王 銘 彭敏琳 許 瑾 梁翠誼 向文洲 李 濤

海帶渣資源化利用及在小球藻培養(yǎng)中的應用研究*

王 銘1, 2彭敏琳1, 3許 瑾4梁翠誼4向文洲2, 3李 濤2, 3①

(1. 貴州民族大學生態(tài)環(huán)境工程學院 貴州貴陽 550025; 2. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室 廣東省海洋藥物重點實驗室 廣東廣州 510301; 3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州) 廣東廣州 511458; 4. 中國科學院廣州能源研究所 中國科學院可再生能源與天然氣水合物重點實驗室 廣東廣州 510640)

海帶渣是海帶加工中的固體廢棄物, 將其資源化利用生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品具有重要意義。文章以海帶渣為原料, 糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度、單糖組成和小球藻培養(yǎng)效果為主要評估指標, 探究不同預處理方法對海帶渣酶解的影響, 以及海帶渣資源化利用培養(yǎng)微藻工藝的可行性。結(jié)果顯示: (1) 粗纖維和灰分是海帶渣主要組成成分; (2) 常溫常壓稀硫酸預處理海帶渣后進行纖維素酶解, 糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度由初始(海帶渣未進行預處理) 2.7 g/L提高到26.3 g/L, 在較優(yōu)糖化工藝條件下(纖維素酶用量50 IU/g, 酶解時間36 h, 料液比1︰5), 糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度達到(53.4±0.3) g/L, 總還原糖得率98.9%; (3) 糖化液的單糖主要為葡萄糖, 質(zhì)量濃度為48.0 g/L; (4) 利用2 g/L糖化液培養(yǎng)小球藻SCSIO-559, 其生物量(0.93 g/L)顯著高于自養(yǎng)組及2 g/L葡萄糖組, 且有利于多不飽和脂肪酸的積累。綜上所述, 海帶渣糖化液對小球藻培養(yǎng)優(yōu)勢明顯, 具備作為微藻培養(yǎng)有機碳源的潛力。研究旨在為更好地對海帶渣資源化利用提供數(shù)據(jù)支撐, 為提高海帶渣高值化應用以及在微藻工業(yè)應用等方面提供理論依據(jù)。

海帶渣; 資源化利用; 預處理; 酶; 有機碳源

海帶是一種可食用的大型藻類, 其藻體含有豐富的褐藻膠、甘露醇、纖維素和礦物元素, 被廣泛應用在食品、化妝品、醫(yī)藥、飼料添加劑等領域(Islam, 2016; Ashayerizadeh, 2020)。我國是世界最大的海帶養(yǎng)殖國, 2019年我國海帶養(yǎng)殖量超過160萬t (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局, 2020), 除了食用外, 提取褐藻膠和甘露醇是海帶的另一項主要用途(周德慶等, 2006)。海帶提取褐藻酸鹽后產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)稱為海帶渣, 研究表明海帶渣中仍含有纖維素等大量可利用物質(zhì), 但目前海帶渣的利用率僅有30%, 大多直接以渣的形式用于肥料、飼料、吸附劑等的加工(盧茳虹等, 2012)。若對海帶渣進一步加工, 將其作為微生物生長的有機碳源, 通過微生物這一特殊媒介, 產(chǎn)生具有高附加值的物質(zhì), 將大幅提高海帶渣的利用價值(Larsen, 2017)。

目前最常見的生物質(zhì)預處理工藝包括蒸汽爆破、稀酸水解、稀堿水解等(杜兆林等, 2019)。王聞等(2016)對甘蔗渣進行蒸汽爆破處理后, 大部分半纖維素被去除; 高鳳芹等(2020)研究發(fā)現(xiàn), 稀硫酸預處理可有效降解雜交狼尾草木質(zhì)纖維素的半纖維素; Mota等(2021)研究表明稀堿預處理可去除木質(zhì)纖維中70%的木質(zhì)素。由于蒸汽爆破和稀堿水解會使木質(zhì)素發(fā)生重聚, 導致纖維素結(jié)構更加緊密(陳雪艷, 2020), 因此, 稀酸水解是生物質(zhì)預處理工藝中研究較多的一種。由于稀硫酸能與多數(shù)含木質(zhì)纖維的原料進行反應, 是常用的一種催化劑, 也有用稀硫酸對木質(zhì)纖維進行催化的報道(Chen, 2013)。此外, 對原料進行酸或堿浸漬后能有效地降解半纖維素或木質(zhì)素(Mancini, 2018), 提高酶水解效率。而微藻作為一種自養(yǎng)生物, 已形成規(guī)?；纳a(chǎn)及應用(于殿江等, 2021), 目前越來越多的研究表明, 小球藻、斜生柵藻等微藻可以通過外加碳源方式實現(xiàn)異養(yǎng)或兼養(yǎng)培養(yǎng), 從而獲得優(yōu)于自養(yǎng)模式的高生物量, 這有助于微藻產(chǎn)業(yè)化的成本控制與發(fā)展(Jin, 2020; Wang, 2021)。

