的合成 取250 mL茄形瓶,加入100 mL甲醇和化合物2(8.85 g, 25 mmol),攪拌使之溶解,再加入250 mg鈀碳 (10%),連接氫氣袋,室溫反應(yīng)12 h,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至原料消失[展開劑為V(DCM)∶V(MeOH)=10∶1]。過濾,減壓濃縮,得到7.32 g順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲胺 (3),淡黃色粉末,收率89.3%。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.21 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.58 (d,J=6.0 Hz, 1H), 7.47 (d,J=2.4 Hz, 1H), 7.24～7.27 (m, 1H), 4.78 (d,J=15.0 Hz, 2H), 3.99～4.07 (m, 1H), 3.85 (t,J=6.0 Hz, 1H), 3.52 (dd,J=6.0, 12.0 Hz, 1H), 2.68 (dd,J=3.0, 12.0 Hz, 1H), 2.48 (dd,J=6.0, 12.0 Hz, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+329.07。

1.4.3 順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-取代苯甲酰胺的合成 取50 mL茄形瓶,加入10 mL二氯甲烷和化合物3(500 mg, 1.53 mmol) 和10 mL二氯甲烷,攪拌使之溶解,再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(730 mg, 3.82 mmol)和50 mg 4-二甲氨基吡啶,室溫?cái)嚢? h。另稱取8.4 mmol取代苯甲酸加入至反應(yīng)液,加熱回流4 h,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至原料消失[展開劑為V(DCM)∶V(MeOH)=20∶1]。反應(yīng)畢,用稀鹽酸溶液洗滌2次,飽和食鹽水洗滌有機(jī)相,無水硫酸鈉干燥,過濾,減壓濃縮,硅膠柱層析[洗脫劑為V(PE)∶V(EA)=5∶1] 得到化合物A1—A19,收率65.0%～85.4%,收率、熔點(diǎn)、1H NMR和ESI-MS具體數(shù)據(jù)如下。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-苯甲酰胺(A1):白色粉末,收率78.2%, mp 135.0～136.2 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.21 (s, 1H), 7.84 (dd,J=1.5, 6.0 Hz, 2H), 7.40～7.68 (m, 6H), 7.30～7.36 (m, 1H), 6.82 (brs, 1H), 4.74～4.87 (m, 2H), 4.25～4.32 (m, 1H), 3.86～3.91 (m, 1H), 3.63～3.71 (m, 1H), 3.46～3.56 (m, 1H), 3.08～3.23 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+433.23。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-3-氟苯甲酰胺(A2):白色粉末,收率74.8%, mp 136.1～136.9 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.22 (s, 1H), 7.57～7.71 (m, 4H), 7.31～7.50 (m, 3H), 7.24～7.29 (m, 1H), 6.88 (brs, 1H), 4.73～4.89 (m, 2H), 4.26～4.34 (m, 1H), 3.86～3.92 (m, 1H), 3.65～3,72 (m, 1H), 3.49～3.55 (m, 1H), 3.07～3.18 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+451.11。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-4-氟苯甲酰胺(A3):白色粉末,收率70.0%, mp 136.3～137.8 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.27 (s, 1H), 7.85～7.89 (m, 2H), 7.59～7.69 (m, 2H), 7.46～7.50 (dd,J=3.0, 9.0 Hz, 1H), 7.30～7.39 (m, 1H), 7.19 (t,J=9.0 Hz, 2H), 6.81 (brs, 1H), 4.73～4.84 (m, 2H), 4.25～4.32 (m, 1H), 3.85～3.9 (m, 1H), 3.65～3.69 (m, 1H), 3.49～3.53 (m, 1H), 3.06～3.15 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+451.09。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-2-氯苯甲酰胺(A4):白色粉末,收率81.2%, mp 136.6～137.9 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.14 (s, 1H), 7.55～7.69 (m, 2H), 7.31～7.51 (m, 6H), 6.64 (brs, 1H), 4.74～4.79 (m, 2H), 4.27～4.36 (m, 1H), 3.88～3.94 (m, 1H), 3.56～3.65 (m, 2H), 3.32～3.43 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+467.05。