潘亞芳， 郭 瑋,2*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，廈門 361015

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的肝癌類型，是全球第二大癌癥死亡原因[1]。當(dāng)前的HCC治療方法包括手術(shù)切除、局部消融、化學(xué)栓塞、肝移植和分子靶向治療[2]。只有少數(shù)肝癌患者在早期被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者則是在中晚期被診斷，而此時他們已失去手術(shù)治療的機會，這也是HCC患者死亡率高的重要原因。對于這些患者，他們迫切需要更有效的治療途徑。在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性是癌癥治療的主要方法之一，但大多數(shù)研究都集中在細(xì)胞凋亡領(lǐng)域[3]。由于抗凋亡機制常使癌細(xì)胞對抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性，因此誘導(dǎo)新形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(如鐵死亡)，對于開發(fā)新的治療實體腫瘤的方法具有很大的價值。

1 鐵死亡簡介

鐵死亡是在2012年被發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(regulatory cell death，RCD)[4]。在線粒體涉及鐵的氧化磷酸化過程中，細(xì)胞會產(chǎn)生活性氧類(ROS)，超過細(xì)胞抗氧化能力的ROS水平會導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而直接或間接破壞蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[5]，即鐵死亡。

鐵死亡的主要過程：(1)細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸(PL-PUFA-OH)可被脂氧合酶和ROS氧化，形成脂質(zhì)過氧化物(PL-PUFA-OOH)；(2)在鐵離子存在下，PL-PUFA-OOH會轉(zhuǎn)化為有毒的脂質(zhì)自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸分解；(3)細(xì)胞最終會由于細(xì)胞膜破裂而死亡。不同于細(xì)胞凋亡和壞死，其形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞體積收縮、線粒體膜密度增加、嵴甚至消失，而沒有典型的凋亡、壞死和自噬表現(xiàn)[6](表1)。已發(fā)現(xiàn)鐵死亡存在于許多生理和病理疾病中，如神經(jīng)退行性疾病[7]、缺血再灌注損傷[8]和一系列癌癥[9-11]。鐵死亡在肝癌的發(fā)生中起著重要作用[12]。鐵死亡可通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽(glutathione，GSH)[13]、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物[14]及其他相關(guān)物質(zhì)的水平影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。鐵死亡可作為肝癌的診斷、預(yù)防和治療的靶標(biāo)，已成為肝癌治療的研究熱點。

表1 調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡類型及其相關(guān)特征

2 參與肝癌鐵死亡的調(diào)控因子

最近在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了幾種鐵死亡的調(diào)控因子。例如，谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4 ，GPX4)是哺乳動物中硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶的一個獨特成員，在抑制鐵死亡過程中，脂質(zhì)活性氧的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用[15]。熱休克蛋白β-1(heat shock protein beta-1，HSPB1)，分子伴侶的成員，可調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的動力學(xué)并減少鐵的吸收，從而促進(jìn)鐵死亡[16]。p53則被發(fā)現(xiàn)，通過抑制SLC7A11的表達(dá)而成為鐵死亡的正向調(diào)節(jié)因子[17]。已知肝癌的發(fā)生和發(fā)展受多種細(xì)胞組分和細(xì)胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)，而有關(guān)鐵死亡在肝癌中的詳細(xì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子尚在研究當(dāng)中。鐵死亡在癌癥尤其是肝癌的治療中已展現(xiàn)出巨大的前景。

2.1 P62-Keap1-NRF2通路的激活抑制肝癌細(xì)胞中鐵死亡的發(fā)生 核因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor，NRF2)是抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在不受壓力的條件下，低水平的NRF2主要是由Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)介導(dǎo)的蛋白酶體降解來維持平衡。受癌癥的類型和階段影響，NRF2在癌癥的預(yù)防或治療中起著雙重作用。例如，NRF2會阻止化學(xué)致癌物或癌基因介導(dǎo)的致癌過程的發(fā)生；但若已經(jīng)癌變，NRF2反而會加速癌變進(jìn)展。NRF2的過度表達(dá)會抑制細(xì)胞凋亡，并在幾種癌癥中促進(jìn)化學(xué)耐藥性。研究[18]證明，p62-Keap1-NRF2通路通過上調(diào)參與鐵和ROS代謝的多個基因[醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素氧合酶1(HO1)和鐵蛋白重鏈1(FTH1)]，在保護(hù)肝癌細(xì)胞免受鐵死亡中起著中心作用。