本文以海帶渣為原料, 探討常溫常壓稀硫酸處理(以下簡稱稀硫酸浸泡)與高壓稀酸水解處理對海帶渣酶解的影響, 選出適用的預處理方法, 再通過優(yōu)化酶解反應條件, 提高糖化效率, 以期獲得較高還原糖質(zhì)量濃度的糖液, 并對糖化液進行單糖組成研究分析, 以海帶渣糖化液作為有機碳源對小球藻進行培養(yǎng), 用于考察其作為微藻培養(yǎng)中的碳源效果, 以期為后續(xù)海帶渣的資源化高值應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海帶渣 海帶渣購買于青島海興源生物科技有限公司。培養(yǎng)微藻為小球藻屬(sp.), 編號SCSIO-559, 由中國科學院南海海洋研究所海藻資源與生物技術實驗室分離并保藏。

1.1.2 主要試劑 纖維素酶(酶活225 IU/mL)購自諾維信(中國)生物技術有限公司; 半纖維素酶(150 U/g)購自上海源葉生物科技有限公司; 果膠酶(300 U/g)購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)方法 微藻培養(yǎng)容器三角瓶, 采用連續(xù)光照培養(yǎng), 培養(yǎng)體系為300 mL, 光照強度為(60±5) μmol photons/(m2·s)。

1.2 實驗設計

1.2.1 市售海帶渣的酶解處理 (1) 去離子水浸泡處理: 用去離子水對市售海帶渣浸泡后, 稱取0.2 g海帶渣, 使用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶及復合酶(纖維素酶/半纖維素酶、纖維素酶/果膠酶、半纖維素酶/果膠酶)各60 IU/g對其進行酶解處理, 酶解溫度50 °C, 酶解時間48 h, 離心取上清液, 利用苯酚硫酸法測定總還原糖質(zhì)量濃度。

(2) 稀硫酸浸泡預處理: 用4%稀硫酸溶液對市售海帶渣浸泡過夜后, 稱取0.2 g海帶渣, 使用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶及復合酶(纖維酶/半纖維素酶、纖維素酶/果膠酶、半纖維素酶/果膠酶)各60 IU/g對其進行酶解處理, 酶解溫度50 °C, 酶解時間48 h, 離心取上清液, 利用苯酚硫酸法測定總還原糖質(zhì)量濃度。

1.2.2 高壓稀酸水解海帶渣的酶解處理 稱取0.2 g海帶渣, 設置5種稀硫酸處理組(0%、0.3%、1.0%、1.7%和2.5%), 在121 °C、0.12 MPa條件下處理1、2、3和4 h, 冷卻后收集海帶渣, 隨后將渣洗滌成中性, 纖維素酶50 °C酶解48 h, 離心取上清, 利用苯酚硫酸法測定總還原糖質(zhì)量濃度。

1.2.3 酶解條件優(yōu)化 (1) 酶添加量: 每各處理組稱取0.2 g海帶渣(下同), 設置6種纖維素酶添加量 (0、20、30、40、50和60 IU/g), 50 °C酶解48 h, 料液比1︰10; (2) 酶解時間: 設置10種酶解時間(0、0.25、0.5、1、6、12、24、36、48和72 h)處理組, 酶添加量50 IU/g酶解, 酶解溫度50 °C, 料液比1︰10; (3) 料液比: 設置5種料液比處理組(1︰40、1︰20、1︰10、1︰5和1︰3.3), 酶添加量為50 IU/g, 酶解溫度50 °C, 酶解時間36 h。

