鐘林江,楊俊莉,何勇志,李玉婷,楊安迪

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)院,四川 成都 610106;2.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 610106)

0 引 言

熊膽粉來源于熊科動(dòng)物黑熊的干燥膽汁，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材[1].現(xiàn)代藥理研究表明，熊膽粉具有清熱解毒、清肝明目以及抗腫瘤等藥理作用[2-3].隨著熊膽類藥材的臨床用量逐漸增大，且與其代用品價(jià)格差異巨大，市場(chǎng)上的熊膽粉出現(xiàn)了摻入較便宜的替代品以及投料不足等問題，嚴(yán)重影響相應(yīng)中成藥質(zhì)量.本文就熊膽粉的臨床應(yīng)用、化學(xué)成分和真?zhèn)舞b別3個(gè)方面進(jìn)行綜述，為熊膽粉后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供一定參考.

1 熊膽粉的臨床應(yīng)用

目前，已有153種上市中成藥含有熊膽粉，如熊膽膠囊、熊膽痔靈栓與痰熱清注射液等，其中很多藥已被列為國(guó)家中藥保護(hù)品種.通過檢索《中國(guó)藥典》《新編中成藥合理應(yīng)用手冊(cè)》以及《新編國(guó)家中成藥》，剔除其中重復(fù)記錄，有45種含熊膽粉的中成藥，其中處方藥有20種，非處方藥A類有25種.內(nèi)科病癥(19 種) 的熊膽粉中成藥在臨床應(yīng)用最為廣泛，如治療咳嗽、發(fā)熱、肝病、高血壓與心絞痛等；其次為眼科病癥(11種),以外用為主，如治療沙眼、麥粒腫、急性結(jié)膜炎與瞼緣炎等；再其次為外科病癥(7種)，如治療瘡瘍熱痛、膽結(jié)石與食管癌等；再次為耳鼻喉科病癥(6種)，如治療急慢性咽喉炎與口舌生瘡；其后依次為痔瘡(4種)、消化不良(2種)及婦科疾病(2種).常用含熊膽粉中成藥功效見表1[4-6].

表1 常用含熊膽粉中成藥的功效

2 熊膽粉的化學(xué)成分

動(dòng)物膽的藥效主要與膽汁中的化學(xué)成分有關(guān).動(dòng)物膽汁的化學(xué)成分主要包括膽酸類、膽固醇、色素類、磷脂、氨基酸、無機(jī)鹽以及微量元素等[7-8].其中，膽汁酸是其主要的活性成分，以去氧膽酸(DCA)為主,不同動(dòng)物膽汁中主要活性成分見表2，表2中，?；秦i膽酸(THCA)、豬膽酸(HCA)、?；侨パ跄懰?TDCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)、?；鞘懰?TLCA)、甘氨膽酸(GCA)、牛磺豬去氧膽酸(THDCA)、甘氨去氧膽酸(GDCA)、熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺膽酸(TCA)、豬去氧膽酸(HDCA)、膽酸(CA)、?；切苋パ跄懰?TUDCA)、去氧膽酸(DCA)、鵝去氧膽酸(CDCA).

表2 15種動(dòng)物膽汁中主要活性成分

由表2可知，通過對(duì)15種動(dòng)物膽汁中主要活性成分進(jìn)行整理，可見其具有一定相似性，其測(cè)定方法均以熊去氧膽酸(UDCA)一種成分作為測(cè)定指標(biāo)，檢測(cè)指標(biāo)單一，難以鑒別熊膽樣品確切來源.

3 熊膽粉的鑒別

3.1 DNA鑒別

熊膽粉的傳統(tǒng)鑒別方法主要有手搓、水試、口嘗以及火燒等，但感官指標(biāo)常因操作者的經(jīng)驗(yàn)不同而存在較大差異，難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化.何永盛等[9]采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR法，檢測(cè)黑熊和棕熊的COI的基因，并根據(jù)基因設(shè)計(jì)出特異性檢測(cè)引物和探針，在此基礎(chǔ)上建立了一種快速鑒別熊膽粉生物來源的檢測(cè)方法.通過兩個(gè)引物的結(jié)合，完成了膽粉類藥材及其正偽摻雜品的鑒別.許亞春等[10]將DNA 條形碼技術(shù)應(yīng)用于熊膽粉及其混偽品的鑒定研究，對(duì)收集的熊膽粉樣品進(jìn)行DNA 提取以及PCR擴(kuò)增雙向測(cè)序，結(jié)果顯示在COI序列建立的NJ樹中，黑熊、棕熊及混偽品各聚為一支，且可以較好地區(qū)分開.田娜等[11]基于STR分型原理建立了一種簡(jiǎn)單、快捷且可用于動(dòng)物膽粉類藥材及其摻偽品的通用DNA指紋圖譜鑒別方法，并收集了豬、熊、魚、雞、鴨、牛、羊、鵝與蛇等膽粉樣本，使用篩選獲得的鑒別引物擴(kuò)增，并進(jìn)行STR分型獲得DNA指紋圖譜.根據(jù)各物種的STR指紋圖譜差異，可進(jìn)行物種鑒別.作為一種安全便捷可靠的物種鑒定技術(shù)，DNA條形碼指紋圖譜上可以同時(shí)反映正偽品的信息，可作為市售熊膽粉真?zhèn)舞b別的一種輔助手段.同時(shí)，該研究建立的DNA條形碼鑒別方法，同樣也可用于其他動(dòng)物藥材的真?zhèn)舞b別和摻混品的檢出.