當(dāng)暴露于誘導(dǎo)鐵死亡的化合物(如erastin、索拉非尼和丁硫氨酸亞砜亞胺)中時，p62的表達(dá)阻止NRF2降解，增強隨后的NRF2核積累。此外，核NRF2與轉(zhuǎn)錄輔激活因子小v-maf禽肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源蛋白(maf)相互作用，然后激活NQO1、HO1和FTH1的轉(zhuǎn)錄。因為NQO1、HO1和FTH1的敲除抑制了鐵死亡誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的生長，這些NRF2的靶基因是鐵死亡的負(fù)調(diào)控基因。敲減肝癌細(xì)胞中p62、NQO1、HO1和FTH1，促進(jìn)了erastin和索拉菲尼誘導(dǎo)的鐵死亡。同時基因或藥物對肝癌細(xì)胞NRF2表達(dá)/活性的抑制增強了體外和異種移植瘤模型中erastin和索拉菲尼的抗癌活性。這些均證實NRF2的狀態(tài)是決定肝癌細(xì)胞對鐵死亡靶向治療反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。P62-Keap1-NRF2通路在鐵死亡中的功能特征可能為肝癌的治療提供新的思路。

2.2 Sigma-1受體(Sigma-1 receptor，S1R)對HCC細(xì)胞鐵死亡的保護(hù)作用 S1R是非阿片類受體蛋白。除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，S1R還存在于肝、胰腺和癌細(xì)胞中[19]。最近的研究報道顯示，S1R可能通過激活抗氧化反應(yīng)元件并減少氧化的GSH和谷氨酸來抑制許多器官中ROS的產(chǎn)生。先前的研究表明，S1R通過調(diào)節(jié)NRF2-Keap1途徑和半胱氨酸/谷氨酸反向交換Xc-系統(tǒng)來調(diào)節(jié)ROS，這兩者均對鐵死亡至關(guān)重要。研究[20]證實，抑制S1R會調(diào)節(jié)GPX4、鐵代謝和ROS積累，可顯著阻斷erastin和索拉菲尼誘導(dǎo)的FTH1和TFR1的增加，表明S1R負(fù)性調(diào)節(jié)鐵代謝來阻止ROS的積累，且發(fā)現(xiàn)S1R的抑制增強了索拉非尼在體外和體內(nèi)對HCC細(xì)胞的抗癌作用。除了引起活性氧的積累，肝臟中的鐵超載也是一種調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的致癌因子。因此，鐵也可能在肝癌發(fā)生和癌細(xì)胞死亡中扮演雙重角色。

2.3 MicroRNA-214-3p靶向肝癌細(xì)胞中的ATF4增強erastin誘導(dǎo)的鐵死亡 MicroRNA長18～24個核苷酸且為內(nèi)源性非編碼RNA分子，通過使信使RNA(mRNA)不穩(wěn)定和/或抑制翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[21]。MiR-214靶向多種基因(包括Catenin β1、肝癌衍生生長因子和Twist)在人類肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。ATF4是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要因素，且被證明是鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子，因此，ATF4的敲除可能使癌細(xì)胞易受鐵死亡的影響。miR-214-3p是ATF4的上游調(diào)節(jié)因素[22]。有研究人員[23]在2種肝癌細(xì)胞系中研究了miR-214對鐵死亡的作用。在體外，他們用erastin(鐵死亡誘導(dǎo)劑)處理穩(wěn)定過表達(dá)miR-214可的HepG2和Hep3B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-214增強erastin誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞脂質(zhì)氧化作用，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生且抑制ATF4的表達(dá)；在體內(nèi)，他們對患有Hep3B異種移植腫瘤的裸鼠給予erastin，發(fā)現(xiàn)miR-214降低了腫瘤的生長，并降低了用erastin處理的裸鼠體內(nèi)ATF4的表達(dá)。他們證實miR-214在肝癌細(xì)胞中促進(jìn)鐵死亡的作用至少歸因于其對ATF4的抑制作用。