1.2.4 海帶渣糖化液效能分析 以ASW培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基, 設置3個實驗組別, 分別為自養(yǎng)(CK)組, 葡萄糖兼養(yǎng)(glucose mixotrophs, GM)組和海帶渣糖化液兼養(yǎng)(kelp residue saccharification liquid mixotrophs, KSM)組, 實驗周期為10 d。

將藻種接入ASW培養(yǎng)基中進行擴種培養(yǎng), 待藻細胞生長至對數(shù)期(7 d左右), 離心收集藻細胞, 用ASW培養(yǎng)基反復沖洗2次, 然后重懸浮于裝有ASW培養(yǎng)基的三角瓶中, 其中GM組添加2 g/L葡萄糖, KSM組加入2 g/L的海帶渣糖化液, 初始接種OD750約為0.5, 培養(yǎng)至第10 d離心收集藻細胞, 測定細胞干重, 凍干后測定脂肪酸組成。

1.3 測定方法

1.3.1 海帶渣生化組成 水分的測定, 參照GB 76435—2014標準測定海帶渣中水分含量; 總脂的測定, 參照改良的Khozin-Goldberg法測定藻粉中總脂含量(Khozin-Goldberg, 2005); 灰分的測定, 取1.5 g海帶渣于已恒重的干鍋中, 先用電爐低溫加熱灼燒至無煙(完全碳化), 于馬弗爐中(650±20) °C灼燒約6 h, 使海帶渣完全灰化并至恒重; 蛋白質(zhì)的測定, 參照凱氏定氮法測定海帶渣中蛋白質(zhì)含量; 粗纖維的測定, 參照GB/T 5009.10—2003標準測定海帶渣中粗纖維含量; 可溶性多糖的測定, 0.5 mol/L硫酸80 °C攪拌抽提1 h, 重復3～4次, 合并提取液, 利用苯酚硫酸法測定還原糖含量(Dubois, 1956)。

1.3.2 總還原糖含量測定及總還原糖得率計算 參照Sluiter等(2008)兩步酸水解法測定海帶渣中總還原糖含量, 總還原糖得率計算公式:

總還原糖得率(%)=1/2×100%, (1)

其中,1為水解液或酶解液中總還原糖質(zhì)量,2為海帶渣總還原糖質(zhì)量。

1.3.3 單糖組成的測定 多糖樣品酸水解: 取樣品5 mg, 加入2 mol/L的三氟乙酸, 封管, 在120 °C消化儀中水解2 h, 冷卻后, 水解液50 °C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干, 加入約2 mL甲醇, 蒸干, 此操作重復3次, 最后蒸干待衍生化使用。

腈乙酸酯衍生物的制備: 向水解后的糖樣中加入10 mg鹽酸羥胺、5 mg肌醇和0.6 mL吡啶, 放入90 °C水浴鍋中攪拌及加熱反應30 min后, 待冷卻, 再加入1.0 mL乙酸酐, 繼續(xù)放入并攪拌90 °C水浴鍋中反應30 min后, 得糖腈乙酸酯衍生物。

氣相色譜條件: GC-2014C氣相色譜儀(Shimadzu, Kyoto, Japan), SH-Rtx-5毛細管柱(30 m×0.25 mm× 0.25 μm), 以高純氮氣為載氣, 檢測器為FID檢測器; 流速為1 mL/min, 進樣口和檢測器溫度分別為250和280 °C。

1.3.4 糖化液單糖組成的測定 液相色譜條件: Waters E2695高效液相色譜儀(Waters, Milford, USA), Shodex SH1011糖類色譜柱(300 mm × 8 mm × 6 μm), 以5 mmol/L硫酸溶液作為流動相; 檢測器為RI2414檢測器; 流速為0.5 mL/min, 柱溫及檢測器的溫度為50 °C (王聞等, 2016)。

1.3.5 細胞干重的測定 培養(yǎng)到第10 d后, 取藻液mL, 將其過濾到預先烘好的混合纖維濾膜(重量為1, g)上,將帶有藻細胞的濾膜置于80 °C烘箱24 h, 放置干燥器中冷卻至室溫后稱重(重量為2, g)。

細胞干重(g/L)=1000×(2–1)/. (2)