3.2 顯微鑒別

顯微鏡可用于觀察藥材內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)及其組織構(gòu)造，從而大致判定其質(zhì)地和成分.張麗華等[12]分別取熊膽、豬膽、羊膽和牛膽的粉末于載玻片上，分別滴加甲苯和乙二醇，進(jìn)行顯微觀察.結(jié)果顯示，熊膽粉的顯微特征與豬膽粉、羊膽粉及牛膽粉有一定的區(qū)別，可用于提供一定鑒別依據(jù).李炎桂等[13]使用甲苯作為溶媒裝片，分別對(duì)貉膽粉、熊膽粉進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果顯示，熊膽粉與豹膽粉也有一定差異.

3.3 熒光鑒別

譚文敏[14]取熊膽粉與兔膽粉末，置于紫外光燈下觀察，其中熊膽粉可觀察到黃白色熒光，而兔膽粉未觀察到明顯熒光現(xiàn)象.李炎桂等[13]發(fā)現(xiàn)熊膽粉在紫外光燈下觀察到黃白色熒光，而貉膽粉則可觀察到明亮黃綠色熒光.但楊令家等[15]分別置熊膽粉末和狗膽粉末于紫外光燈(波長(zhǎng)365nm)下觀察，二者在紫外條件下均有黃白色熒光，結(jié)果表明，在紫外條件下顯示黃白色熒光的不止熊膽粉一種膽粉，故熒光鑒別不能作為熊膽粉鑒別依據(jù).

3.4 薄層鑒別

何柯等[16]建立了熊膽粉的薄層鑒別方法.取?；切苋パ跄懰釋?duì)照品，加甲醇制成對(duì)照品溶液，以乙酸乙酯—正丁醇—冰乙酸—水(40∶30∶15∶15)為展開劑，磷鉬酸溶液為顯色劑，供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，存在相同顏色的斑點(diǎn).缺熊膽粉的陰性溶液色譜在相應(yīng)位置處無對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn).李炎桂等[13]對(duì)兔膽粉、豬膽粉、豹膽粉與熊膽粉進(jìn)行了薄層鑒別，均以異辛烷—冰醋酸—異戊醚—正丁醇—水(10∶5∶5∶3∶1)為展開劑，但其展開顯色后，各動(dòng)物膽粉間差異較小，故薄層鑒別法不能為熊膽粉的鑒別提供可靠依據(jù).

3.5 紅外光譜鑒別

近年來,紅外光譜鑒別逐漸成為中藥質(zhì)量鑒定的一種重要手段.李政等[17]將天然熊膽粉、人工熊膽粉及?；切苋パ跄懰嵊诟道锶~變換紅外光譜儀上同法繪制紅外吸收光譜圖.結(jié)果顯示，3者在1 700～700 cm-1范圍存在特征性區(qū)別,為鑒別天然熊膽粉與人工熊膽粉提供了參考.鄢海燕等[18]運(yùn)用紅外光譜來鑒別熊膽粉、豬膽粉、牛膽粉與雞膽粉，結(jié)果顯示，該方法可以鑒別熊膽粉、牛膽粉與豬膽粉，但不能準(zhǔn)確區(qū)分熊膽粉與雞膽粉.因其雞膽粉與熊膽粉的紅外吸收光譜圖基本一致，熊膽粉的3個(gè)主要紅外吸收特征雞膽粉圖譜中均有.

3.6 近紅外光譜鑒別

隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，近年來熊膽粉質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別技術(shù)也出現(xiàn)了快速分析的方法.李文龍等[19-20]采用近紅外漫反射光譜法建立了一種熊膽粉提取物中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸定量預(yù)測(cè)模型，鑒別了熊膽粉的真?zhèn)?并對(duì)其摻偽品的摻入比例做了定量分析，對(duì)采集到的結(jié)果進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，熊膽粉及其摻偽品之間存在明顯界限，不同來源地的熊膽粉之間存在著一定的差異.程志偉[21]采用近紅外光譜分析技術(shù)，建立了熊膽粉水解過程中4種膽汁酸(?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸以及鵝去氧膽酸)含量的快速測(cè)定方法，適用于大規(guī)模與批量生產(chǎn)的質(zhì)量控制，同時(shí)將近紅外光譜分析技術(shù)與移動(dòng)窗標(biāo)準(zhǔn)偏差法相結(jié)合，提出了一種快速有效的熊膽粉水解過程終點(diǎn)判斷方法，為其他動(dòng)物藥的水解過程質(zhì)量控制提供了新思路.與傳統(tǒng)的分析技術(shù)相比，近紅外光譜技術(shù)具有高效、在線檢測(cè)、無損分析與多通道數(shù)據(jù)傳輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)中藥生產(chǎn)智能化以及規(guī)范化有著重大意義.