2.4 LncRNA-GABPB1-AS1和GABPB1在erastin誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞鐵死亡過程中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激 很少有研究探討長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在細(xì)胞氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中的作用，特別是在鐵死亡中。鐵死亡對鐵的依賴性提示過氧化物酶失活可能是鐵死亡的一個重要事件。過氧化物酶在鐵離子存在下可阻止過氧化氫產(chǎn)生羥基自由基，進(jìn)而阻止ROS的積累。已知NRF2具有3個亞基(α、β和γ)，而GABPB1是NRF2的激活亞基。GABPB1與α亞基形成四聚體復(fù)合物，并刺激包括抗氧化劑基因過氧化物酶-5(PRDX5)在內(nèi)的各種基因的轉(zhuǎn)錄。LncRNA GABPB1-AS1 是GABPB1 mRNA的反義RNA。研究[24]證明，erastin上調(diào)了lncRNA GABPB1-AS1，后者通過阻斷GABPB1翻譯下調(diào)了GABPB1蛋白水平，導(dǎo)致PRDX5基因下調(diào)，并最終抑制了細(xì)胞抗氧化能力，導(dǎo)致ROS和MDA的積累及HepG2細(xì)胞死亡。研究還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)水平的GABPB1與HCC患者的預(yù)后不良相關(guān)，而肝癌患者中高水平的GABPB1-AS1與總體生存期提高相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了GABPB1-AS1可能是erastin誘導(dǎo)HCC細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵分子，豐富了對lncRNA調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的認(rèn)識。

3 鐵死亡參與肝癌的治療

在晚期肝癌患者中，手術(shù)和非手術(shù)治療均未獲得令人滿意的結(jié)果。幾種靶向藥物中只有索拉非尼和雷戈非尼被證明可以成功延長HCC患者的生存期[25-26]。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，是提高HCC生存率的首個全身療法用藥，口服索拉非尼已成為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的用于不可切除HCC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[27]。它能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成并可促進(jìn)多種腫瘤的細(xì)胞凋亡[28]。最近，有研究[29]稱，索拉非尼可能會阻斷Xc傳輸系統(tǒng)，從而抑制GSH的合成，其作用機制與erastin類似。隨后，其他科研團(tuán)隊[30]也證實索拉非尼可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的鐵死亡。

3.1 通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)HCC細(xì)胞鐵死亡

3.1.1 索拉非尼誘導(dǎo)HCC細(xì)胞鐵死亡 目前對索拉非尼針對HCC細(xì)胞的毒性作用機制已有初步認(rèn)識。最初的報道[31]是索拉非尼可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的凋亡。然而，之后發(fā)現(xiàn)索拉非尼單藥應(yīng)用于HCC細(xì)胞不能誘導(dǎo)與凋亡相關(guān)的主要線粒體事件，例如細(xì)胞色素C的胞質(zhì)釋放或胱天蛋白酶的活化[32]。此外，索拉非尼只有與化合物ABT-737結(jié)合才能成為一種有效的凋亡誘導(dǎo)劑。Louandre等[33]研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼對HCC細(xì)胞的毒性作用可被鐵的有效化學(xué)螯合劑去鐵胺(DFX)阻止。因此，索拉非尼作為單一藥物應(yīng)用于HCC細(xì)胞能夠誘導(dǎo)不同于凋亡的細(xì)胞死亡。與此同時，DFX賦予的保護(hù)取決于其耗盡HCC細(xì)胞內(nèi)鐵存儲的能力。結(jié)果表明，索拉非尼應(yīng)用于HCC細(xì)胞可以誘導(dǎo)某種形式的細(xì)胞死亡，該死亡與鐵死亡密切相關(guān)?？偠灾l(fā)鐵死亡可能是提高索拉非尼在肝癌中療效的一種可行策略。