1.3.6 脂肪酸組成測定 稱取25 mg藻粉, 加入2 mL 2% H2SO4無水甲醇︰甲苯(體積分數(shù)90︰10), 同時加入25 μL 1%的C17︰0, 充氬氣后, 置于80 °C的水浴加熱攪拌1.5 h, 加入1 mL 純水和正己烷振蕩分層, 將上層有機相轉(zhuǎn)移到1.5 mL樣品瓶中, 用氮氣吹干, 再加入100 μL正己烷密封, 利用氣相色譜進行脂肪酸組成的測定。

氣相色譜測定條件為: GC-2014C氣相色譜儀(Shimadzu, Kyoto, Japan), DB-5毛細管柱(30 m × 0.25 mm),以高純氮氣為載氣; 檢測器為FID檢測器; 進樣口溫度260 °C, 程序升溫(60 °C保留2 min→30 °C/min 升溫至120 °C→1.5 °C/min升溫至250 °C保留2 min) (李濤等, 2018)。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

本文中試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0進行方差分析(ANOVA), 測定結(jié)果均以平均值±標準差(Mean±SD)表示, 用Origin 2018進行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售海帶渣的生化組成及初步酶解

利用去離子水和稀硫酸分別對市售海帶渣進行12 h浸泡處理, 并測定處理后海帶渣的重量及生化組成, 結(jié)果如圖1所示, 海帶渣的主要組成成分包括粗纖維、蛋白質(zhì)和灰分, 不同浸泡處理對海帶渣主要組成成分的相對含量產(chǎn)生較大影響, 經(jīng)過去離子水和稀硫酸浸泡處理后的海帶渣重量分別為(0.171±0.001) g和(0.144±0.000) g, 分別減少14.5%±0.1%和28.0%±0.0%。去離子浸泡后海帶渣的粗纖維、蛋白質(zhì)和灰分相對含量(干重)分別為33.9%、16.3%和34.3%, 稀硫酸浸泡后海帶渣的粗纖維、蛋白質(zhì)和灰分含量(干重)分別為42.1%、27.4%、12.1%, 由此可見, 稀硫酸浸泡后海帶渣的粗纖維和蛋白質(zhì)相對含量分別提高了24.2%和68.1%, 而灰分相對含量降低了64.7%。

圖1 海帶渣的生化組成

通過氣相色譜法分析海帶渣的單糖組成, 由圖2可知, 海帶渣主要含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和巖藻糖等4種單糖, 其中, 葡萄糖相對含量最高, 通過計算得到甘露糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖的摩爾比為1.00︰5.02︰1.10︰1.68。

圖2 海帶渣的單糖組成

注: 1: 巖藻糖; 2: 甘露糖; 3: 葡萄糖; 4: 半乳糖

選用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶及兩種酶的兩兩組合, 對去離子浸泡和稀硫酸浸泡后的海帶渣開展酶解實驗, 并測定糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度和計算總還原糖得率, 結(jié)果如表1所示, 不同浸泡方式明顯提高了海帶渣糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度和總還原糖得率。單種酶中纖維素酶糖化效果較好, 纖維素酶對去離子水浸泡后的海帶渣酶解, 海帶渣糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度和總還原糖得率分別為(2.7±0.2) g/L和8.1%±0.7%, 纖維素酶對稀硫酸浸泡后的海帶渣處理, 其糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度和總還原糖得率分別為(26.3±0.2) g/L和73.0%±0.6%。組合酶中纖維素酶/半纖維素酶能獲得較高質(zhì)量濃度的糖化液和總還原糖得率, 在去離子水浸泡方式中, 纖維素酶/半纖維素酶解海帶渣, 其糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度和總還原糖得率分別為(3.4±0.1) g/L和10.6%±0.2%, 而在稀硫酸浸泡方式中, 纖維素酶/半纖維素酶處理海帶渣, 其糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度和總還原糖得率分別為(27.2±2.4) g/L和75.6%±6.7%。由此可見, 稀硫酸浸泡方式中, 纖維素酶和纖維素酶/半纖維素酶對海帶渣糖化液的總還原糖質(zhì)量濃度分別提高8.9倍和6.9倍。