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-3-氯苯甲酰胺(A5):白色粉末,收率75.6%, mp 136.4～137.7 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.28 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.29～7.74 (m, 7H), 6.98 (brs, 1H), 4.72～4.89 (m, 2H), 4.27～4.31 (m, 1H), 3.86～3.92 (m, 1H), 3.65～3.71 (m, 1H), 3.48～3.54 (m, 1H), 3.11～3.22 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+467.07。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-4-氯苯甲酰胺(A6):白色粉末,收率78.5%, mp 136.3～137.5 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.93 (s, 1H), 7.81～7.88 (m, 3H), 7.54～7.64 (m, 1H), 7.45～7.49 (m, 3H), 7.35～7.39 (m, 2H), 4.77～4.95 (m, 2H), 4.29～4.36 (m, 1H), 3.87～3.93 (m, 1H), 3.67～3.75 (m, 1H), 3.51～3.59 (m, 1H), 3.15～3.24 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+467.07。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-2-溴苯甲酰胺(A7):白色粉末,收率73.3%, mp 136.7～137.9 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.24 (s, 1H), 7.60～7.70 (m, 2H), 7.29～7.51 (m, 6H), 6.59 (brs, 1H), 4.74～4.80 (m, 2H), 4.29～4.38 (m, 1H), 3.90～3.96 (m, 1H), 3.59～3.67 (m, 2H), 3.39～3.50 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+510.99。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-3-溴苯甲酰胺(A8):白色粉末,收率84.6%, mp 136.0～137.9 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.22 (s, 1H), 8.02 (s, 1H),7.56～7.78 (m, 4H), 7.45～7.49 (m, 1H), 7.28～7.40 (m, 2H), 6.88 (brs, 1H), 4.71～4.88 (m, 2H), 4.24～4.31 (m, 1H), 3.85～3.91 (m, 1H), 3.63～3.72 (m, 1H), 3.47～3.52 (m, 1H), 3.10～3.21 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+511.02。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-4-溴苯甲酰胺(A9):白色粉末,收率82.1%, mp 136.7～138.1 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.21 (s, 1H), 7.59～7.74 (m, 6H), 7.46～7.50 (m, 1H), 7.31～7.39 (m, 1H), 6.82 (brs, 1H), 4.72～4.88 (m, 2H), 4.24～4.31 (m, 1H), 3.85～3.91 (m, 1H), 3.64～3.70 (m, 1H), 3.47～3.52 (m, 1H), 3.05～3.16 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+510.99。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-2-甲基苯甲酰胺(A10):白色粉末,收率77.0%, mp 135.7～137.1 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.13 (s, 1H), 7.59～7.71 (m, 1H), 7.28～7.49 (m, 7H), 7.08～7.11 (m, 1H), 6.44 (brs, 1H), 4.65～4.77 (m, 2H), 4.23～4.33 (m, 1H), 3.88～3.94 (m, 1H), 3.38～3.62 (m, 3H), 2.42 (s, 3H), ESI-MS (m/z): [M+H]+447.10。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-4-甲基苯甲酰胺(A11):白色粉末,收率85.4%, mp 135.5～137.3 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.28 (s, 1H), 7.82 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 2H), 7.58～7.71 (m, 2H), 7.47 (dd,J=2.1, 6.0 Hz, 1H), 7.29～7.36 (m, 1H), 7.00 (d,J=9.0 Hz, 2H), 6.70 (brs, 1H), 4.79～4.83 (m, 2H), 4.24～4.32 (m, 1H), 3.85～3.92 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.62～3.98 (m, 1H), 3.47～3.53 (m, 1H), 3.10～3.22 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+447.09。