3.1.2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白調(diào)節(jié)索拉非尼在HCC細(xì)胞中引起的鐵死亡 Rb蛋白可調(diào)節(jié)真核生物中一些基因的轉(zhuǎn)錄[34]，且Rb蛋白以其在細(xì)胞增殖中的調(diào)節(jié)作用和在G1/S檢查點的關(guān)鍵作用而聞名，主要是其調(diào)節(jié)E2F家族轉(zhuǎn)錄因子活性的能力。已知Rb蛋白功能的喪失是肝癌發(fā)生過程中的一個重要事件，且針對Rb蛋白狀態(tài)是否為肝癌細(xì)胞對索拉非尼反應(yīng)調(diào)節(jié)因素尚在研究中。重要的是，研究[30]表明，Rb蛋白的狀態(tài)是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞對鐵死亡易感性的一個參數(shù)。低表達(dá)Rb的HCC細(xì)胞暴露于索拉非尼后，細(xì)胞死亡數(shù)增加2～3倍。索拉非尼治療的BALB/c裸鼠在接種低表達(dá)Rb的HCC細(xì)胞后所生長的異種移植腫瘤，與接種對照細(xì)胞的小鼠腫瘤穩(wěn)定相比，在接受治療的動物中有50%的腫瘤完全消退。說明暴露于索拉非尼后，肝細(xì)胞癌的Rb蛋白陰性狀態(tài)會促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。該發(fā)現(xiàn)突顯了Rb蛋白在HCC細(xì)胞中對于索拉非尼的應(yīng)答和鐵死亡調(diào)節(jié)的作用。

3.1.3 磷酸調(diào)節(jié)信號參與索拉非尼治療HCC細(xì)胞誘導(dǎo)的鐵死亡 索拉非尼如何參與誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡，一直是學(xué)者們的探索方向。Raf-Mek-Erk信號通路并不是索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡的重要靶點，索拉非尼有一種獨特的作用方式來誘導(dǎo)鐵死亡[33]。由于已經(jīng)提出索拉非尼與其他類似的激酶抑制劑相比具有抑制Xc-系統(tǒng)的額外活性[35]，因此更好地理解索拉非尼調(diào)節(jié)Xc-系統(tǒng)活性的磷酸化變化將有助于解釋索拉非尼等激酶抑制劑是如何誘導(dǎo)鐵死亡的。Werth等[36]的研究概述了索拉非尼治療對SKHep1細(xì)胞的早期作用：在藥物治療30 min內(nèi)對蛋白質(zhì)磷酸化有廣泛的調(diào)節(jié)作用，而在60 min的處理后作用會更加劇烈。這項研究包括對6 170個獨特磷酸位點的定量覆蓋，采用無標(biāo)記定量(LFQ)磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)來探測磷酸化隨時間的變化。這包括Xc-的潛在結(jié)合位點上的磷酸位點，還包括已知與鐵死亡相關(guān)的蛋白質(zhì)上的磷酸位點。根據(jù)他們的發(fā)現(xiàn)，在索拉非尼治療后，鐵穩(wěn)態(tài)蛋白和其他與鐵死亡有關(guān)的蛋白上的許多位點都受到顯著的調(diào)節(jié)。這些均指出，在鐵死亡的誘導(dǎo)過程中可能涉及了磷酸化調(diào)節(jié)信號。