表1 去離子浸泡處理和稀硫酸浸泡處理海帶渣后的酶解情況

2.2 高壓稀酸預處理對海帶渣酶解效果的影響

設置5種稀硫酸處理組(0%、0.3%、1.0%、1.7%和2.5%), 在121 °C、0.11 MPa條件下, 對海帶渣進行1、2、3和4 h的高壓稀酸預處理, 了解高壓稀酸預處理對海帶渣后續(xù)酶解效果的影響, 結(jié)果如圖3所示, 所有處理組的還原糖得率及還原糖質(zhì)量濃度均低于“稀硫酸浸泡后直接酶解”的還原糖得率(73.0%)和還原糖質(zhì)量濃度(26.3 g/L), 這是因為高壓稀酸處理使小部分纖維素發(fā)生水解, 這部分還原糖溶于稀酸溶液中且濃度較低, 回收困難, 因此未將其統(tǒng)計在總還原糖得率和總還原糖質(zhì)量濃度中。預處理時間少于3 h時, 在相同濃度的稀硫酸條件下, 隨預處理時間的增加, 酶解的還原糖得率和還原糖質(zhì)量濃度逐漸增加(圖3a～3c), 當預處理時間為4 h時, 酶解效率與3 h時相比明顯降低(圖3d)。稀硫酸濃度也會影響海帶渣的酶解效果, 當稀硫酸濃度低于1%時, 隨稀硫酸濃度的提高, 酶解的還原糖得率逐漸增加, 當預處理時間3 h和稀硫酸濃度1.0%時, 還原糖得率和還原糖質(zhì)量濃度達到最大, 分別為66.4%和21.7 g/L。而當稀硫酸濃度超過1%后, 隨稀硫酸濃度的提高, 海帶渣酶解的還原糖得率和還原糖質(zhì)量濃度逐漸降低。

圖3 高壓稀酸水解對纖維素酶解海帶渣還原糖得率的影響

注: a: 1 h處理組; b: 2 h處理組; c: 3 h處理組; d: 4 h處理組

2.3 海帶渣的纖維素酶解條件優(yōu)化

由2.1和2.2可知, 高壓稀酸預處理并沒有顯著提高海帶渣的酶解效率, 考慮到高壓稀酸處理對設備要求高且能耗大, 綜合分析, 稀酸浸泡后直接進行纖維素酶解可能是一種可行的方案, 本文以稀酸浸泡后的海帶渣為原料, 通過優(yōu)化纖維素酶用量、酶解時間和料液比, 獲得較優(yōu)的纖維素酶解條件。

圖4a為纖維素酶用量的優(yōu)化結(jié)果, 總還原糖質(zhì)量濃度隨酶添加量增加而增加, 當纖維酶添加量為50 IU/g時, 總還原糖質(zhì)量濃度最高, 為(34.0±0.3) g/L, 總還原糖得率為89.7%。圖4b為酶解時間的優(yōu)化結(jié)果, 酶解時間為0～6 h時, 總還原糖質(zhì)量濃度快速增加, 酶解時間為12～48 h時, 總還原糖質(zhì)量濃度增加變緩, 當酶解時間為36 h時, 總還原糖質(zhì)量濃度達到最高, 為(34.2±0.3) g/L, 總還原糖得率為95.0%。圖4c為料液比的優(yōu)化結(jié)果, 總還原糖質(zhì)量濃度隨料液比增加而增加, 料液比1︰5時, 總還原糖質(zhì)量濃度達到最高, 為(53.4±0.3) g/L, 總還原糖得率為98.9%。

由上述結(jié)果初步確定了海帶渣的纖維素酶解條件, 纖維素酶用量為50 IU/g, 酶解時間為36 h, 料液比為1︰5。

2.4 海帶渣糖化液單糖組成分析

本文對海帶渣糖化前后的外觀和糖化液組成進行了分析。由圖5a和5b可見, 海帶渣糖化前的外觀顏色呈褐白色, 顆粒表面光滑、間隙較小, 略帶海帶腥味, 而糖化后的余料為褐色黏糊狀, 干燥后呈黑褐色。

圖4 不同條件對稀硫酸浸泡處理后的海帶渣酶解的影響

注: a: 纖維素酶用量; b: 酶解時間; c: 物料比例

利用液相色譜法, 對較優(yōu)纖維素酶解條件下(纖維素酶添加量為50 IU/g, 酶解時間為36 h, 料液比為1︰5)的糖化液進行單糖組成分析, 由圖5c可知, 糖化液中的單糖種類以葡萄糖為主, 還存在少量的纖維二糖, 通過計算得到糖化液中葡萄糖質(zhì)量濃度為48.0 g/L, 由于本實驗室的液相色譜儀并未建立甘露糖、半乳糖和巖藻糖進行定量測定方法, 因此海帶渣酶解產(chǎn)生的甘露糖、半乳糖和巖藻糖等三種還原糖未進行定量測定。