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-2-甲氧基苯甲酰胺(A12):白色粉末,收率72.9%, mp 136.5～137.7 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.16～8.23 (m, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.43～7.62 (m, 3H), 7.21～7.25 (m, 1H), 7.02～7.13 (m, 2H), 4.75～4.93 (m, 2H), 4.29～4.32 (m, 1H), 4.08 (s, 3H), 3.86～3.92 (m, 1H), 3.59～3.68 (m, 2H), 2.92～3.01 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+463.07。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-3-甲氧基苯甲酰胺(A13):白色粉末,收率76.1%, mp 137.1～138.3 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.17 (s, 1H), 7.58～7.68 (m, 2H), 7.30～7.49 (m, 5H), 7.09～7.13 (m, 1H), 6.80 (brs, 1H), 4.77～4.88 (m, 2H), 4.24～4.32 (m, 1H), 3.85～3.93 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.63～3.72 (m, 1H), 3.46～3.52 (m, 1H), 3.09～3.20 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+463.10。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-2-硝基苯甲酰胺(A14):白色粉末狀固體,收率68.3%, mp 137.6～138.9 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.32～8.37 (m, 3H), 8.07 (dd,J=2.1, 8.4 Hz, 2H), 7.30～7.38 (m, 4H), 7.11 (brs, 1H), 4.73～4.90 (m, 2H), 4.28～4.35 (m, 1H), 3.88～3.95 (m, 1H), 3.67～3.73 (m, 1H), 3.53～3.58 (m, 1H), 3.02～3.12 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+478.10。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-3-硝基苯甲酰胺(A15):白色粉末,收率66.7%, mp 137.8～139.1 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.80 (s, 1H), 8.40～8.48 (m, 2H), 8.25 (d,J=6.0 Hz, 1H), 7.81 (d,J=3.0 Hz, 1H), 7.71 (t,J=6.0 Hz, 1H), 7.57～7.66 (m, 1H), 7.47～7.50 (m, 1H), 7.29～7.39 (m, 2H), 4.75～4.94 (m, 2H), 4.31～4.38 (m, 1H), 3.89～3.94 (m, 1H), 3.71～3.78 (m, 1H), 3.56 (m, 1H), 3.10～3.21 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+478.07。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-4-硝基苯甲酰胺(A16):白色粉末,收率68.3%, mp 137.1～138.8 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.33～8.38 (m, 3H), 8.05 (dd,J=2.1, 6.0 Hz, 2H), 7.31～7.72 (m, 4H), 7.12 (brs, 1H), 4.74～4.91 (m, 2H), 4.29～4.35 (m, 1H), 3.87～3.93 (m, 1H), 3.69～3.78 (m, 1H), 3.52～3.57 (m, 1H), 3.01～3.12 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+478.06。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-2-三氟甲基苯甲酰胺(A17):白色粉末,收率65.0%, mp 136.2～138.4 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ8.12 (s, 1H), 7.75 (d,J=6.0 Hz, 1H), 7.57～7.67 (m, 3H), 7.44～7.50 (m, 2H), 7.22～7.36 (m, 2H), 6.66 (brs, 1H), 4.69～4.73 (m, 2H), 4.24～4.35 (m, 2H), 3.82～3.89 (m, 1H), 3.48～3.58 (m, 2H), 3.26～3.39 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+501.09。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-3-三氟甲基苯甲酰胺(A18):白色粉末,收率67.5%, mp 136.4～138.0 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.17 (s, 2H), 8.04 (d,J=6.0 Hz, 1H), 7.82 (d,J=6.0 Hz, 1H), 7.55～7.68 (m, 3H), 7.47～7.50 (m, 1H), 7.29～7.38 (m, 1H), 7.04 (brs, 1H), 4.72～4.89 (m, 2H), 4.26～4.32 (m, 1H), 3.85～3.93 (m, 1H), 3.67～3.73 (m, 1H), 3.49～3.55 (m, 1H), 3.10～3.21 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+501.08。