3.2 外源性途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡

3.2.1 雙GSH耗盡型索拉非尼負(fù)載錳硅納米藥物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡 GSH具有抗氧化和解毒能力，其水平與腫瘤進(jìn)展和化療耐藥密切相關(guān)，而HCC細(xì)胞中GSH水平升高。因此，研究人員認(rèn)為GSH耗竭策略將是治療HCC的理想方法之一。Tang等[37]介紹了一種新型一鍋反應(yīng)，用于合成錳摻雜的介孔二氧化硅納米粒子(錳-二氧化硅納米粒子，MMSNs)，該反應(yīng)可通過MMSNs降解引起細(xì)胞內(nèi)GSH消耗來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的鐵死亡。MMSN的錳氧化鍵會在高GSH濃度下斷裂，從而迅速在環(huán)境中消耗GSH。1分子-Mn-O-的裂解將消耗2分子的GSH。因此，由MMSN的降解引起的GSH消耗效率足夠耗盡細(xì)胞內(nèi)的GSH。同時，MMSNs的降解會導(dǎo)致負(fù)載的索拉非尼釋放，從而阻斷Xc-傳輸系統(tǒng)，在用MMSNs @ SO(MMSNs負(fù)載索拉非尼)孵育后，HCC細(xì)胞中的GSH含量迅速降低，并且抑制了GSH的合成。重要的是，MMSNs @ SO對正常肝細(xì)胞(LO2細(xì)胞)的毒性要比HCC細(xì)胞低得多。他們旨在通過構(gòu)建MMSNs @ SO來雙向耗盡細(xì)胞內(nèi)GSH而發(fā)揮優(yōu)異的促鐵死亡作用。結(jié)果顯示，這種雙重消耗GSH的納米藥物具有誘導(dǎo)HCC細(xì)胞鐵死亡的巨大潛力，將有助于開發(fā)針對HCC的高效鐵死亡誘導(dǎo)劑。

但是，細(xì)胞可以適應(yīng)不斷變化的微環(huán)境。當(dāng)GSH被消耗時，GSH的合成將加速，連續(xù)的鐵死亡將被抑制[38]。因此，如何抑制肝癌細(xì)胞GSH的合成，是腫瘤治療中誘導(dǎo)鐵死亡的另一個關(guān)鍵點。

3.2.2 低密度脂蛋白二十二碳六烯酸納米粒誘導(dǎo)鐵死亡 Sawada等[39]的流行病學(xué)研究報告稱，富含多不飽和ω-3脂肪酸(ω-3PUFA)的飲食可降低肝炎患者發(fā)生HCC的風(fēng)險。為此，研究人員[14]設(shè)計了一種用天然ω-3PUFA二十二碳六烯酸重構(gòu)的低密度脂蛋白納米粒子(LDL-DHA)。LDL-DHA通過鐵死亡途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡，這是其抗癌活性的一種新的分子機制。LDL-DHA納米顆粒對大鼠肝癌和人HCC細(xì)胞系均具有細(xì)胞毒性。LDL-DHA處理后，大鼠和人類HCC細(xì)胞在細(xì)胞死亡之前均經(jīng)歷明顯的脂質(zhì)過氧化，GSH枯竭和脂質(zhì)抗氧化劑GPX4 失活。治療后的肝癌細(xì)胞死亡與凋亡、壞死或自噬途徑無關(guān)，與鐵依賴性細(xì)胞死亡機制一致，GPX4也是LDL-DHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的中樞調(diào)節(jié)因子。他們進(jìn)一步研究了LDL-DHA對承載人肝癌移植瘤小鼠的影響。瘤內(nèi)長期注射LDL-DHA會嚴(yán)重抑制HCC異種移植物的生長。與體外研究結(jié)果一致，LDL-DHA治療的HCC腫瘤經(jīng)歷了鐵依賴性細(xì)胞死亡，其特征是組織脂質(zhì)氫過氧化物水平升高和GPX4表達(dá)抑制。

LDL-DHA誘導(dǎo)的鐵死亡可實現(xiàn)有效的抗腫瘤效果，因為長期的腫瘤生長抑制作用在停止治療后仍可得到很好的維持。這些發(fā)現(xiàn)為LDL-DHA控制腫瘤細(xì)胞毒性的分子機制提供了新見解。

綜上所述，鐵死亡在HCC中起著至關(guān)重要的作用，鐵死亡是誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的有效機制。同時，關(guān)于肝癌中鐵死亡的詳細(xì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍在進(jìn)一步探索中，而針對索拉非尼耐藥性、肝癌轉(zhuǎn)移和能量代謝等，都是將來探索的方向。鐵死亡可能成為肝癌藥物治療的靶標(biāo)，為索拉非尼在腫瘤中的優(yōu)化應(yīng)用開辟新的途徑。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。