2.5 海帶渣糖化液培養(yǎng)微藻潛力分析

通過設置小球藻SCSIO-559自養(yǎng)(CK)、葡萄糖兼養(yǎng)(GM)、海帶渣糖化液兼養(yǎng)(KSM)三個組別, 對海帶渣糖化液培養(yǎng)小球藻SCSIO-559進行潛力分析, 不同培養(yǎng)方式下10 d后小球藻SCSIO-559的生物量存在明顯差異性, 其中海帶渣糖化液組生物量達到(0.93±0.03) g/L顯著高于自養(yǎng)組(0.29 g)與葡萄糖組(0.63 g/L) (<0.05) (表2)。

培養(yǎng)10 d后, 對不同培養(yǎng)組小球藻SCSIO-559的脂肪組成進行分析(圖6), 海帶渣糖化液組的C16︰0 (棕櫚酸)相較與其他兩組相對比例明顯降低, 而C18︰2 (亞油酸)、C18︰3 (亞麻酸)的相對比例相較自養(yǎng)組與葡萄糖組有所增加。同時, 對多不飽和脂肪酸的含量進行分析(圖7), 結(jié)果顯示海帶渣糖化液組的多不飽和脂肪酸含量明顯高于自養(yǎng)組, 并且與葡萄糖組的結(jié)果相差不大(>0.05)。

3 討論

碳源是微藻生長較關鍵的影響因素之一, 海帶渣經(jīng)酶解處理形成的糖化液能否應用于微藻培養(yǎng), 成為海帶渣資源化利用的一個重要評判標準。本文利用海帶渣糖化液作為有機碳源, 對已經(jīng)形成較大市場的小球藻進行培養(yǎng), 以評價海帶渣的資源化利用前景。

海帶渣購買于青島海興源生物科技有限公司, 經(jīng)分析其主要由粗纖維、灰分和蛋白質(zhì)組成, 其多糖組成葡萄糖、甘露糖、半乳糖和巖藻糖等4種單糖, 葡萄糖占比最高(圖1, 2), 這與董學前等(2018)和房景輝等(2021)的研究結(jié)果相一致。酶解糖化法是一種效率高、能耗低的纖維素原料處理方法, 常用的酶包括纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等(吳佐浩, 2014)。本文選用了纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶直接對市售海帶渣進行酶解處理, 獲得了較低的酶解效率(還原糖質(zhì)量濃度均小于5 g/L), 通過ICP-MS測定發(fā)現(xiàn), 海帶渣中鈣元素含量較高, 推測海帶渣中可能含有大量的水不溶性的碳酸鈣或硫酸鈣, 這些不溶物覆蓋在海帶纖維表面, 從而影響酶解效率, 直接對海帶渣進行酶解, 酶結(jié)合結(jié)構域是很難通過木質(zhì)纖維包裹與纖維素表面直接接觸, 從而降低酶解效率。預處理是一種常用的提高纖維素酶解效率的方法, 對木質(zhì)纖維進行酸預處理可以提高酶解效率, 獲得較高質(zhì)量濃度的糖液(Lee, 2013), 酸處理可以降解部分半纖維素, 促進酶與纖維素的結(jié)合(Alvira, 2010)。本文對海帶渣采用了稀硫酸浸泡處理后, 海帶渣中灰分含量在稀硫酸浸泡處理后大幅降低, 同時大幅提高纖維素酶的酶解效率; 此外, 也可能是稀酸使纖維素結(jié)構變疏松, 從而增加與纖維素酶的結(jié)合, 劉輝等(2020)利用3種試劑(稀硫酸、稀氫氧化鈉和雙氧水)對海帶渣進行預處理, 結(jié)果表明稀硫酸預處理后的酶解效率最高, 這與本文結(jié)果一致。

圖5 海帶渣糖化前后的外觀和糖化液的液相色譜圖

注: a: 海帶渣外觀; b: 糖化余料外觀; c: 糖化液的單糖組成(1: 纖維二糖; 2: 葡萄糖)