順-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基}-4-三氟甲基苯甲酰胺(A19):白色粉末,收率70.8%, mp 137.1～138.2 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.27 (s, 1H), 7.98～8.00 (d,J=6.0 Hz, 2H), 7.48～7.80 (m, 5H), 7.31～7.41 (m, 1H), 6.94～7.01 (m, 1H), 4.74～4.90 (m, 2H), 4.28～4.36 (m, 1H), 3.87～3.92 (m, 1H), 3.67～3.76 (m, 1H), 3.51～3.56 (m, 1H), 3.03～3.15 (m, 1H), ESI-MS (m/z): [M+H]+501.12。

1.5 目標(biāo)化合物體外抗真菌活性篩選

1.5.1 試驗(yàn)菌株 選用白念珠菌(Candidaalbicans, ATCC 14053)、白念珠菌(Candidaalbicans, SCZ 20352)、近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis,90018)、新生隱球菌(cryptococcusneoformans, 20322)、光滑假絲酵母菌(Candidaglabrata,Y10b)和煙曲霉菌(Aspergillusfumigates, 3627)6種人體致病菌,所用菌株由海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科真菌研究所菌種庫提供,并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)照品 陽性對(duì)照藥物氟康唑(≥99%)、伊曲康唑(≥99%)、米卡芬凈(≥99%)、特比萘酚(≥99%)和兩性霉素 B(≥99%),均購于上海泰坦科技股份有限公司。

1.5.3 體外抗真菌實(shí)驗(yàn)方法 目標(biāo)化合物的體外抗真菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)M27-A2文件提出的標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌敏感性實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物合成探討

本研究以伊曲康唑中間體順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基甲磺酸酯為底物,以疊氮化鈉為親核試劑,通過親核取代反應(yīng),生成疊氮化中間體2,再催化氫化還原疊氮基為氨基,得到關(guān)鍵的中間體順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲胺,催化氫化選用10%鈀碳為催化劑,操作簡(jiǎn)便,后處理方便。

順-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲胺與取代苯甲酸的縮合反應(yīng),選用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為縮合劑,4-二甲氨基吡啶為高效催化劑,收率較高。為了避免DMAP在核磁譜中的雜質(zhì)峰,通過鹽酸和飽和食鹽水多次洗滌,以及柱層析分離去除DMAP,最終得到伊曲康唑衍生物A1—A19。

2.2 體外抗真菌活性的結(jié)果

采用標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌敏感性實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定化合物A1—A19對(duì)6種致病真菌最小抑制濃度值MIC80(生長(zhǎng)抑制率為80%時(shí)的最小抑制濃度),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

體外抗真菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,19個(gè)伊曲康唑衍生物對(duì)這6種致病菌具有不同的體外抑制活性作用。其中對(duì)白念珠菌和近平滑假絲酵母菌均具有較好的體外抑制活性作用。19個(gè)衍生物對(duì)白念珠菌(ATCC 14053)抑制活性作用優(yōu)于氟康唑和特比萘芬,對(duì)近平滑假絲酵母菌抑制活性作用優(yōu)于米卡芬凈,衍生物A6、A7、A9、A10和A19對(duì)光滑假絲酵母菌抑制活性優(yōu)于伊曲康唑,其中A6對(duì)光滑假絲酵母菌的MIC80值為0.125 μg/mL,是伊曲康唑的4倍,A7、A9、A10和A19對(duì)光滑假絲酵母菌的MIC80為0.25 μg/mL,是伊曲康唑的2倍。衍生物A5、A6、A10和A14對(duì)除煙曲霉菌之外的所試菌株均具有較好的體外抑制活性,優(yōu)于氟康唑和兩性霉素B,其中A6是這19個(gè)衍生物中抑制活性最優(yōu)的化合物,對(duì)除煙曲霉菌外的測(cè)試菌株的MIC80均≤0.25 μg/mL,在廣譜和有效性上具有較好的研究?jī)r(jià)值。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)常見治病真菌體外活性Tab.2 In vitro antifungal activity of the title compounds μg/mL-1

3 結(jié) 論

以伊曲康唑中間體為底物,經(jīng)疊氮化鈉親核取代、氨基還原和縮合合成19個(gè)新型伊曲康唑衍生物并用于構(gòu)效關(guān)系的研究,化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H NMR和MS確證。目標(biāo)化合物的體外抗真菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)M27-A2文件的標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌敏感性實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行得出的結(jié)果顯示,合成的部分伊曲康唑衍生物體外抗真菌活性有所增強(qiáng),可能是取代苯基側(cè)鏈的引入,改變了化合物側(cè)鏈的空間取向和電性性質(zhì),影響了化合物和靶酶的結(jié)合,使化合物更好的嵌入活性腔并發(fā)揮作用。特別是A6對(duì)于除煙曲霉菌之外的實(shí)驗(yàn)致病菌均有較好的抑制活性,具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。