3.7 氨基酸和微量元素含量鑒別

氨基酸和微量元素是與機(jī)體生命活動(dòng)息息相關(guān)的重要物質(zhì)，其中重金屬元素為中藥進(jìn)出口檢測(cè)的重要指標(biāo)之一.因此，對(duì)熊膽粉中氨基酸和微量元素的含量進(jìn)行測(cè)定，可用于熊膽粉的鑒別.李菲[22]用氨基酸分析儀和原子分光光度計(jì)等儀器分別測(cè)定熊膽粉、鵝膽粉、雞膽粉與鴨膽粉中氨基酸及微量元素的含量，發(fā)現(xiàn)4種膽粉中游離氨基酸的含量均較低，水解氨基酸的含量從小到大依次為熊膽粉、雞膽粉、 鵝膽粉與鴨膽粉，4種膽粉均含有18 種中無機(jī)元素，其中磷、鉀、鈣、鎂與鈉的含有量較高，且熊膽粉中含量低于其他膽粉.王杰等[23]利用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定不同來源地(四川、云南與黑龍江)熊膽粉的膽汁酸和氨基酸，并利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定其微量元素.結(jié)果表明，不同來源熊膽粉中氨基酸與微量元素含量也存在著一定的差異，為熊膽粉的鑒別提供了一定的科學(xué)依據(jù).

3.8 特征圖譜鑒別

熊膽粉現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)大多采用紫外檢測(cè)器測(cè)定其膽汁酸含量，但其膽甾烷結(jié)構(gòu)僅有極其微弱的紫外末端吸收，靈敏度差[24-25].蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是目前廣泛應(yīng)用的膽汁酸成分檢測(cè)器，彌補(bǔ)了紫外檢測(cè)器基線漂移與靈敏度差等一系列問題[26-28]，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器在精密度等方面仍具有一定局限性[29-31].由于熊膽粉成分復(fù)雜，單采用高效液相色譜法難以將其大多數(shù)成分洗脫出來,目前未見有相關(guān)研究?jī)H利用高效液相色譜法建立熊膽粉所有成分的特征指紋圖譜.簡(jiǎn)龍海等[32]運(yùn)用高效液相色譜法只針對(duì)痰熱清注射液中熊膽粉部分的指紋圖譜進(jìn)行了測(cè)定，并定量測(cè)定了熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸.張怡欣等[33]首次采用超高效液相色譜串聯(lián)電噴霧式檢測(cè)器新技術(shù)，對(duì)熊膽粉中膽汁酸成分進(jìn)行了分析，建立了熊膽粉的特征指紋圖譜，并對(duì)不同來源熊膽粉進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)以及差異性化學(xué)成分分析，解決了熊膽粉現(xiàn)行質(zhì)量控制模式存在的膽汁酸類化合物信息不足、檢測(cè)困難以及耗時(shí)長(zhǎng)等問題，為熊膽粉的鑒別提供了新的思路和方法.

4 結(jié) 語

中藥材的研究熱點(diǎn)主要集中在化學(xué)成分分析及其藥理作用研究方面[34]，大部分中藥材的鑒定方法并不完善，還有待進(jìn)一步研究.熊膽粉的主要活性成分熊去氧膽酸可通過人工合成途徑獲得，一定程度上為其替代品提供了可能性，但有研究表明，熊膽粉的功效在于其熊去氧膽酸與其他多種成分的協(xié)同作用，人工合成熊去氧膽酸難以完全替代其療效.為確保熊膽粉中成藥的功效，有必要建立鑒別熊膽粉樣品確切來源的檢測(cè)方法.目前，熊膽粉常用的鑒別方法為性狀鑒別、顯微鑒別及薄層鑒別等，存在一定主觀因素,不能滿足現(xiàn)代中成藥的生產(chǎn)需求，如采用薄層鑒別法比較其成分差異，具體這種成分的差異，是否會(huì)導(dǎo)致兩者在其藥理作用的差異，有待進(jìn)一步探討.

熊膽粉與其他動(dòng)物膽粉具有相似的化學(xué)組成，但其形成機(jī)理和環(huán)境不同，在一定程度上必然存在差異，可采用超高效液相色譜聯(lián)合飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析軟件分析熊膽粉及其他膽粉的化學(xué)成分[35-36]，從而發(fā)現(xiàn)其專屬性特征成分，準(zhǔn)確鑒別并控制其質(zhì)量，全面提升熊膽粉中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).后期可借助光譜、氣/液色譜、質(zhì)譜以及相關(guān)聯(lián)用技術(shù)，研究傳統(tǒng)名貴中藥材的特征圖譜.同時(shí)，可借助DNA條形碼、PCR 擴(kuò)增及譜—效等分子生物學(xué)技術(shù)，開展其特異性成分的定性鑒別及定量研究，以提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).