表2 不同培養(yǎng)方式下小球藻SCSIO-559的生物量

圖6 不同培養(yǎng)方式對小球藻SCSIO-559脂肪組分的影響

注: CK: 自養(yǎng)對照組; GM: 葡萄糖培養(yǎng)組; KSM: 海帶渣糖化液培養(yǎng)組

圖7 不同培養(yǎng)條件下10 d的多不飽和脂肪酸在總油脂與細胞干重中的比重

注: CK: 自養(yǎng)對照組; GM: 葡萄糖培養(yǎng)組; KSM: 海帶渣糖化液培養(yǎng)組; PUFAs: 多不飽和脂肪酸; TFA: 總脂肪酸; DW: 干重

高壓稀酸水解是早期預處理纖維原料的辦法之一, 主要是降解纖維原料中的半纖維素組成, 以提高酶解效率。本文對高壓稀酸水解后的海帶渣進行酶解, 發(fā)現(xiàn)糖化液中的還原糖質(zhì)量濃度和還原糖得率隨著稀硫酸濃度增加而減少, 這可能是高壓稀酸水解處理有助于半纖維素的降解, 但稀硫酸濃度過高時, 會加速半纖維素轉(zhuǎn)化成其他副產(chǎn)物, 如5-羥甲基糠醛或糠醛, 這些副產(chǎn)物會對酶解效率產(chǎn)生不利影響(Fonseca, 2011)。吳佐浩(2014)在120 °C、3 h條件下, 采用不同硫酸濃度(1%～6%)對海帶渣進行預處理, 結(jié)果顯示總還原糖質(zhì)量濃度隨著預處理酸濃度的升高呈先上升后下降的趨勢, 這與本文結(jié)果相似。此外, 高壓稀酸水解時間也會影響纖維素酶解效率, 本文中預處理時間為4 h時, 其酶解效率及還原糖質(zhì)量濃度與3 h時相比明顯降低(圖3d)。Liu等(2017)研究發(fā)現(xiàn), 稀酸水解過程中, 稀酸會對纖維素無定形區(qū)域進行侵蝕, 由此推測, 高壓稀酸水解處理時間越長, 對纖維素無定形區(qū)域侵蝕越厲害, 從而導致纖維素酶解轉(zhuǎn)化為糖的效率降低。

稀硫酸浸泡處理后的海帶渣酶解進行纖維素酶添加量、酶水解時間和料液比進行優(yōu)化, 結(jié)果顯示纖維素酶50 IU/g、酶解36 h, 料液比1︰5, 總還原糖收率可達98.9%, 該糖化工藝成本低、對環(huán)境友好。此外, 糖化液主要由葡萄糖和少量纖維二糖組成(圖5), 這與本文選用的酶種類有關, 纖維素酶是由外切、內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶等組成的復合酶, 有關纖維素酶降解纖維素機理研究表明最終水解產(chǎn)物為葡萄糖(Enari, 1987)。葡萄糖是微生物生長中最常用的碳源, Bouarab等(2004)在培養(yǎng)基中添加葡萄糖, 微芒藻生物量從0.38 g/L增加到0.94 g/L; Cheirsilp等(2012)研究表明, 添加葡萄糖使小球藻積累大量油脂。本文中的糖化液葡萄糖質(zhì)量濃度為48.0 g/L, 可在微藻培養(yǎng)基中添加海帶渣的糖化液, 從而促進微藻生長。

葡萄糖作為常用微藻的有機碳源, 被廣泛應用于小球藻、斜生柵藻等藻種的培養(yǎng), 取得了不錯的培養(yǎng)效果(Jin, 2020; Wang, 2021), 而在本研究中, 海帶渣糖化液培養(yǎng)小球藻SCSIO-559的生物量明顯高于自養(yǎng)組與葡萄糖組(表2), 說明廢渣糖化液作為小球藻培養(yǎng)碳源具有可行性。微藻高值化油脂(含多不飽和脂肪酸)是微藻領域重要的發(fā)展方向之一, 本文利用海帶渣糖化液培養(yǎng)小球藻, 小球藻SCSIO-559的多不飽和脂肪酸含量明顯高于自養(yǎng)組與葡萄糖組(圖7), 說明海帶渣糖化液不僅可以作為小球藻生長的有機碳源, 還可以提高小球藻的營養(yǎng)價值。海帶渣糖化液具有比單純葡萄糖更好的培養(yǎng)效果, 原因可能是: 海帶渣糖化液除了含有葡萄糖之外, 還可能存在一些金屬離子、微量元素和小分子有機物, 這些物質(zhì)有可能促進小球藻的生長。本研究中獲得的海帶渣糖化液在成本上仍然較高, 后續(xù)我們將在成本降低方面開展更多的工作, 并嘗試優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮、磷等主要元素的比例, 進一步提高小球藻的生物量和多不飽和脂肪酸含量。

4 結(jié)論

(1) 海帶渣的生化組成中粗纖維與蛋白質(zhì)含量豐富, 具備資源化利用的前景。

(2) 實驗結(jié)果表明常溫常壓稀硫酸預處理耦合纖維素酶分解是一種高效的海帶渣糖化方法。初步得到了海帶渣糖化工藝條件, 纖維素酶用量為50 IU/g, 酶解時間為36 h, 料液比為1︰5。

(3) 海帶渣糖化效率高(總還原糖得率98.9%)、糖化液的單糖組成均一(液相色譜檢測結(jié)果), 利用海帶渣糖化液培養(yǎng)小球藻SCSIO-559生物量(0.93 g/L)顯著優(yōu)于自養(yǎng)與葡萄糖兼養(yǎng), 且對于小球藻SCSIO-559多不飽和脂肪酸積累效果明顯, 具備作為微藻工業(yè)化生產(chǎn)兼養(yǎng)(或異養(yǎng))碳源的潛力。

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RESOURCE UTILIZATION OF KELP RESIDUE AND APPLICATION INCULTURE

WANG Ming1, 2, PENG Min-Lin1, 3, XU Jin4, LIANG Cui-Yi4, XIANG Wen-Zhou2, 3, LI Tao2, 3

(1. School of Eco-Environmental Engineering, Guizhou Minzu University, Guiyang 550025, China; 2. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 3. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China; 4. Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences, CAS Key Laboratory of Renewable Energy, Guangdong Provincial Key Laboratory of New and Renewable Energy Research and Development, Guangzhou 510640, China)

Kelp residue is a type of solid waste from kelp processing. It is of great significance to utilize it to produce high value-added products. Therefore, kelp residue and was used as raw material and saccharified. The total reducing sugar concentration, monosaccharide composition, andcultivation effect of the saccharification liquid were used as the main indexes to evaluate the effects of different pretreatment methods on enzymatic hydrolysis of kelp residue, and the feasibility of kelp residue resource utilization and cultivation of microalgae. The results show that: (1) crude fiber and ash are the main components of kelp residue. (2) After pretreatment with dilute sulfuric acid at room temperature and atmospheric pressure, the total reducing sugar concentration of saccharification solution was increased from 2.7 to 26.3 g/L. Under the optimal saccharification conditions (cellulase dosage 50 IU/g, enzymolysis time 36 h, solid-liquid ratio 1:5), the total reducing sugar concentration of saccharification solution reached (53.4±0.3) g/L, the yield of total reducing sugar was 98.9%. (3) The monosaccharide of saccharification solution included mainly glucose, and its mass concentration was 48.0 g/L. (4) The biomass (0.93 g/L) ofsp. scsio-559 cultured in 2 g/L saccharification solution was significantly higher than that of autotrophic group and 2 g/L glucose group, which is conducive to the accumulation of polyunsaturated fatty acids. Therefore, the saccharified liquid of kelp residue has obvious advantages forcultivation, and is potential to be used as an organic carbon source for microalgae cultivation. This study provided a data support for better resource utilization of kelp residue, and a theoretical basis for improving high value application of kelp residue while reducing production cost and environmental pollution in the microalgae industry.

kelp residue; resource utilization; pretreatment; enzyme; organic carbon source

X798

10.11693/hyhz20210700156

*廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應用開放基金, E039kf0301號; 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州)人才團隊引進重大專項, GML2019ZD0406號; 貴州省教育廳青年科技人才成長項目, 黔教合KY字[2016] 160號; 廣東省自然科學基金研究團隊項目, 2016A030312007號。王 銘, 副教授, E-mail: firefoxming@gzmu.edu.cn

李 濤, 碩士生導師, 副研究員, E-mail: taoli@scsio.ac.cn

2021-07-07,

2021-09-14